菌渣固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料的工藝優(yōu)化

張婷婷+馬磊

摘要：為了綜合利用菌渣廢棄物，采用酵母菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，探究將食用菌多糖提取廢渣轉(zhuǎn)化為蛋白飼料的工藝條件。從不同基質(zhì)、溫度、水料比、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)方面，分析影響固態(tài)發(fā)酵菌渣轉(zhuǎn)化蛋白的因素，并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化菌渣固態(tài)發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，影響蛋白質(zhì)含量的主次因素依次為基質(zhì)配比>發(fā)酵時(shí)間>溫度>水料比；在酵母菌接種量13%條件下，菌渣與麩皮的適宜質(zhì)量比8 ∶2、水料比1 mL ∶2.5 g、30 ℃下培養(yǎng)96 h，此時(shí)發(fā)酵物的粗蛋白含量可達(dá)峰值18.43%。本研究將廢棄菌渣轉(zhuǎn)化高蛋白的方法，可促進(jìn)菌渣的再利用，為高效資源循環(huán)使用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菌渣，固態(tài)發(fā)酵，蛋白飼料，正交設(shè)計(jì)

中圖分類(lèi)號(hào)： S816.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0270-02

菌渣廢棄物一般富含水分、易腐爛、不易保存，直接排放污染環(huán)境。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人們生活水平日益提高，畜牧產(chǎn)品需求增大，致使飼料缺口逐年增加，出現(xiàn)了供求關(guān)系難以平衡的局面[1]。因而，尋求新蛋白源成為飼料科學(xué)中的一項(xiàng)重要課題[2]。目前，運(yùn)用微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料越來(lái)越受重視[3-4]。本研究探討不同基質(zhì)配比、不同溫度、不同料水比以及不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌發(fā)酵蛋白質(zhì)含量的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法對(duì)菌渣固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌、提取金頂側(cè)耳菌菇多糖后殘留菌渣、麩皮、馬鈴薯浸取液、葡萄糖、瓊脂粉、玉米粉、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、40 % NaOH溶液、HCl溶液、混合滴指示劑（0.1%甲烯藍(lán) ∶0.1% 甲基紅=1 ∶4）。

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：自制馬鈴薯浸取液1.0 L，加入瓊脂粉15.0 g，葡萄糖20.0 g，121 ℃滅菌25 min后，取出斜面放置，冷卻備用。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：分別以菌渣、菌渣+麩皮、菌渣+玉米粉為培養(yǎng)基基質(zhì)，添加一定量的水分、配制成用于考察水料質(zhì)量比（簡(jiǎn)稱(chēng)水料比）、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量影響的不同培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌25 min 。

1.2.2 菌種的活化

在無(wú)菌條件下，將酵母菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，放置恒溫箱內(nèi)，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)，活化72 h，得到優(yōu)質(zhì)菌種。

1.2.3 液體種子培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，用10 mL無(wú)菌水沖洗斜面培養(yǎng)基上已活化的菌種，接種至盛有80 mL 液體種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置于搖床中，在30 ℃、160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將酵母菌以13% 的接種量接種到已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于25～40 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物置于50 ℃烘箱中風(fēng)干，測(cè)粗蛋白質(zhì)含量。基礎(chǔ)對(duì)照為未發(fā)酵樣品，將試驗(yàn)所用的金頂側(cè)耳菌菇多糖提取后的殘?jiān)?0 ℃條件下烘干，隨機(jī)稱(chēng)取0.2 g未經(jīng)酵母菌發(fā)酵樣品，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用微量凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量。將發(fā)酵好的培養(yǎng)基烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)取0.2 g烘干后的培養(yǎng)基，放入干燥的消化管中，再加入0.4 g的混合催化劑后，加入20 mL 的濃硫酸。待消化管中液體冷卻后，加入蒸餾水20 mL，進(jìn)行蒸餾，在接收瓶中加入2% H3BO350 mL 和2～3滴指示劑，用0.05 mol/L HCl 滴定接收瓶?jī)?nèi)的溶液，滴定溶液由綠色變成淡紫色或灰色時(shí)為滴定終點(diǎn)，記下消耗HCl的體積（mL），計(jì)算粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)法對(duì)基質(zhì)配比、溫度、水料比以及培養(yǎng)時(shí)間這4個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

本研究探討了不同基質(zhì)配比、不同溫度、不同水料比以及不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌發(fā)酵蛋白質(zhì)含量的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)法對(duì)基質(zhì)配比、溫度、水料比以及培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

2.1 不同基質(zhì)配比對(duì)粗蛋白含量的影響

由圖1可知，優(yōu)化后的蛋白含量顯著高于未發(fā)酵樣品的蛋白含量（7.8%）。在1 mL ∶2.5 g的水料比、13% 接種量、30 ℃培養(yǎng)96 h條件下，不同基質(zhì)配比所獲蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著差異。當(dāng)菌渣與麩皮以質(zhì)量比9 ∶1的比例混合時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量可達(dá)最高值（18.3%），與純菌渣組和質(zhì)量比9 ∶1菌渣玉米粉組呈現(xiàn)顯著差異。這可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基的發(fā)酵體系中，麩皮含有較豐富的營(yíng)養(yǎng)組分，其所含糖分、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等都是菌種發(fā)酵所必需的物質(zhì)。因此，添加麩皮有利于菌體生長(zhǎng)。同時(shí)，麩皮質(zhì)地粗糙，能增強(qiáng)物料通透性，促進(jìn)菌生長(zhǎng)。添加玉米粉的培養(yǎng)基，粗蛋白質(zhì)含量增加不明顯，僅為12.1%，這可能是由于玉米粉顆粒較細(xì)，易使培養(yǎng)基黏性大、結(jié)塊、通透性差，從而不利于菌體生長(zhǎng)。

2.2 不同溫度對(duì)粗蛋白含量的影響

圖2顯示，在1 mL ∶2.5 g的水料比、13%接種量、菌渣和麩皮質(zhì)量比9 ∶1、培養(yǎng)96 h的條件下，不同溫度下所獲蛋白質(zhì)含量呈顯著差異。蛋白質(zhì)含量隨溫度升高而增加，當(dāng)溫度為30 ℃ 時(shí)，蛋白質(zhì)含量達(dá)最高值，30 ℃也是酵母菌體較為適宜的生長(zhǎng)溫度。當(dāng)溫度升至35 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)含量開(kāi)始隨溫度升高而降低，這可能是由于溫度過(guò)高，加快了發(fā)酵物的水分蒸發(fā)，造成了不利于菌體生長(zhǎng)的環(huán)境，從而降低蛋白質(zhì)含量。

2.3 不同水料比對(duì)粗蛋白含量的影響

菌體的生長(zhǎng)需要適宜的水分，固態(tài)發(fā)酵物料中的含水量是影響蛋白質(zhì)產(chǎn)量的重要因素之一。由圖3可知，在菌渣和麩皮質(zhì)量比9 ∶1、13%接種量、30 ℃培養(yǎng)96 h條件下，不同水料比會(huì)使蛋白質(zhì)含量呈顯著現(xiàn)差異。水料比為1 mL ∶1.0 g時(shí)，粗蛋白含量最低，僅有10.8%；當(dāng)水料比為1 mL ∶2.5 g時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)17.7%；當(dāng)水料比為1 mL ∶3.0 g時(shí)，粗蛋白量降低至15.3%。基質(zhì)水分過(guò)多，培養(yǎng)基易黏結(jié)，多孔性降低，通透性削弱，基質(zhì)易變質(zhì)，雜菌易污染；含水量過(guò)低，則會(huì)降低培養(yǎng)基的膨脹程度，妨礙菌體利用基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，從而影響菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)不完全，蛋白質(zhì)含量低。

2.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗蛋白含量的影響

由圖4可知，在1 mL ∶2.5 g的水料比、菌渣和麩皮質(zhì)量比9 ∶1、13%接種量、30 ℃培養(yǎng)條件下，不同發(fā)酵時(shí)間下蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著差異。發(fā)酵初始，粗蛋白含量隨時(shí)間增加而增長(zhǎng)，當(dāng)發(fā)酵 96 h 時(shí)粗蛋白含量高達(dá) 17.6%；隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至120 h，蛋白質(zhì)含量降低至15.7%。由此可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵24 h時(shí)，菌體沒(méi)有達(dá)到完全生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的延續(xù)，菌體逐漸成熟。在發(fā)酵96 h時(shí)，菌體生長(zhǎng)最佳。發(fā)酵120 h后，菌體有可能已經(jīng)完成了生長(zhǎng)周期，表現(xiàn)出衰退或死亡的現(xiàn)象，并引起菌體的自溶現(xiàn)象，從而降低粗蛋白含量。

2.5 固態(tài)發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)法對(duì)基質(zhì)配比、溫度、水料比以及培養(yǎng)時(shí)間這4個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。極差分析結(jié)果顯示，影響粗蛋白含量影響因素主次順序分別為基質(zhì)配比>發(fā)酵時(shí)間>溫度>水料比；方差分析結(jié)果也顯示，基質(zhì)配比是影響粗蛋白含量的主要因素。固體發(fā)酵菌渣蛋白飼料工藝中的最優(yōu)組合為A3B2C1D3，即在酵母菌接種量13%條件下，菌渣 ∶麩皮質(zhì)量比為8 ∶2、水料比1 mL ∶2.5 g、30 ℃下培養(yǎng)96 h，發(fā)酵物的粗蛋白含量可達(dá)18.43%。

3 結(jié)論與討論

本研究分析了固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料的生產(chǎn)工藝，研究各因素對(duì)蛋白質(zhì)含量影響的主次順序，并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化菌渣固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明，影響蛋白質(zhì)含量的主次因素依次為基質(zhì)配比、發(fā)酵時(shí)間、溫度、水料比。在酵母菌接種量13%條件下，菌渣 ∶麩皮質(zhì)量比為8 ∶2、水料比1 mL ∶2.5 g、30 ℃下培養(yǎng)96 h，發(fā)酵物的粗蛋白含量可達(dá)峰值（18.43%）。

本試驗(yàn)所用菌渣是金頂側(cè)耳菌菇多糖提取后的廢料，具有一定水分，易腐爛發(fā)臭，不易保存，如果直接排放會(huì)造成環(huán)境污染。菌渣含有比較豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5]。試驗(yàn)前測(cè)得未經(jīng)固體發(fā)酵的菌渣粗蛋白質(zhì)含量約為7.8%，條件優(yōu)化后蛋白含量升高到18.43%。因而，以菌渣作為發(fā)酵的主料，再添加一些輔料，采用酵母菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，可將菌殘?jiān)D(zhuǎn)化為蛋白含量較高的飼料，能大幅提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，從而建立高效的資源循環(huán)再利用系統(tǒng)。

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