山核桃殼中黃酮提取及其抗氧化活性測定

沙迪+姜芝伊+徐紅艷

摘要：以生產山核桃仁產生的廢棄物山核桃殼為原料，采用超聲波輔助提取法得到粗提液，經大孔樹脂柱層析，采用30%、50%、70%乙醇梯度洗脫，將洗脫物真空冷凍干燥，研究洗脫物黃酮純度和抗氧化物質對ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基的清除能力及還原鐵離子的能力。結果表明，黃酮純度高低依次為：30%洗脫物>50%洗脫物>粗提物>70%洗脫物；清除ABTS自由基的能力大小依次為：維生素C> 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物；清除DPPH自由基的能力大小依次為：維生素C>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物>BHT；清除羥自由基的能力大小依次為：維生素C>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物；還原鐵離子能力大小依次為：維生素C>BHT>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物。30%洗脫物抗氧化性最強，與黃酮純度呈正相關。

關鍵詞：山核桃殼；大孔樹脂；梯度洗脫；抗氧化；黃酮

中圖分類號：TS225.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0319-04

山核桃（Juglans mandshurica Maxim.）別稱核桃楸、胡桃楸，是胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）落葉喬木，與水曲柳、黃菠蘿并稱“東北三大硬闊”，是國家Ⅱ級珍稀樹種和中國珍稀瀕危樹種三級保護植物[1]。山核桃樹材質堅硬致密，彈性好，是優良的軍用細木工和家具用材；果仁營養豐富，樹皮、根、葉均可入藥[2-4]。山核桃屬野生堅果類，富含蛋白質、不飽和脂肪、礦物質、維生素，具有潤肺、強腎、降低血脂、預防冠心病等功能，長期食用能夠益壽養顏、抗衰老，對智力發育有很好的幫助[5]。近年來，隨著人們對健康的關注，山核桃果仁市場需求量不斷增加，而在果仁加工過程中產生的大量山核桃殼往往被作為廢棄物[6]。但是，有研究顯示，山核桃殼中含有大量的活性成分[7]，將這些活性成分開發利用，有利于提高山核桃的附加值。

黃酮是存在于植物體中的一種多酚類物質[8]，是植物長期自然選擇過程中產生的次級代謝產物[9]。黃酮是一種很強的抗氧化劑[10-13]，具有較強的清除自由基作用，能夠阻止活性氧引起的生物大分子損傷，且對自由基誘發的生物大分子損傷起保護作用[14-15]。研究顯示，黃酮還具有阻止細胞退化、延緩衰老、降血壓、降血糖、降血脂、提高機體免疫力及減輕癌癥發生等作用[16-17]，在心腦血管疾病及癌癥的治療中得到廣泛應用[18-19]。本研究以長白山山核桃殼為原料，采用超聲波輔助提取粗提物，經大孔樹脂柱層析，得到梯度洗脫物；采用分光光度法，測定洗脫物的黃酮純度，并檢測洗脫物對ABTS、DPPH、羥自由基的清除能力及還原鐵離子能力，篩選出提取長白山山核桃殼抗氧化物黃酮的方法，為山核桃殼的進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山山核桃，采摘于吉林省延邊朝鮮族自治州和龍市南崗林區；ABTS、DPPH，Sigma公司產品；蕓香苷，中國藥品生物制品檢定所生產；維生素C，國藥集團化學試劑有限公司生產；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、過硫酸鉀、FeSO4·7H2O、30%過氧化氫溶液、水楊酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸，均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA1104型分析天平，上海天平儀器廠生產；U-3900型紫外可見分光光度計，日本日立公司生產；離心機，中國上海生產；N-1001旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司生產；KQ-500DE型醫用數控超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程 山核桃殼→粉碎→過篩→乙醇浸泡→超聲波輔助提取→抽濾→減壓濃縮→大孔樹脂梯度洗脫→真空冷凍干燥→純度分析→測抗氧化活性。

1.3.2 大孔樹脂預處理 采用酸堿法[20]。用體積分數為95%的乙醇浸泡，使其充分溶脹24 h，濕法裝柱；用2 BV 95%乙醇流動洗脫，至乙醇流出液與蒸餾水1 ∶5混合、不呈現白色渾濁并無有機溶劑異味為止；用蒸餾水將乙醇洗凈；用酸堿法對大孔樹脂進行處理，用2 BV 5%鹽酸溶液緩慢通過樹脂層，并浸泡3 h，用大量蒸餾水洗至pH值為中性；用2 BV 5%氫氧化鈉溶液緩慢通過樹脂層，并浸泡3 h，用蒸餾水洗至流出液pH值為中性。將樹脂浸泡于水中，備用。

1.3.3 樣品的提取 山核桃殼粉末與60%乙醇混合，250 W、50 ℃超聲50 min，抽濾，粗提液50 ℃減壓濃縮，得到粗提濃縮液；將粗提濃縮液上大孔樹脂柱，蒸餾水除雜質，用30%、50%、70%乙醇梯度洗脫，分別收集洗脫物；減壓濃縮，真空冷凍干燥，得到純化產品的凍干粉。

1.3.4 蕓香苷標準曲線的繪制 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[6]。精確稱取蕓香苷標準品20 mg，用60%乙醇溶解并在100 mL 容量瓶中定容，搖勻，靜置；分別向7支試管中加0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL蕓香苷溶液，再加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min；加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min；加入5 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻；加入60%乙醇定容至10 mL，靜置25 min；用分光光度法測量溶液在波長509 nm處的吸光度，以蕓香苷濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.5 黃酮純度的測定 稱取適量凍干粉溶于60%乙醇溶液中，按蕓香苷標準曲線方法測定黃酮的濃度，獲得黃酮純度，計算公式為：黃酮純度=V×N×C/m×100%。式中，V表示溶液體積，單位為mL；N表示稀釋倍數；C為根據標準曲線計算的濃度；m表示凍干粉質量，單位為mg。

1.3.6 山核桃殼梯度洗脫物的抗氧化活性測定

1.3.6.1 清除ABTS自由基能力 參照程超等的方法[21]，將50 mL 2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液和7.4 mmol/L ABTS溶液混合，室溫避光24 h，制備成ABTS儲備液，4 ℃避光儲存，備用；現用現稀釋，使儲備液在波長為734 nm處的吸光度為0.700±0.020，即為ABTS工作液；取ABTS工作液3.80 mL，加入不同濃度的洗脫物樣液或維生素C、BHT溶液 0.20 mL，室溫避光放置10 min，于734 nm處測定吸光度，計算清除率。清除率=1-（D1-D2）/D0×100%。計算對ABTS自由基的清除率時，D1為ABTS工作液+黃酮樣液的吸光度；D2為蒸餾水+黃酮樣液的吸光度值；D0為ABTS工作液+60%乙醇的吸光度值。

1.3.6.2 清除DPPH自由基能力 參照李波等的方法[22]，配制0.15 mmol/L的DPPH儲備液，4 ℃避光儲存；現用現稀釋，使其在517 nm處的吸光度為0.700±0.020，即為DPPH工作液；取DPPH工作液2 mL，加入不同洗脫物樣液或維生素C、BHT溶液 2 mL，室溫避光靜置30 min，在517 nm處測吸光度D1，D2為無水乙醇代替DPPH工作液的吸光度，D0為60%乙醇代替洗脫物樣液的吸光度，計算清除率。

1.3.6.3 清除羥自由基能力 參照周麗萍的等方法[23]，取6 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1 mL，加入6 mmol H2O2溶液1 mL，混勻；加入1 mL不同洗脫物樣液或維生素C溶液，混勻靜置10 min；加入6 mmol/L 水楊酸鈉溶液1 mL，37 ℃水浴30 min；4 000 r/min離心10 min，取上清液在510 nm處測吸光度值D1，水楊酸鈉溶液代替蒸餾水測得的吸光度值為D2，60%乙醇代替洗脫物樣液的吸光度為D0，計算清除率。

1.3.6.4 還原鐵離子能力 參照Wang等的方法[24]，向試管中加入洗脫物樣液或維生素C、BHT溶液0.5 mL，再分別加入pH值為6.6的磷酸緩沖液，2.5 mL 5%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴20 min；冷水降溫，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻，4 000 r/min離心10 min；取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵，靜置10 min；在波長700 nm處測定吸光度值D1，以60%乙醇代替提取液的吸光度值為D0。還原鐵離子能力計算公式為：總還原力=D1-D0。

1.4 曲線擬合與分析

采用CurveExpert 1.4 軟件進行曲線擬合與數據分析。

2 結果與分析

2.1 蕓香苷標準曲線

采用NaNO2-Al（NO3）3法繪制蕓香苷標準曲線，得曲線方程為：y=0.014x+0.016 7，r2=0.998 5（圖1）。

2.2 黃酮純度分析

由表1可知，提取山核桃殼的黃酮純度高低依次為：30%洗脫物>50%洗脫物>粗提物>70%洗脫物。

2.3 山核桃殼洗脫物及維生素C、BHT的抗氧化活性

2.3.1 清除ABTS自由基的能力 ABTS自由基常被用于衡量天然產物的總抗氧化能力。由圖2可知，山核桃殼梯度洗脫物及抗氧化物質維生素C、BHT均對ABTS自由基有一定的清除作用，且隨濃度增加，清除能力增強。由表2可知，洗脫物及抗氧化物質維生素C、BHT的半抑制濃度IC50值大小為70%洗脫物>50%洗脫物>30%洗脫物>BHT>維生素C，則其清除ABTS自由基的能力大小為維生素C>BHT>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物，山核桃殼乙醇梯度洗脫物對ABTS自由基有一定的清除作用，但清除作用低于維生素C和BHT，其中，30%洗脫物的清除能力最強。

2.3.2 清除DPPH自由基的能力 由圖3、圖4、圖5可知，山核桃殼梯度洗脫物及維生素C、BHT均對DPPH自由基有一定的清除作用，且隨濃度增加，清除能力增強。由表3可知，IC50值大小依次為BHT>70%洗脫物>50%洗脫物>30%洗脫物>維生素C，則清除能力大小依次為維生素C>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物>BHT，山核桃殼乙醇梯度洗脫物對DPPH自由基的清除作用低于維生素C但高于BHT，這表明山核桃殼乙醇梯度洗脫物具有明顯的DPPH自由基清除能力，其中以30%洗脫物的清除能力相對最強。

2.3.3 清除羥自由基的能力 由圖6可知，長白山山核桃殼不同濃度的乙醇梯度洗脫物及維生素C均對羥自由基有一定的清除作用，且隨濃度增加，清除能力增強。由表4可知，IC50值大小依次為70%洗脫物>50%洗脫物>30%洗脫物>維生素C，則清除能力大小依次為維生素C>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物，山核桃殼乙醇梯度洗脫物對羥自由基的清除作用明顯低于維生素C。

2.3.4 還原鐵離子的能力 由圖7可知，還原鐵離子能力大小依次為維生素C>BHT>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物，以山核桃殼30%洗脫物的還原鐵離子能力相對最強，但均低于維生素C和BHT。

3 結論

以長白山山核桃殼為原料，采用超聲波輔助提取粗提物，經大孔樹脂柱層析，選擇30%、50%、70%乙醇梯度洗脫，將洗脫物真空冷凍干燥，制得洗脫物凍干粉；采用分光光度法，測定洗脫物黃酮純度；以維生素C、BHT為對照，研究洗脫物對ABTS、DPPH、羥自由基的清除能力和鐵離子的還原能力。結果表明，粗提物黃酮的純度為19.16%，30%洗脫物、50%洗脫物、70%洗脫物提取黃酮的純度分別為56.90%、47.00%、18.47%；清除ABTS自由基能力大小依次為維生素C>BHT>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物，清除DPPH自由基的能力大小依次為維生素C>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物>BHT，清除羥自由基能力大小依次維生素C>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物，還原鐵離子能力大小依次為維生素C>BHT>30%洗脫物>50%洗脫物>70%洗脫物。這表明黃酮純度越高，其抗氧化活性越強，山核桃殼乙醇梯度洗脫物的抗氧化活性與黃酮純度呈正相關，其中，以30%洗脫物的抗氧化性最強，可用于后續功能作用或生物活性的深入研究。

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