錦鯉人工雌核發(fā)育早期胚胎觀察

蔣國民+王冬武+鄒利+何志剛+李紹明

摘要：以團頭魴滅活精子為誘導(dǎo)，采用熱休克染色體加倍處理方法進行錦鯉雌核發(fā)育。錦鯉卵為黏性卵，置于（20±1） ℃室內(nèi)平皿孵化，50 min后開始卵裂，6 h后出現(xiàn)囊胚期，18.67 h后出現(xiàn)原腸胚期，30 h后出現(xiàn)神經(jīng)胚期，39 h 后器官開始形成，約3 d后可以脫膜孵化，孵化率達68.5%。

關(guān)鍵詞：雌核發(fā)育；早期胚胎；錦鯉；熱休克；脫模；孵化率

中圖分類號： S961.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0248-03

錦鯉屬鯉形目鯉科鯉魚屬，原產(chǎn)于我國，后傳入日本[1]，其色彩鮮艷，神態(tài)雍容華貴，觀賞價值高，是一種高檔觀賞魚，也是一種高度雜合體，花色遺傳機制復(fù)雜。目前，大部分錦鯉品種主要是通過雜交以及長期人工選育而得到的。可見，通過純系親本來揭示花色遺傳機制是目前錦鯉育種方面最亟待解決的問題。因此，雌核發(fā)育在錦鯉選育和親市品種開發(fā)研究方面具有重大意義[2]，它利用滅活的外源精子刺激卵子發(fā)育，再通過人工染色體加倍處理獲得雌核發(fā)育后代，能快速建立遺傳純系，加快發(fā)育速度[3]。目前，我國水產(chǎn)行業(yè)中鯉[4-5]、草魚[6]、白鯽[7]、虹鱒[8]等10多種魚類進行雌核發(fā)育研究，但由于人工雌核發(fā)育的孵化率低，在生產(chǎn)上很難推廣。因此，本試驗以錦鯉為母本，以滅活的團頭魴精子為外源誘導(dǎo)精子，采用熱休克處理假受精卵，受精卵和孵化率分別可達56.54%、 68.71%，并定期觀察研究胚胎發(fā)育，為今后錦鯉人工雌核發(fā)育的推廣提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗魚 母本體質(zhì)健壯，腹部膨大，色澤鮮艷，成熟度一致的2+齡錦鯉，來自湖南省漁緣生物有限公司；父本為2+齡性成熟團頭魴，來自湖南省漁緣生物有限公司。

1.1.2 藥品 實驗室內(nèi)配制Hanks液，冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩４弋a(chǎn)素于注射前配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 設(shè)備 Olympus顯微鏡及其攝像系統(tǒng)，紫外燈2個（30 W），燈架，搖床、紗布，溫度計，加熱棒，雞毛等。

1.2 試驗方法

1.2.1 催產(chǎn) 錦鯉親本進行2針催產(chǎn)，催產(chǎn)藥物注射時間與量根據(jù)當時水溫、親本成熟度、方便操作等多因素來確定，團頭魴注射1次，用量為錦鯉親本一半。錦鯉與團頭魴分池養(yǎng)殖。

1.2.2 精子滅活[9] 人工擠出團頭魴精子（擠之前必須用毛巾擦干凈魚身上的水，沿著胸鰭至泄殖腔輕輕擠壓），立刻加Hanks液，精子 ∶Hanks液=1 ∶4，然后充分搖勻，在培養(yǎng)皿上鋪成約1 mm的液層，放距紫外線15～20 cm處墊有冰板的搖床上處理10～20 min，顯微鏡下定期檢查精子活性。當90%精子失去活性時就停止紫外照射，收集失活精子，貯存碎冰中備用。

1.2.3 雌核發(fā)育[10] （1）受精。撈取發(fā)情錦鯉親本，人工擠出成熟卵粒，快速加入失活精子，用干燥、潔凈的雞毛充分攪拌，進行干法人工假受精。

（2）熱休克。用22 ℃水盡量沖散卵粒，均勻黏附直徑為22 cm 的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，恒溫3 min，然后逐步進入41 ℃水體，放置2 min，再逐步回到22 ℃，放置3 min，其后放置室內(nèi)孵化。

（3）胚胎發(fā)育觀察。孵化水溫和室溫維持在（20±1） ℃，孵化用水充分曝氣，每隔2～3 h換水1次，定期剔除死卵，定期用OLYMPUS顯微鏡觀察與攝像胚胎發(fā)育過程，并統(tǒng)計受精率和胚胎孵化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵裂

受精50 min后，胚盤開始出現(xiàn)第1次分裂，其卵裂速度很快，1 h內(nèi)完成16細胞期分裂，胚盤開始形成多層，卵裂球越來越小，規(guī)則地排列在胚盤表面，逐漸向胚盤外表推移，并集中在胚盤處形成較為明顯的隆起，形成多細胞期（圖1）。

2.2 囊胚期

受精6 h后，胚胎細胞界限開始模糊不清，胚盤在卵黃上呈高峰狀，出現(xiàn)早期囊胚（圖1），進入高囊胚期；9.8 h后，細胞界限消失，囊胚細胞開始向下方擴展，面積不斷擴大，囊胚降低，囊胚細胞逐步平展于卵黃上，胚盤為弓形，形成低囊期。

2.3 原腸胚期

受精18.67 h后，胚層進一步向植物極擴張，約占整個胚胎的1/3（圖1）；受精20.17 h后，胚盤下包卵黃1/2，由于細胞的集中和內(nèi)卷后造成一環(huán)帶形的胚胎和一新月形的缺口，這就是背唇，即原腸期形成的開始（圖1）。21.33 h后，胚盤下包3/5，背唇處又內(nèi)卷及增生的細胞向中央伸展集中形成球胚盾，前端頭部隆起明顯，形成原腸晚期胚胎（圖1）。原腸期統(tǒng)計受精率為56.54%。

2.4 神經(jīng)胚期

受精后30 h，胚層細胞繼續(xù)下包4/5，受精35 h后，囊胚層完全包圍卵黃，胚孔閉合，胚體形成，呈弧形，胚盾中線形成神經(jīng)索，腦部逐漸膨大，出現(xiàn)2個收縮部分，腦分為前、中、后腦3部分，胚體上神經(jīng)溝兩側(cè)可見5～6對短柱狀體節(jié)，達到胚孔封閉期（圖1）。

2.5 器官形成期

受精39 h后，胚體前方兩側(cè)出現(xiàn)橢圓突起的眼泡原基，出現(xiàn)體節(jié)，并隨著時間的推遲，體節(jié)越來越明顯，受精49 h后，出現(xiàn)眼點，胚體后部肌肉可以輕微扭動，可見神經(jīng)脊索（圖1）。受精52 h后，個別胚體心臟開始微弱跳動（圖1）。

2.6 孵化期

受精70～80 h后，胚體活動先明顯減弱，然后胚體尾部出現(xiàn)劇烈扭動，甚至翻滾整個胚體，借助尾部擺動的力量而沖破卵膜（圖1）。胚體有尾部先沖出卵膜的，也有頭部先沖出卵膜的，從卵膜破裂到胚體完全脫落需要5～10 h，并統(tǒng)計胚胎孵化率（為68.71%）。剛脫膜而出的魚苗，腹部帶有一橢圓形卵黃囊，2～3 d后消失，魚苗能平游（圖1）。

3 結(jié)論與討論

雌核發(fā)育主要是人工加倍染色體，采取阻止卵子的第2次成熟分裂，或卵子的第2次有絲分裂而使染色體加倍，不同階段染色體加倍處理的雌核發(fā)育后代基因純度不同[6]。熱休克是一種常用的染色體加倍處理方法，用于雌核發(fā)育研究的不多，并且不同魚類和不同染色體加倍處理階段，熱休克起始時間、所需強度、溫度等均有所不同，孵化率和成活率也較低[11-12]。本試驗用遺傳失活的團頭魴精子能有效啟動錦鯉雌核發(fā)育，采用熱休克處理染色體加倍，較王云等學者研究結(jié)果[13]來看，可達到較高的受精卵和孵化率，表明此方法進行錦鯉雌核發(fā)育是有效可行的。

試驗過程中，胚胎發(fā)育時間同其他研究學者研究上有所差異，筆者認為可能是有以下幾個原因造成的：第一，孵化水溫和室溫的差異導(dǎo)致胚胎發(fā)育速度有所改變。胚胎在培養(yǎng)皿發(fā)育過程中，水溫易受到環(huán)境的影響，所以孵化水溫較難控制。第二，雌核胚胎發(fā)育多放在室內(nèi)進行，環(huán)境光照度對其影響較大。第三，不同品種魚類的胚胎發(fā)育時間會有所不同。

團頭魴屬鯉科鲌亞科魴屬，染色體數(shù)目2n=48[14]，錦鯉染色體數(shù)目為2n=100，兩者關(guān)系較遠，外部形態(tài)差異大，理論上雜交個體不成活[15]。在該研究中，用未經(jīng)遺傳失活的團頭魴精子與錦鯉人工受精，有雜交個體產(chǎn)生，體色黑，外部形態(tài)與團頭魴相似，與劉靜霞等研究結(jié)果[16]相悖，其遠緣雜交出現(xiàn)成活個體的機理仍有待進一步研究。

參考文獻：

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