誘導茄子花藥通過胚胎發生途徑再生植株

杜碧云+崔慧琳+崔群香+周顯忠+張天雨+吳飛澤+何成榮

摘要：以9份茄子花藥為試材進行誘導培養。結果發現，茄子花藥培養能通過胚胎發生途徑再生出植株；9份材料均誘導產生了胚狀體，但不同材料胚狀體誘導頻率存在差異，15-黑冠誘導率最高，為17%；91個胚狀體中，12個萌發成植株，萌發率為13%；12個植株中，7株移栽成活并現蕾開花，其中5株為單倍體，1株為二倍體，1株為四倍體；雖然2號誘導培養基上花藥膨大率高于1號培養基上的花藥，但后者隨后會產生更多成熟且發育一致的胚胎。結果表明，如何促使胚狀體發育成熟、提高單倍體加倍頻率、確定胚狀體的細胞起源，是制約茄子花藥育種實際應用的關鍵問題。

關鍵詞：茄子；花藥；胚胎發生；植株再生

中圖分類號： S641.104+.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0192-04

植物花藥和花粉（小孢子）培養是生產單倍體和雙單倍體的有效手段，在育種研究中可以大大縮短育種年限。自Guha（1964）和Maheshwar（1982）利用毛葉蔓陀羅（Datura innoxia）進行花藥培養獲得胚狀體及其再生植株后，至今已有200多種植物通過花藥培養獲得了再生植株[1]。茄子（Solanum melongena L.）花藥培養的研究開始于 20世紀70年代初[2]，從那以后從花藥和花粉培養均成功獲得了單倍體植株[3]。茄子花藥和花粉培養中，再生植株多數經由愈傷組織通過器官發生途徑獲得[4-9]，少數報道茄子能夠通過胚胎萌發產生植株[10-12]。研究表明，茄子花藥培養能夠獲得花粉細胞起源的再生植株，再加上茄子花粉培養常需從預培養的花藥中游離小孢子培養，整個過程比花藥培養技術更加復雜，因此國內茄子單倍體技術育種研究者以花藥培養研究為主。

本研究以金陵科技學院茄子育種課題組所收集的優異茄子花藥為材料，開展培養，以期獲得花粉起源的植株，建立穩定可靠的茄子花藥培養再生體系，為創制茄子遺傳育種新種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為金陵科技學院蔬菜育種組收集的茄子8個商品種的低世代自交系，1個F1代品種聚合雜交的后代，以及田間生長的不知名品種的植株。材料編號分別為14-24、14-25、14-55、14-84、15-231、15-232、15-234、15-黑冠、15-混雜。14-24、14-25、14-55、14-84為2013年底育苗，2014年種植；其余材料為2014年底育苗，2015年種植；所有植株春季栽培結束后，在8月份剪枝再生。定植植株或剪枝再生植株現蕾開花后，選取花瓣距離花萼裂片±2 mm的未開放花蕾進行花藥培養試驗。

1.2 方法

1.2.1 花蕾采集和消毒

采取符合標準的花蕾，在4 ℃冰箱中保濕條件下低溫處理1～2 d后取出，整理后去除花萼裂片，按常規方法在超凈工作臺上進行消毒，先用75%乙醇浸泡2 min，再用6.5%次氯酸鈉加入1滴吐溫-80震蕩消毒15 min，最后用無菌水清洗4～5次。

1.2.2 花藥培養

消毒處理后的花蕾，放在無菌濾紙上，用鑷子和剪刀剝去其中的花藥，接種到預處理培養基中，先在36 ℃ 條件下暗培養6 d，然后將未出現污染的花藥轉接到誘導培養基中，在25 ℃℃、光周期16 h/8 h的光照培養箱內培養，20 d后轉到分化培養基中，每20 d繼代1次，直至出現愈傷組織或胚狀體，將發育較充分的胚胎及時轉到生根培養基中，分化和生根培養條件同誘導培養。在培養過程中調查花藥膨大率和胚胎發生的頻率。

基本培養基均為MS培養基并加以改良，添加不同種類和濃度的植物生長調節劑形成預誘導培養基、誘導培養基、分化培養基和生根培養基，pH值為5.8，121 ℃，在0.1～0.15 MPa 壓力進行滅菌15 min。培養基具體配方如下：

（1）預處理培養基：MS+0.2 mg/L 2，4-D+8.0 mg/L 維生素C+1.0 mg/L KT+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉；

（2）誘導培養基1：MS+2.0 mg/L KT+10 g/L聚乙二醇（PEG-4000）+15 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉； 誘導培養基2：MS+1.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L KT+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉；

（3）胚狀體分化培養基：MS+0.1 mg/L NAA+2 mg/LZT+800 mg/L Glu+30 mg/L GSH+100 mg/L L-Ser+30 g/L 蔗糖+8 g/L瓊脂粉；

（4）生根培養基：1/2MS+0.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖+8 g/L 瓊脂粉。

1.2.3 再生植株開花結實性和倍性鑒定

煉苗移栽前，從每個試管苗上剪取3～4條長3～4 cm的根，或現蕾開花時采取小花蕾，將根或花蕾用卡諾固定液固定24 h，系列濃度的乙醇清洗后，放在75%乙醇中保存備用。采用根尖染色體計數或花粉母細胞減數分裂觀察法鑒定植株的倍性，根尖或花蕾用卡寶-品紅染液染色，壓片法制片，并用Nikon80i顯微鏡在可見光下觀察和拍照。根據根尖染色體數目或減數分裂各時期染色體數目，結合開花結實情況，確定植株的倍性。開花后觀察各植株花朵的大小、花粉的有無以及能否結實，并拍照。

2 結果與分析

2.1 花藥培養胚胎發生和再生植株的過程

剛接種的花藥為淡綠色（圖1-1），經過熱處理后，多數花藥保持原來的形態，顏色由淡黃綠色變為淺褐色，部分花藥周圍的培養基上出現污染的菌斑（圖1-2）；花藥轉移到誘導培養基上以后，部分花藥仍舊保持原來的形態，部分花藥開始膨大（圖1-3），由殘存花絲產生的愈傷組織致密，而疏松的愈傷組織往往從花藥中部或遠離花絲的花藥端產生，并且能夠產生胚胎的花藥多數也能產生疏松的愈傷組織（圖1-4）。花藥在轉入分化培養約2周后產生胚胎，一般1枚花藥會產生0～3個胚狀體（圖1-5），最多時1枚花藥可以產生7個胚狀體（圖1-6），胚狀體發育不同步，成熟的胚狀體子葉、胚根和根毛結構清晰。胚狀體轉入生根培養基后，多數褐化或重新愈傷組織化（圖1-7），少數成熟的胚狀體能夠萌發，經2后左右長成小苗（圖1-8）。

2.2 不同誘導培養基對胚胎發生的影響

試驗中發現只有在誘導培養基上發生膨大的花藥才能最終產生愈傷組織和胚胎，對花蕾數量較多、消毒效果較好材料是15-231、15-232，進行了2種誘導培養基誘導花藥膨大效果的試驗，每品種每培養基接種10皿，每皿內接種17～21枚花藥，誘導培養結束后統計膨大率（每皿膨大花藥數/每皿接種花藥數×100%），并進行方差分析。結果（表1）表明，不同品種的花藥膨大率沒有顯著差異，品種與培養基之間不存在顯著的互作效應，但2種誘導培養基之間膨大率存在顯著差異，其中誘導培養基2中的花藥膨大率平均為77.45%，顯著大于誘導培養基1中的68.29% 。

2.3 不同基因型材料胚胎發生頻率

花藥轉接到分化培養基后，約有半數花藥能夠產生愈傷組織，少數的花藥能夠產生胚狀體，由于繼代過程中仍舊會出現污染，無法精確地依據品種和誘導培養基以及膨大花藥來統計各材料的胚胎發生頻率，只能根據各品種最初接種的花藥總數以及最終出現的胚狀體數統計不同品種的出胚頻率。所有供試品種在培養過程中均出現了胚狀體，但頻率不同，15-黑冠出胚頻率最高，為17.0%；其次是15-231，頻率為16.7%；15-234、15-232出胚頻率均低于1%（表2），說明基因型影響花藥胚胎發生頻率。胚胎轉移到生根培養基上以后，僅有14-55、14-84、15-231、混雜材料的胚胎萌發形成現蕾開花的植株。

2.4 再生植株倍性及性狀觀測

試驗過程中出現的胚狀體，分次轉入生根培養基后，多數褐化死亡，或者重新愈傷化，轉入調整生長調節劑濃度和種類的各種誘導不定芽的培養基后，沒有成功誘導出芽和植株，而少數發育成熟的胚狀體則能夠直接萌發形成植株，最終獲得了萌發的小植株12株，移栽成活并開花的植株7株，還有2株正待移栽，其余3株則在移栽過程中死亡。

成活的植株經過根尖染色體數目和減數分裂過程中二分體（中期Ⅱ）染色體數目鑒定，確定了植株的倍性：5株為單倍體，1株為二倍體，1株為四倍體。單倍體、二倍體、四倍體植株均能開花，個別單倍體花朵能夠產生少量花粉，但所有單倍體植株自交均不結實（圖2-1至圖2-4）；二倍體植株則能夠開花，并自交結實，已獲得自交種子（圖2-5至圖2-8），該二倍體植株的花粉給系譜法選育出的茄子二倍體自交系授粉也能結子；四倍體植株則能開花散粉，已經自交結實（圖2-9至圖2-12）。

3 結論與討論

影響茄子花藥培養的因素很多，包括花蕾預處理、基本培養基種類、花蕾生理狀態、花粉發育時期、培養基中激素種類及其配比、活性碳和硝酸銀的添加等等[3，13-15]，茄子花藥培養多用MS培養基作為基本培養基[16]，適宜進行花藥培養的茄子花蕾特征為花瓣長與花蕾萼裂基部之差在 0～2 mm[17]，采用先低溫后高溫的變溫處理[18]，進行培養容易取得成功。本研究在前人工作的基礎上，采用MS基本培養基，選用花瓣長與花蕾萼裂基部之差在 0～2 mm的花蕾，對花藥先低溫預處理12～48 h，再在36 ℃下處理6 d，隨后在25 ℃下恒溫培養，最終獲得了愈傷組織和胚狀體，并通過胚狀體直接萌發產生了植株，進一步驗證了前人的研究成果。通胚胎發生的方式，從花藥培養到產生成熟胚狀體，最早僅需42 d，胚狀體萌發產生的植株半年內開花，二倍體和四倍體能夠形成自交株系。與種子播種到開花結實采子所需時間一致，比通過愈傷組織器官發生途徑產生植株時間更短，效率更高。

宋彥平等研究發現，茄子在盛花期，采摘的適宜花蕾胚誘導率最高，始花期次之，末花期最低[7]。本研究中所采用的花蕾，既有來源于春季栽培而秋季剪枝再生的植株，也有當年春季定植后生長中各個時期植株上的花蕾，而以剪枝再生植株上的花蕾培養產生的胚狀體更多，胚狀體更易發育成苗。劉獨臣等在研究中發現，茄子花藥產生胚狀體受基因型影響，其所采用的10個品種，只有2個品種產生了胚狀體，最高胚胎誘導率為18%[14]。而本試驗中所采用的9份材料均再生出了胚胎，2份材料的最高出胚率也接近18%，但最低的則只有0.5%，與劉獨臣等的研究結果[12]基本一致，但基因型反應頻率更高，可能與選用材料遺傳背景不同有關。

本研究中共獲得了91個比較大的茄子狀體，前期獲得的胚狀體由于培養條件和配方不合適等原因，多數褐變死亡，或愈傷化后不再分化出不定芽，最終無法形成完整植株，后期經過改進，尤其是通過調整培養基的配方、改進培養條件，已經能使更多的成熟胚狀體直接發育成植株，最終使12個胚狀體成苗。

聚乙二醇為長鏈乙醇聚合物，水溶性好，在溶液中不分解為離子，是一種較為理想的水勢調節劑，被廣泛應用作滲透調節劑[19-20]，研究人員在進行茄子花藥直接游離小孢子培養時，將培養基中的一半碳源用聚乙二醇代替后誘導出了更多的胚狀體[9]。本試驗中發現雖然誘導培養基2誘導花藥膨大頻率顯著高于誘導培養基1，但產生胚狀體最多的花藥是從誘導培養基1轉入分化培養基上的花藥（圖1-6），且 7個胚胎發育基本一致。2種培養基的差別在于誘導培養基1中添加了聚乙二醇，是否因聚乙二醇的添加而促使茄子花藥和花粉培養中產生的胚狀體同步發育并成熟，需要進一步深入研究。

植株的加倍技術[21]是制約單倍體植株保存和利用的關鍵，筆者參照北京市農業科學院蔬菜所單倍體組[11]的方法，對獲得的單倍體植株進行了加倍處理，但未加倍成功，如何提高茄子單倍體植株加倍頻率有待于進一步研究。

鄧立平等通過花藥培養獲得了加倍單倍體植株，并用于茄子新品種選育[22]，本試驗中得到的茄子二倍體和四倍體植株能否用作選育雜交種品種的親本，還需要進一步鑒定所獲得的胚狀體是配子起源還是體細胞起源。

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