淡黃花百合珠芽誘導脫分化的研究

張翔宇+陳杰+吉云+嚴顯進+王彩云+阮培均+王永

摘要：以淡黃花百合珠芽為試驗材料，采用完全試驗設計方法，研究不同濃度的6-BA、NAA組合對淡黃花百合珠芽愈傷組織誘導的影響。結果表明：淡黃花百合珠芽誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/LNAA+1.0 mg/L6-BA，其誘導萌發(fā)時間為11 d，萌發(fā)率為100%，愈傷組織月平均直徑增長量3 cm以上。

關鍵詞：淡黃花百合；珠芽；脫分化

中圖分類號： S567.23+9.043 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0058-03

淡黃花百合（Lilium sulphureum.Baker）為百合科百合屬多年生草本植物，集藥食兩用及觀賞于一身[1]。其花、梗、鱗莖均可入藥，花和梗可用作止血藥，鱗莖可預防和治療肺結核、慢性氣管炎、咳嗽、肺氣腫、肺嗽咯血、體虛腫弱、瘡癰腫瘤等癥，若服食清蒸百合，還可治胃病、肝病、貧血等，是多種滋補藥的主藥[2]。百合的傳統繁殖方式主要有珠芽繁殖、子球繁殖、鱗片繁殖3種[3]。采用現代組織培養(yǎng)方式進行百合種苗擴繁，因其繁殖系數高而成為重要的繁殖方式之一，通過組織培養(yǎng)可快速得到大量百合種苗，是百合產業(yè)發(fā)展的一大趨勢。而要使百合組織培養(yǎng)與生產銜接，關鍵是要針對不同品種制定與之相匹配的組培快繁方案[4]。組織培養(yǎng)方法可促進百合商品種球的生產和百合新品種的培育[5]。

目前對百合誘導脫分化的報道較多。劉芬等用花絲誘導蘭州百合愈傷組織時發(fā)現，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA是誘導蘭州百合花絲愈傷組織形成的理想培養(yǎng)基[6]；申玉華等以西伯利亞百合花托為外植體進行組織培養(yǎng)發(fā)現，MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA是誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基[7]；李黛等以淡黃花百合鱗莖為外植體進行誘導，發(fā)現其誘導愈傷組織增殖的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L NAA+3%蔗糖[8]；郭海濱等以卷丹百合鱗片及珠芽為外植體進行研究認為，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA誘導不定芽和愈傷組織數量較多，生長勢強，愈傷組織顆粒出現時間為20 d[9]。以上研究表明，對百合愈傷組織誘導大部分以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度的6-BA和NAA，但不同種類百合愈傷組織誘導所用的6-BA與NAA的比例有較大差異。同時，沒有針對愈傷組織不同時期的增長量及生長情況的研究報道。由于愈傷組織不同時期的增長量及生長情況對于后期大規(guī)模誘導再分化出不定芽直至生產組培苗具有至關重要的影響。因此，本研究以淡黃花百合珠芽為外植體，研究不同濃度的6-BA和NAA組合對其愈傷組織誘導和愈傷組織直徑月平均生長量的影響，以期為淡黃花百合大規(guī)模組培育苗提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 外植體 野生淡黃花百合珠芽采自貴州省畢節(jié)市大方縣羊場鎮(zhèn)2年生淡黃花百合植株。

1.1.2 培養(yǎng)基 以MS為基本培養(yǎng)基，其中每個配方添加25 g/L 蔗糖，pH值為5.8～6.0，瓊脂添加量6.5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌 將采集的淡黃花百合珠芽帶回實驗室，用自來水沖洗3 h，用鑷子將外層小鱗片剝下，放入燒杯中，加入1～2滴吐溫20，用玻棒攪拌2～3 min，放置30 min，將水倒掉，用紗布將外植體包好，用自來水沖洗1～2 h后，于超凈工作臺上用75%乙醇浸泡30 s左右，用無菌水沖洗3～4次，然后用0.1%氯化汞消毒8 min，無菌水沖洗6次以上，最后將滅菌后的外植體放入事先準備好的無菌不銹鋼盤中，用濾紙吸干表面水分，即可得到接種用外植體。

1.2.2 外植體接種 用鑷子將準備好的無菌外植體接種于不同植物生長調節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上（表1），每組接種5瓶，每瓶接種5個，每組3個重復。

1.2.3 培養(yǎng) 接種后放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：白天（25±3）℃，晚上（20±3）℃，濕度（85±5）%，光照度為1 000～1 200 lx，光照時間12 h /d。

1.2.4 試驗設計 采用2因素5水平完全設計方案（表1）。

1.3 項目測定

誘導時間t：外植體開始萌動時的時間。

1.4 數據處理

所得數據均采用 IBM SPSS Statistics 20軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度6-BA與NAA組合對愈傷組織誘導時間的影響

不同濃度的6-BA與NAA組合對愈傷組織誘導時間的影響較大。通過對表2中誘導時間的直觀分析表明，處理7、處理9、處理10均可在10 d誘導珠芽愈傷組織萌動，而其他處理的誘導時間相對延遲，其中處理22、處理23、處理25均需要17 d才可以誘導愈傷組織萌動。由表3中誘導時間的Ⅲ型平方和可以看出，NAA的Ⅲ型平方和為334.080，大于6-BA 的7.680，這表明對淡黃花百合珠芽愈傷組織萌發(fā)時間的影響中，NAA起主要作用，6-BA起次要作用。從表2可看出，不同濃度NAA和6-BA對萌發(fā)時間的影響不同，低濃度的NAA誘導萌發(fā)的時間較短，高濃度NAA誘導萌發(fā)的時間較長，0.3 mg/L NAA與1.0 mg/L 6-BA組合能夠最快誘導產生愈傷組織。

2.2 不同濃度6-BA與NAA組合對愈傷組織誘導率的影響

不同濃度的6-BA與NAA組合對愈傷組織誘導率具有顯著性差異。從表2可以看出，處理15、處理20、處理21、處理25的誘導率較差，誘導率不到50%；而處理7、處理16、處理17的誘導率較好，均超過90%，其中處理7的誘導率可達100%。由表3中誘導率的Ⅲ型平方和可以看出，NAA的Ⅲ型平方和為7 055.290，小于6-BA的9 888.965，這表明對淡黃花百合珠芽愈傷組織誘導率的影響中，6-BA起主要作用， NAA起次要作用。0.3 mg/LNAA與1.0 mg/L 6-BA組合對珠芽愈傷組織的誘導率最高，可達100%。

2.3 不同濃度6-BA與NAA組合對愈傷組織月平均增長量的影響

不同濃度的6-BA與NAA組合對愈傷組織月平均增長量的影響具有顯著性差異。由表2可以看出，在第1個月，處理25的增長量最小，只有（0.92±0.01）cm，而處理7的增長量最大，可達（3.07±0.01）cm；在第2個月，處理25的增長量仍然最小，只有（1.06±0.06）cm，而處理7的增長量仍然最大，為（3.19±0.01）cm；在第3個月，處理21的增長量最小，為（1.03±0.01）cm，而處理7的增長量仍然最大，為（3.25±0.01）cm。不管是第1個月、第2個月還是第3個月，0.3 mg/L NAA與1.0 mg/L 6-BA組合的月平均直徑增長量均最大，其增長量均達3 cm以上。從表3中愈傷組織月平均增長量的Ⅲ型平方和可以看出，6-BA的影響均大于NAA，說明對于淡黃花百合珠芽愈傷組織的生長，6-BA起主要作用。從表4中愈傷組織生長情況來看，30 d時，愈傷組織顏色均為黃綠色，隨著培養(yǎng)時間的增加，誘導率高于70%的組合顏色能夠保持較好的生長色，愈傷組織比較疏松，利于增殖和分化（圖1-A）。而誘導率低于70%的組合顏色不能保持好的生長色，逐漸開始褐化，愈傷組織的生長狀態(tài)開始變得緊密，不利于增殖和分化（圖1-B）。結合表2和表4可以看出，雖然誘導率高于70%的組合顏色能夠保持再好的生長色，但隨著培養(yǎng)時間的增加，愈傷組織的月增長量出現規(guī)律性，即前60 d呈現生長加快的趨勢，60 d之后生長開始變緩。

3 結論與討論

本試驗采用珠芽為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，采用2因素5水平完全試驗設計方案考察不同濃度NAA和6-BA組合對淡黃花百合珠芽誘導愈傷組織的影響。結果表明，MS+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA為淡黃花百合珠芽誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不管是在誘導率、誘導時間，還是誘導愈傷組織月增長量方面均達到了最佳。研究還發(fā)現，低濃度的NAA誘導時間較快，高濃度NAA誘導時間較慢，NAA在誘導時間方面起主要作用，但在愈傷組織誘導率及愈傷組織的生長過程中6-BA卻起主要作用，這種現象在現有文獻中未提及。

劉芬等研究表明，誘導蘭州百合花絲愈傷組織形成的理想培養(yǎng)基是 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA[6]； 申玉華等研究表明，誘導西伯利亞百合花托產生愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA[7]；郭海濱等研究表明，誘導卷丹百合鱗片及珠芽產生愈傷組織的理想培養(yǎng)基為 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA[9]；周曉波等采用卷丹百合珠芽進行脫毒快繁研究發(fā)現，MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA為誘導愈傷組織最佳培養(yǎng)基，而只使用6-BA與NAA組合的培養(yǎng)基誘導愈傷組織少甚至沒有[10]。張文娥等的研究表明，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的誘導率為90.6%，而本試驗中，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA組合的誘導率為80%左右，誘導率相差10%左右[11]。李黛等的研究表明，誘導愈傷組織增殖的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L NAA+3%蔗糖[8]，這與本研究在NAA和6-BA 的使用量方面有較大差異，這可能是由所用外植體不同所致。結合本試驗結果及上述分析認為， 不同種類百合誘導愈傷組織時添加的植物生長調節(jié)劑種類和濃度差異較大，在進行百合工廠化大規(guī)模育苗時，須根據所使用百合的種類，篩選出適宜的植物生長調節(jié)劑種類及濃度組合。研究結果還表明，愈傷組織在不同時期的增長量及生長情況對于后期大規(guī)模誘導再分化出不定芽直至生產組培苗具有至關重要的影響。

參考文獻：

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