淡黃花百合珠芽誘導脫分化的研究

張翔宇+陳杰+吉云+嚴顯進+王彩云+阮培均+王永

摘要：以淡黃花百合珠芽為試驗材料，采用完全試驗設計方法，研究不同濃度的6-BA、NAA組合對淡黃花百合珠芽愈傷組織誘導的影響。結果表明：淡黃花百合珠芽誘導愈傷組織的最佳培養基為MS+0.3 mg/LNAA+1.0 mg/L6-BA，其誘導萌發時間為11 d，萌發率為100%，愈傷組織月平均直徑增長量3 cm以上。

關鍵詞：淡黃花百合；珠芽；脫分化

中圖分類號： S567.23+9.043 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0058-03

淡黃花百合（Lilium sulphureum.Baker）為百合科百合屬多年生草本植物，集藥食兩用及觀賞于一身[1]。其花、梗、鱗莖均可入藥，花和梗可用作止血藥，鱗莖可預防和治療肺結核、慢性氣管炎、咳嗽、肺氣腫、肺嗽咯血、體虛腫弱、瘡癰腫瘤等癥，若服食清蒸百合，還可治胃病、肝病、貧血等，是多種滋補藥的主藥[2]。百合的傳統繁殖方式主要有珠芽繁殖、子球繁殖、鱗片繁殖3種[3]。采用現代組織培養方式進行百合種苗擴繁，因其繁殖系數高而成為重要的繁殖方式之一，通過組織培養可快速得到大量百合種苗，是百合產業發展的一大趨勢。而要使百合組織培養與生產銜接，關鍵是要針對不同品種制定與之相匹配的組培快繁方案[4]。組織培養方法可促進百合商品種球的生產和百合新品種的培育[5]。

目前對百合誘導脫分化的報道較多。劉芬等用花絲誘導蘭州百合愈傷組織時發現，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA是誘導蘭州百合花絲愈傷組織形成的理想培養基[6]；申玉華等以西伯利亞百合花托為外植體進行組織培養發現，MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA是誘導愈傷組織的最佳培養基[7]；李黛等以淡黃花百合鱗莖為外植體進行誘導，發現其誘導愈傷組織增殖的最適培養基為MS+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L NAA+3%蔗糖[8]；郭海濱等以卷丹百合鱗片及珠芽為外植體進行研究認為，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA誘導不定芽和愈傷組織數量較多，生長勢強，愈傷組織顆粒出現時間為20 d[9]。以上研究表明，對百合愈傷組織誘導大部分以MS為基本培養基附加不同濃度的6-BA和NAA，但不同種類百合愈傷組織誘導所用的6-BA與NAA的比例有較大差異。同時，沒有針對愈傷組織不同時期的增長量及生長情況的研究報道。由于愈傷組織不同時期的增長量及生長情況對于后期大規模誘導再分化出不定芽直至生產組培苗具有至關重要的影響。因此，本研究以淡黃花百合珠芽為外植體，研究不同濃度的6-BA和NAA組合對其愈傷組織誘導和愈傷組織直徑月平均生長量的影響，以期為淡黃花百合大規模組培育苗提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 外植體 野生淡黃花百合珠芽采自貴州省畢節市大方縣羊場鎮2年生淡黃花百合植株。

1.1.2 培養基 以MS為基本培養基，其中每個配方添加25 g/L 蔗糖，pH值為5.8～6.0，瓊脂添加量6.5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌 將采集的淡黃花百合珠芽帶回實驗室，用自來水沖洗3 h，用鑷子將外層小鱗片剝下，放入燒杯中，加入1～2滴吐溫20，用玻棒攪拌2～3 min，放置30 min，將水倒掉，用紗布將外植體包好，用自來水沖洗1～2 h后，于超凈工作臺上用75%乙醇浸泡30 s左右，用無菌水沖洗3～4次，然后用0.1%氯化汞消毒8 min，無菌水沖洗6次以上，最后將滅菌后的外植體放入事先準備好的無菌不銹鋼盤中，用濾紙吸干表面水分，即可得到接種用外植體。

1.2.2 外植體接種 用鑷子將準備好的無菌外植體接種于不同植物生長調節劑組合的培養基上（表1），每組接種5瓶，每瓶接種5個，每組3個重復。

1.2.3 培養 接種后放在培養架上培養，培養條件：白天（25±3）℃，晚上（20±3）℃，濕度（85±5）%，光照度為1 000～1 200 lx，光照時間12 h /d。

1.2.4 試驗設計 采用2因素5水平完全設計方案（表1）。

1.3 項目測定

誘導時間t：外植體開始萌動時的時間。

1.4 數據處理

所得數據均采用 IBM SPSS Statistics 20軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度6-BA與NAA組合對愈傷組織誘導時間的影響

不同濃度的6-BA與NAA組合對愈傷組織誘導時間的影響較大。通過對表2中誘導時間的直觀分析表明，處理7、處理9、處理10均可在10 d誘導珠芽愈傷組織萌動，而其他處理的誘導時間相對延遲，其中處理22、處理23、處理25均需要17 d才可以誘導愈傷組織萌動。由表3中誘導時間的Ⅲ型平方和可以看出，NAA的Ⅲ型平方和為334.080，大于6-BA 的7.680，這表明對淡黃花百合珠芽愈傷組織萌發時間的影響中，NAA起主要作用，6-BA起次要作用。從表2可看出，不同濃度NAA和6-BA對萌發時間的影響不同，低濃度的NAA誘導萌發的時間較短，高濃度NAA誘導萌發的時間較長，0.3 mg/L NAA與1.0 mg/L 6-BA組合能夠最快誘導產生愈傷組織。

2.2 不同濃度6-BA與NAA組合對愈傷組織誘導率的影響

不同濃度的6-BA與NAA組合對愈傷組織誘導率具有顯著性差異。從表2可以看出，處理15、處理20、處理21、處理25的誘導率較差，誘導率不到50%；而處理7、處理16、處理17的誘導率較好，均超過90%，其中處理7的誘導率可達100%。由表3中誘導率的Ⅲ型平方和可以看出，NAA的Ⅲ型平方和為7 055.290，小于6-BA的9 888.965，這表明對淡黃花百合珠芽愈傷組織誘導率的影響中，6-BA起主要作用， NAA起次要作用。0.3 mg/LNAA與1.0 mg/L 6-BA組合對珠芽愈傷組織的誘導率最高，可達100%。

2.3 不同濃度6-BA與NAA組合對愈傷組織月平均增長量的影響

不同濃度的6-BA與NAA組合對愈傷組織月平均增長量的影響具有顯著性差異。由表2可以看出，在第1個月，處理25的增長量最小，只有（0.92±0.01）cm，而處理7的增長量最大，可達（3.07±0.01）cm；在第2個月，處理25的增長量仍然最小，只有（1.06±0.06）cm，而處理7的增長量仍然最大，為（3.19±0.01）cm；在第3個月，處理21的增長量最小，為（1.03±0.01）cm，而處理7的增長量仍然最大，為（3.25±0.01）cm。不管是第1個月、第2個月還是第3個月，0.3 mg/L NAA與1.0 mg/L 6-BA組合的月平均直徑增長量均最大，其增長量均達3 cm以上。從表3中愈傷組織月平均增長量的Ⅲ型平方和可以看出，6-BA的影響均大于NAA，說明對于淡黃花百合珠芽愈傷組織的生長，6-BA起主要作用。從表4中愈傷組織生長情況來看，30 d時，愈傷組織顏色均為黃綠色，隨著培養時間的增加，誘導率高于70%的組合顏色能夠保持較好的生長色，愈傷組織比較疏松，利于增殖和分化（圖1-A）。而誘導率低于70%的組合顏色不能保持好的生長色，逐漸開始褐化，愈傷組織的生長狀態開始變得緊密，不利于增殖和分化（圖1-B）。結合表2和表4可以看出，雖然誘導率高于70%的組合顏色能夠保持再好的生長色，但隨著培養時間的增加，愈傷組織的月增長量出現規律性，即前60 d呈現生長加快的趨勢，60 d之后生長開始變緩。

3 結論與討論

本試驗采用珠芽為外植體，以MS為基本培養基，采用2因素5水平完全試驗設計方案考察不同濃度NAA和6-BA組合對淡黃花百合珠芽誘導愈傷組織的影響。結果表明，MS+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA為淡黃花百合珠芽誘導愈傷組織的最佳培養基，該培養基不管是在誘導率、誘導時間，還是誘導愈傷組織月增長量方面均達到了最佳。研究還發現，低濃度的NAA誘導時間較快，高濃度NAA誘導時間較慢，NAA在誘導時間方面起主要作用，但在愈傷組織誘導率及愈傷組織的生長過程中6-BA卻起主要作用，這種現象在現有文獻中未提及。

劉芬等研究表明，誘導蘭州百合花絲愈傷組織形成的理想培養基是 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA[6]； 申玉華等研究表明，誘導西伯利亞百合花托產生愈傷組織的最佳培養基是MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA[7]；郭海濱等研究表明，誘導卷丹百合鱗片及珠芽產生愈傷組織的理想培養基為 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA[9]；周曉波等采用卷丹百合珠芽進行脫毒快繁研究發現，MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA為誘導愈傷組織最佳培養基，而只使用6-BA與NAA組合的培養基誘導愈傷組織少甚至沒有[10]。張文娥等的研究表明，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的誘導率為90.6%，而本試驗中，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA組合的誘導率為80%左右，誘導率相差10%左右[11]。李黛等的研究表明，誘導愈傷組織增殖的最適培養基為MS+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L NAA+3%蔗糖[8]，這與本研究在NAA和6-BA 的使用量方面有較大差異，這可能是由所用外植體不同所致。結合本試驗結果及上述分析認為， 不同種類百合誘導愈傷組織時添加的植物生長調節劑種類和濃度差異較大，在進行百合工廠化大規模育苗時，須根據所使用百合的種類，篩選出適宜的植物生長調節劑種類及濃度組合。研究結果還表明，愈傷組織在不同時期的增長量及生長情況對于后期大規模誘導再分化出不定芽直至生產組培苗具有至關重要的影響。

參考文獻：

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