番茄抗葉霉病的生理指標分析

劉冠+趙婷婷+薛東齊+楊歡歡+姜景彬+李景富+許向陽

摘要：為明確番茄葉霉病過敏性壞死反應中的活性氧代謝、細胞保護酶和激素含量的變化，通過對番茄葉霉病抗病材料HN19（含Cf-19）、HN42（含Cf-11）、Ontrio7516（含Cf-5）和感病材料 Money Maker（含Cf-0）分別接種葉霉菌生理小種1.2.3.4。結果表明：在接種72 h后，不親和互作體系（抗病材料）出現壞死斑，番茄葉片活性氧的積累在接種后3、15 d出現2個峰值，而親和互作體系（感病材料）只在接種后5 d產生1個峰值。不親和互作體系中，第1次活性氧含量的高峰伴隨著過敏性壞死反應（HR），表明高濃度的活性氧會導致細胞死亡。通過對親和互作及非親和互作體系中的細胞保護酶系（超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶）活性及激素（乙烯、水楊酸、脫落酸）含量分析發現，含有不同Cf基因的番茄品種在活性氧的積累、細胞保護酶活性及激素含量上存在相對統一的變化規律。

關鍵詞：番茄葉霉病；過敏性壞死；ROS；保護酶系；激素

中圖分類號： S436.412.1+9 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0133-05

番茄（Solanum lycopersicum）是世界范圍內分布的主要蔬菜作物，據聯合國糧農組織統計，2012年全球番茄產量1.62億t，創造了550億美元的凈利潤[1]。番茄葉霉病（Cladosporium fulvum）是番茄保護地生產中的主要病害，被侵染后既降低番茄的產量，又影響果實的品質，有時甚至使植株死亡[2]。番茄Cf抗病基因介導對葉霉菌的抗性遵循基因對基因假說，抗病基因Cf與無毒基因Avr的相互作用使得抗病品種對生理小種產生特異性識別。有研究表明，Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4介導番茄產生的過敏壞死在產生速度、強度和組織特異性等方面均存在顯著差異[3]。當番茄抗性品種被葉霉病菌侵染后，多數在侵染區域產生過敏性壞死反應（hypersensitive response，HR）[4]。有學者認為HR可能是細胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）的一種形式[5]，因為植物體內發生HR時也表現出細胞凋亡的特征，如番茄原生質體用HR激發子花生四烯酸處理時也形成DNA梯形帶[6]。番茄葉霉菌的侵染可以分為3個階段：早期包括蛋白激酶激活[7]、活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）產生[8-9]、膜質氧化和谷胱甘肽積累；中期包括脂肪氧化酶活性增強、電解液滲漏[10]和防御基因表達[11-12]；后期包括水楊酸積累、病癥出現和細胞程序性死亡。HR中有多種信號分子參與，而活性氧是誘導HR的一個重要因子。當病原菌侵染寄主植物時，可使其體內活性氧產生與清除之間的動態平衡被打破[13]。在植物與病原菌大多數不親和互作中，伴隨HR的最顯著特征就是氧化暴發，在短時間內積累大量的ROS，引起過敏性細胞死亡，在HR過程中發揮著重要的作用[14]。細胞保護酶系統主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）等，它們有清除ROS的作用，使其維持在正常水平，防止其對細胞膜的毒害[15]。綜上所述，一方面ROS及細胞保護酶之間與植物過敏性抗病反應有關，因而被認為是植物抗病防衛反應的組成部分；另一方面，ROS作為信號物質參與植物對病原菌侵染的防御反應、細胞死亡和抗病基因表達的調控等[16-17]。另外有研究表明，植物激素水楊酸（salicylic acid，SA）、乙烯（ethylene，ETH）是植物抗病信號轉導途徑中的重要調控因子[18]。此外，植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）、生長素（auxin）、赤霉素（gibberellin，GA）、細胞分裂素（cytokinine，CK）和油菜素內酯（brassinosteroid，BR）等也被報道參與調控植物對病原菌的抗性[19-22]。

目前對于番茄葉霉菌的研究主要集中在抗病基因及其無毒基因的克隆，而很少集中在生理指標的測定上，本試驗旨在探究番茄抗葉霉病菌侵染的過程中活性氧、細胞保護酶活性和激素水平的變化規律，以及親和互作體系與非親和互作體系的區別，以明確番茄抗葉霉病的生理機制，揭示其抗病機制，為番茄的抗葉霉病育種提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄品種（表1）及供試葉霉菌生理小種1.2.3.4，由東北農業大學園藝學院番茄課題組提供；HN19（含Cf-19）、Ontrio7516（含Cf-5）、HN42（含Cf-11）與葉霉菌生理小種1.2.3.4均為不親和互作（incompatible interaction），即表現為免疫或高抗；Money Maker（簡稱 mm，含Cf-0）與葉霉菌生理小種之間的相互作用是親和互作（compatible interaction），即表現為感病。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的種植與接種 將供試材料種于溫室中，每份供試材料設3次重復，每次重復40株。將供試材料用噴霧接種法分別接種葉霉菌生理小種1.2.3.4，接種苗齡為4～5張真葉。接種前轉入小棚保濕24 h，使空氣相對濕度達到100%。用小型噴霧器將菌液噴于葉片背面，接種后保持濕度在85%以上，溫度在20～25 ℃。接種后0、1、3、5、8、15、18、21 d分別取供試材料第5或第6張真葉，每個材料取4～5張葉，用無菌水洗凈，液氮冷凍后于-80 ℃保存。

1.2.2 錐蟲藍染色觀察 在接種葉霉菌后96 h，采用洪薇的方法進行錐蟲藍染色觀察[23]，用OLYMPUS SZX10顯微鏡鏡檢，并拍照。

1.2.3 ROS、CAT、POD、SOD活性及ETH、ABA、SA含量的測定 分別采用上海勁馬實驗設備有限公司的植物活性氧（ROS）ELISA試劑盒E-60016、植物乙烯（ETH）ELISA試劑盒E-60049、植物激素脫落酸（ABA）ELISA試劑盒E-60004、植物激素水楊酸（SA）ELISA試劑盒E-60046進行測定；SOD活性采用氮藍四唑法測定，POD活性采用愈創木酚比色法測定，CAT活性采用高錳酸鉀滴定法測定。

2 結果與分析

2.1 錐蟲藍染色觀察

葉片接菌前都呈現健康，在接菌3 d時，親和與不親和互作體系的葉片表征沒有任何變化（圖1）。但用錐蟲藍染色后，不親和互作番茄葉片在接種后72 h出現HR現象（圖2）， 圖2-a、圖2-b、圖2-c中在沿葉脈方向出現壞死細胞群。而與葉霉菌親和互作的Money Maker在接種后96 h時，尚未出現HR現象。接菌后15 d時，親和互作葉片表面可看出有1小塊葉霉菌霉層（圖1），而此時染色圖片中可看出親和互作體系Money Maker葉片壞死斑的面積大于不親和互作體系（圖2），由此推測菌絲生長更為快速。

2.2 番茄抗葉霉病過敏性壞死反應中ROS含量的變化

病原菌的侵染可破壞植物體內活性氧的產生與清除之間的動態平衡，從圖3可見，在番茄品種與葉霉菌互作體系中，接種后0～21 d內不親和互作體系與親和互作體系中ROS變化趨勢完全不同，但不親和互作體系中變化趨勢大致相同。不親和互作體系Cf-5、Cf-11、Cf-19中，ROS含量出現2個高峰，而親和互作體系Money Maker中只有1個峰。不親和互作體系Cf-5、Cf-11、Cf-19的ROS含量在接種后3 d達到第1個峰值，而親和互作體系Money Maker的ROS含量接種后變化不大，接種后3 d呈上升趨勢，到接種后5 d達到峰值。不親和互作體系Cf-5、Cf-11、Cf-19的ROS峰值高于親和互作體系Money Maker。雖然3個不親和互作體系在葉霉菌侵染后，ROS含量都出現了2個峰值且變化趨勢大致相同，但略有區別。對于不親和互作體系而言，接種后3 d，ROS大量積累，此時有可能是出現HR的時間。對于親和互作體系而言，接種后5 d左右活性氧含量突增，此時有可能是病斑產生時間。由此推斷，ROS積累高峰期基本與番茄葉片壞死斑產生是同步的。

2.3 番茄抗葉霉病過敏性壞死過程中細胞保護酶活性的變化

SOD、POD、CAT都是植物膜脂過氧化酶促防御系統中重要的保護酶。SOD在細胞保護酶系統中的作用是清除超氧陰離子等活性氧，同時產生歧化產物H2O2，CAT、POD在保護酶系統中主要起到酶促降解H2O2的作用[24]。

2.3.1 SOD活性 SOD是植物體內清除自由基的關鍵酶之一，它能催化植物體內分子氧活化的第1個中間產物O-2[KG-*2]· 發生歧化反應生成O2 、H2O2， 其活性高低可用于衡量植物抗性的強弱[25]。由圖4可知，接種葉霉病菌后，番茄葉片中SOD活性在不同互作體系中有不同變化趨勢，但在不親和互作體系中變化趨勢大致相同。親和互作體系Money Maker中的SOD活性在接種后1 d迅速升高后迅速下降，在接種后3 d達到谷值，然后升高。不親和互作體系Cf-5、Cf-11、Cf-19中的SOD活性在接種后逐漸升高，并且均在接種后5 d達到峰值，之后迅速下降，在接種后15 d達到1個谷值。與ROS含量的變化相比可見，不親和互作體系中的ROS含量在出現第1個峰值時，其SOD活性處于中間值，表明此時有相對較高活性的SOD并沒有抑制ROS的積累。

2.3.2 POD活性 植物細胞內存在的POD可催化分解H2O2生成H2O和O2，還可使脂肪酸、芳香胺和酚類物質等氧化。相關文獻報道，POD活性升高是植物抗性的一種表現形式[26]。接種葉霉病菌后，番茄葉片中POD活性在不同互作體系中發生不同的變化趨勢，但不親和互作體系中的變化趨勢大致相同。從圖5可見，在取樣時間內，親和互作體系Money Maker的POD 活性出現2個峰值，而不親和互作體系只有1個峰值，且其峰值高于親和互作體系。與ROS含量的變化相比，無論親和互作體系還是非親和互作體系，POD活性的變化與其沒有太大的對應關系。

2.3.3 CAT活性 接種葉霉病菌后，番茄葉片中CAT活性在不同互作體系中具有不同的變化趨勢。由圖6可見，親和互作體系的CAT活性在接種后迅速上升，并在接種后5 d達到1個峰值，之后迅速下降，在接種后8 d達到1個低谷，之后逐漸升高；在不親和互作體系中CAT活性變化趨勢大致相同，但其活性還是略有不同。在不親和互作體系中CAT活性在接種后略有下降后逐漸上升，在接種后5 d達到峰值。與ROS含量的變化相比，在親和互作體系中CAT活性的變化與ROS的積累相反。不親和互作體系的CAT活性在接種后有所降低，這說明在親和互作前期，植物體內降解H2O2的能力下降，有利于H2O2的積累。

2.4 番茄抗葉霉病過敏性壞死過程中植物激素含量的變化

2.4.1 ETH含量 乙烯作為植物中唯一的氣體激素，雖然分子量小，卻參與種子萌發、幼苗發育、花葉以及果實的衰老與凋謝等植物生長發育過程，在植物應對各種脅迫的抗性反應中亦具有至關重要的作用[27]。由圖7可知，在未接種葉霉菌時，各個品種內的乙烯含量處于相同水平，接菌后含量均有所上升。Money Maker中ETH含量在接種后11 d達到1個頂峰后下降，最后逐漸穩定。非親和互作體系中的ETH含量在接種后明顯高于非親和互作體系，基本在接種后18 d時達到頂峰值，之后變化穩定。

2.4.2 ABA含量 脫落酸在植物受到環境中不利因素的脅迫后，可以調控下游基因幫助植物適應復雜環境。最新研究表明，脫落酸在植物抗病反應中具有重要作用[28]。由圖8可以看出，番茄葉片接菌后，親和互作體系和非親和互作體系整體趨勢大致相同，但親和互作體系中ABA含量迅速增加，而不親和互作體系則變化較為緩慢。在接種后8 d，親和互作體系內ABA含量達到最大值，而后趨于平緩。非親和互作體系中ABA含量雖然也在升高，但折現斜率相對于親和互作體系較低且含量少。

2.4.3 SA含量 水楊酸是一種酚類物質，它廣泛參與植物的種子萌發、細胞生長、呼吸作用、衰老相關等基因的表達以及對病害的抵抗等生命活動[29]。由圖9可知，番茄接種葉霉菌后非親和互作體系中沒有相對統一的變化規律，各個品種內SA含量變化比較復雜。Money Maker中SA含量先迅速升高，之后變化緩慢至接種后11 d時出現谷值后又升高。在非親和互作體系中，Cf-5、Cf-11、Cf-19的變化規律也各不相同。含有Cf-5基因的品種內SA含量到接種后5 d達到頂峰，然后緩慢下降，最終變化趨勢相對穩定；而含有Cf-11基因的品種內SA含量到接種后5 d出現谷值，而后緩慢升高；含有Cf-19基因的品種內SA含量變化則相對穩定。

3 結論與討論

本研究利用番茄抗葉霉病不同品種、感葉霉病品種與不同生理小種葉霉病菌之間不同的互作表現，從葉霉菌侵染番茄葉片后活性氧積累及細胞保護酶活性等方面出發，探討活性氧的產生變化及其細胞保護酶活性的變化，以期找到含有不同Cf基因的抗病品種在接種后的活性氧及保護酶活性變化規律。結果表明，親和互作體系與不親和互作體系在葉霉病菌侵染后，活性氧積累和細胞保護酶系活性變化是不同的，但不親和互作體系中活性氧的積累和細胞保護酶活性的變化規律大致相同。

在不親和互作體系中，葉霉病菌侵染番茄葉片內活性氧的積累有2個高峰，這與Lamb等的研究結果[30]類似。其中第1次活性氧含量迅速增加是在接種后3 d，可能與葉片上產生過敏性壞死斑的時間相吻合；不親和互作體系第2個活性氧含量累計峰值產生在接種后15 d；親和互作體系中，在接種后5 d活性氧的積累達到了1個峰值。不親和互作體系的活性氧積累的第1個峰值低于第2個峰值，說明其應該是作為信號分子啟動了植物的抗病反應，這與Jabs的研究[31]相一致。無論番茄是因為感病葉片被破壞或是因抗病而產生大量壞死斑，都有強度極高的活性氧積累。這表明高強度活性氧含量的突增會導致細胞死亡，這與Tiwari等的結論[32]一致。

在親和互作體系與非親和互作體系中，細胞保護酶SOD、POD、CAT的功能和作用是不同的。在親和互作體系中，葉霉病菌侵染番茄后的前期SOD、CAT含量適中，因此沒有活性氧積累；而在非親和互作體系中，葉霉病菌侵染番茄后的前期SOD活性與CAT活性呈負相關，此時活性氧含量劇增，超氧陰離子含量增加，且從接種葉片的壞死斑癥狀看出，此時細胞死亡加劇，由此推測超氧陰離子在細胞死亡中有重要作用。龍書生等對小麥條銹病的過敏性壞死反應的研究也證實了這一點[24]。

含有Cf基因的番茄材料接種葉霉病菌后，其SOD活性高于感病材料，可能是感病材料葉片中O-2含量增加超越了防御系統的清除能力，導致脂膜過氧化反應的結果。王全華等對外源GO基因導入番茄后對葉霉病的抗性機制的研究也證實了這一點[33]。

ETH、ABA、SA是在葉霉菌侵染番茄植株過程中產生變化較為明顯的3種激素。ABA是在植物抗病過程中重要的調節激素，而在親和互作體系中ABA含量明顯高于非親和互作體系，說明ABA在葉霉菌引起的生物脅迫反應中起負調控作用，這與Bari等的研究觀點相一致[34]。在蔡新忠等的以水楊酸積累缺失型nahG和乙烯不應型etr11轉基因煙草植株為材料，對水楊酸和乙烯在依賴于番茄Cf-4和Cf-9基因的過敏壞死中的調控作用進行比較研究，結果發現水楊酸對植物抗病基因介導的過敏性壞死產生和調節中的作用，而且說明水楊酸對產物結構域相同的Cf抗病基因決定的過敏性壞死中的作用也有顯著區別。而本試驗中非親和互作體系中ETH含量較高，由此可看出在HR反應中ETH起到正調控作用，而SA含量變化較為復雜，與蔡新忠等研究結果[35]相吻合。

本試驗主要通過測定在番茄抗葉霉病過程中活性氧的積累、細胞保護酶活性及激素含量的變化，發現含有不同Cf基因的番茄抗葉霉病品種在活性氧積累、保護酶活性和激素含量的變化上存在一致的規律，其中SA對非親和互作中結構域相似Cf基因在HR反應中的變化也各不相同。本研究為在分子水平上研究番茄對葉霉病菌產生過敏性反應的機制，以及進一步研究番茄與葉霉病菌的專一性識別及過敏性反應的信號傳遞機制奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Vincent H，Wiersema J，Kell S，et al. A prioritized crop wild relative inventory to help underpin global food security[J]. Biological Conservation，2013，167（3）：265-275.

[2]Areshchenkova T，Ganal M W.Long tomato microsatellites are predominantly associated with centromeric regions[J]. Genome，1999，42（3）：536-544.

[3]Cai X，Takken F L W，Joosten M H A J，et al. Specific recognition of AVR4 and AVR9 results in distinct patterns of hypersensitive cell death in tomato，but similar patterns of defence-related gene expression[J]. Molecular Plant Pathology，2001，2（2）：77-86.

[4]韓建東，曹遠銀，姚 平. 小麥—稈銹菌互作中的激發子對小麥過敏性壞死反應和防御酶活性的誘導[J]. 華北農學報，2009，24（1）：79-82.

[5]范文艷.植物的超敏性細胞死亡研究初探[J]. 黑龍江農業科學，2005（2）：31-34.

[6]Liu J，Liu X，Dai L，et al. Recent progress in elucidating the structure，function and evolution of disease resistance genes in plants[J]. Journal of Genetics and Genomics，2007，34（9）：765-776.

[7]Romeis T，Ludwig A A，Martin R，et al. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response[J]. The Embo Journal，2001，20（20）：5556-5567.

[8]May M J，Hammond-Kosack K E，Jones J D G.Involvement of reactive oxygen species，glutathione metabolism，and lipid peroxidation in the Cf-gene-dependent defense response of tomato cotyledons induced by race-specific elicitors of Cladosporium fulvum[J]. Plant Physiology，1996，110（4）：1367-1379.

[9]Romeis T，Piedras P，Zhang S，et al. Rapid Avr9-and Cf-9-dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures andleaves：convergence of resistance gene，elicitor，wound，and salicylateresponses[J]. Plant Cell，1999，11（2）：273-287.

[10]Hammondkosack K E，Silverman P，Raskin I，et al. Race-specific elicitors of Cladosporium fulvum induce changes in cell morphology and the synthesis of ethylene and salicylic acid in tomato plantscarrying the corresponding Cf disease resistance gene[J]. PlantPhysiology，1996，110（4）：1381-1394.

[11]Ashfield T，Hammond K E，Harrison K，et al. Cf gene-dependent induction of a b-1，3-glucanase promoter in tomato plants infected with Cladosporium fulvum[J]. Molecular Plant Microbe Interactions，1994，7（5）：645-656.

[12]Wubben J P，Lawrence C B，de Wit P. Differential induction of chitinase and 1，3-β-glucanase gene expression in tomato by Cladosporium fulvumand its race-specific elicitors[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，1996，48（2）：105-116.

[13]Grant J J，Loake G J.Role of reactive oxygen intermediates and cognate redox signaling in disease resistance[J]. Plant Physiology，2000，124（1）：21-30.

[14]Foyer C H，Lopez-Delgado H，Dat J F，et al. Hydrogen peroxide and glutathione associated mechanisms of acclamatory stress tolerance and signaling[J]. Physiologia Plantarum，1997，100（2）：241-254.

[15]Elstner E F.Oxygen activation and oxygen toxicity[J]. AnnualReview of Plant Physiology，2003，33（1）：73-96.

[16]Jabs T，Dietrich R A，Dangl J L.Initiation of runaway cell death in an Arabidopsis mutant by extracellular superoxide[J]. Science，1996，273（5283）：1853.

[17]Levine A，Tenhaken R，Dixon R，et al. H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response[J]. Cell，1994，79（4）：583-593.

[18]Pieterse C M J，Leon-Reyes A，Ent S V D，et al. Networking by small-molecule hormones in plant immunity[J]. Nature Chemical Biology，2009，5（5）：308-316.

[19]Spoel S H，Dong X.Making sense of hormone crosstalk during plant immune responses[J]. Cell Host and Microbe，2008，3（6）：348-351.

[20]Eckmann L，Kagnoff M F.Cytokines in host defense against Salmonella[J]. Microbes and Infection，2001，3（14/15）：1191-200.

[21]Ueguchi-Tanaka M，Nakajima M，Katoh E，et al. Molecular interactions of a soluble gibberellin receptor，GID1，with a rice DELLA protein，SLR1，and gibberellin[J]. The Plant Cell，2007，19（7）：2140-2155.

[22]Anderson J P，Badruzsaufari E，Schenk P M，et al. Antagonistic interaction between abscisic acid and jasmonate-ethylene signaling pathways modulates defense gene expression and disease resistance in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2005，16（12）：3460-3479.

[23]洪 薇. 番茄抗葉霉病分子機理及抗病相關基因分離技術體系的建立[D]. 杭州：浙江大學，2007.

[24]龍書生，曹遠林，李亞玲，等. 小麥抗條銹病過敏性壞死反應中的活性氧代謝[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2009（11）：125-130.

[25]匡傳富，羅 寬. 煙草品種對青枯病抗病性及抗性機制的研究[J]. 湖南農業大學學報：自然科學版，2002，28（5）：395-398.

[26]Simte H C，Dasgupta D R.De novo synthesis of peroxidase isozymes of soybean var.Clark-63 infected with the root-knot nematode，Meloidogyne incognita[J]. Indian Journal of Nematology，1987，17（2）：247-253.

[27]Guo H，Ecker J R.The ethylene signaling pathway：new insights[J]. Current Opinion in Plant Biology，2004，7（1）：40-49.

[28]Curvers K，Seifi H，Mouille G，et al. Abscisic acid deficiency causes changes in cuticle permeability and pectin composition that influence tomato resistance to Botrytis cinerea[J]. Plant Physiology，2010，154（2）：847-860.

[29]Vlot A C，Dempsey D M A，Klessig D F.Salicylic acid，a multifaceted hormone to combat disease[J]. Annual Review of Phytopathology，2009，47：177-206.

[30]Lamb C，Dixon R A.The oxidative burst in plant disease resistance[J]. Annual Review of Plant Biology，1997，48（1）：251-275.

[31]Jabs T.Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals[J]. Biochemical Pharmacology，1999，57（3）：231-245.

[32]Tiwari B S，Belenghi B，Levine A.Oxidative stress increased respiration and generation of reactive oxygen species，resulting in ATP depletion，opening of mitochondrial permeability transition，and programmed cell death[J]. Plant Physiology，2002，128（4）：1271-1281.

[33]王全華，王秀峰，林忠平. 外源GO基因導入番茄后對葉霉病的抗性機制[J]. 中國農業科學，2006，39（7）：1365-1370.

[34]Bari R，Jones J D G.Role of plant hormones in plant defence responses[J]. Plant Molecular Biology，2009，69（4）：473-488.

[35]蔡新忠，徐幼平. 水楊酸和乙烯對依賴于Cf基因的過敏壞死的調控作用[J]. 植物生理與分子生物學學報，2003，29（1）：11-14.