毒死蜱降解菌的篩選及降解特性

李珣+尚建超+藍瀟+田學軍+沈登榮

摘要：為尋找有機磷農藥的快速降解途徑，采集污染嚴重的土樣，以毒死蜱為底物，采用梯度馴化法篩選得到菌株CJC-3，并研究該菌株對毒死蜱及其他4種常用有機磷農藥（敵敵畏、辛硫磷、乙酰甲胺磷、草甘膦）的降解特性。結果表明，CJC-3對毒死蜱的最佳降解條件：溫度為28 ℃，培養時間為48 h，農藥濃度為2 000 mg/L，降解率達76.03%。優化CJC-3對其他有機磷農藥的降解條件后，降解率分別為敵敵畏50.47%、辛硫磷65.29%、乙酰甲胺磷26.15%、草甘膦36.12%，表明該菌株對有機磷殺蟲劑和有機磷除草劑均有一定的降解效果，適用于有機磷農藥的普遍降解。

關鍵詞：毒死蜱；有機磷農藥；降解菌；降解特性

中圖分類號： X592 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0479-03

據報道，2013年我國農藥總使用量達到12萬t，其中有機磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類農藥使用量分別為86 300、5 800、3 600 t[1]。有機磷類農藥已成為三大支柱之一，在世界的農藥市場上有著十分重要的地位[2]。其中，毒死蜱是當今有機磷農藥中的代表性品種，現在我國約有15%的農藥廠家擁有毒死蜱相關產品，按每個品種的平均原藥需求量10～15 t 計算，我國約有6 000～9 000 t的原藥需求量[3]。農藥的使用在帶來農業增產、農民增收的同時，農藥殘留已成為嚴重危害人類生命健康的主要因素之一，如何消除其對生態環境造成的不良影響就成為了不得不考慮的問題。目前根據國內外的研究，認為微生物降解是解決其殘留污染的有效途徑[4]，如董慶龍等通過改良定向培育法，馴化篩選到毒死蜱降解菌CAS17，當毒死蜱濃度為100 mg/L 以下時，降解率可達到67%左右[5]。馮發運等從農藥廠廢液池旁采集小飛蓬植物，提取植物汁液后以毒死蜱作為唯一碳源的無機鹽培養基連續篩選，得到1株高效降解菌XFP-gy，當毒死蜱濃度為10 mg/L時，9 d可完全降解毒死蜱，實現無殘留[6]。本試驗通過馴化、篩選得到毒死蜱降解菌，并探索其降解特性以提高對毒死蜱的降解率，同時還研究了該菌株對其他常用有機磷農藥包括殺蟲劑和除草劑的降解效果，期望為有機磷農藥的廣泛修復提供一定參考[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 云南曲靖蔡家沖復合化肥廠周邊土壤，采用五點采樣法。

1.1.2 培養基 （1）基本培養基：葡萄糖2.5 g、檸檬酸三鈉0.5 g、（NH4）2SO4 0.1 g、KH2PO3 3.0 g、K2HPO3 7.0 g、MgSO4 0.1 g、H2O 500 mL、瓊脂10.0 g，121 ℃高壓蒸氣滅菌30 min。（2）無機鹽培養基：MgSO4 0.2 g、NH4NO31.0 g、K2HPO30.5 g、CaCl2 0.1 g、KH2PO3 0.5 g、NaCl0.2 g、MnSO4 痕量、FeCl2 痕量、H2O 1000.0 mL，121 ℃高壓蒸氣滅菌30 min。（3）富集培養基：蛋白胨 10.0 g、氯化鈉 5.0 g、牛肉膏 5.0 g、瓊脂 20.0 g、H2O 1000.0 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min[8-10]。

1.2 方法

1.2.1 菌種馴化 取5.0 g土樣，用含毒死蜱4 mg/L的無機磷培養基于30 ℃、170 r/min條件下振蕩培養48 h；取10%轉接至新鮮無機磷培養基中并將農藥濃度提高1倍，再繼續培養48 h；隨后加入5 mL含有機磷農藥的原液，培養5個周期，共240 h [9-10]。

1.2.2 菌種分離純化 取100 μL馴化得到的土壤懸濁液涂布于基本培養基表面，經培養后觀察，挑取不同形態的菌落，分離純化。配置毒死蜱濃度為8 mg/mL選擇培養基，將分離純化后的降解菌菌株接種于選擇培養基上，保存備用[9-10]。

1.2.3 CJC-3菌株形態特征和主要生理生化特征 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》對CJC-3的菌落形態特征及主要生理生化特征進行試驗和觀察記錄[11-12]。

1.2.4 CJC-3對毒死蜱的降解特性研究

分別研究培養時間、溫度、毒死蜱濃度、接種量對CJC-3降解的影響因素，以確定其最佳降解條件與最大降解率。設置時間梯度分別是6、12、18、24、36、48、60、72 h；溫度梯度分別是25、28、30、35、40 ℃；毒死蜱農藥濃度分別是500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L；接種量分別為0.5%、1%、5%、10%、20%。按上述條件將培養管置于恒溫搖床中170 r/min培養，得出最佳降解條件，利用鉬銻抗法測定復合菌劑的降解率[9-10，13]。

1.2.5 CJC-3對其他常用有機磷農藥的降解特性研究

分別設置培養時間24、36、48、60、72 h；培養溫度20、24、28、32、36 ℃；敵敵畏濃度20、40、60、80、160、240、320、400、480 mg/L；辛硫磷濃度100、140、180、220、260、300、340、380 mg/L；乙酰甲胺磷濃度60、120、180、240、300、360、420、480、540 mg/L；草甘膦濃度40、80、120、160、200、240、280、320 mg/L。將培養管置于恒溫搖床中170 r/min培養，測定降解效率，得出最佳降解條件[7，10，13]。

2 結果與分析

2.1 降解菌的分離純化

經過分離、純化得到1株高效降解菌，編號為CJC-3。

2.2 CJC-3菌株形態特征和主要生理生化特征

經初步生理生化鑒定后，CJC-3于選擇培養基上的單菌落呈圓形，表面光滑濕潤，菌體隆起，邊緣整齊不透明。初生時為白色，生長時間較長后為乳白色，菌體挑取時有黏著性，劃線時不易劃開，菌體常多個連在一起，呈短桿狀，菌體平均直徑為4.70 μm，革蘭氏反應呈陽性，存在芽孢和莢膜，為好氧菌。

2.3 CJC-3菌株對毒死蜱的降解特性

2.3.1 毒死蜱降解時間優化

如圖1所示，當降解時間較短時，CJC-3菌株數量少、生長緩慢，菌株降解活性低，隨著降解時間的延長，菌體利用培養基的營養成分大量繁殖，CJC-3菌株對于毒死蜱的降解能力也逐漸增強、降解率明顯上升，于48 h時降解率達到最大；在48 h后，可能由于營養成分的消耗、降解后的有機磷被菌體重新利用、菌體老化等原因，降解率呈現下降趨勢，當培養時間為48 h時，降解率最高，為57.01%。

2.3.2 毒死蜱降解溫度優化

如圖2所示，CJC-3降解菌株在低溫和高溫時降解率低至18.90%，分析可能因高溫和低溫環境下抑制酶活性，不能有效地降解毒死蜱，在溫度為28 ℃時降解率最高，溫度達30 ℃時降解率驟降。最終溫度優化試驗結果顯示：當降解溫度為28 ℃時，降解率最高，為58.80%。

2.3.3 毒死蜱濃度優化 如圖3所示，低濃度毒死蜱培養時，CJC-3降解菌株菌體降解能力弱，當毒死蜱濃度自500 mg/L 逐漸上升至2 000 mg/L時，降解率達到最高，當毒死蜱濃度再升高時，降解率下降，毒死蜱濃度優化試驗結果：CJC-3降解菌株在毒死蜱濃度為2 000 mg/L時，降解率最高，為65.85%。

2.3.4 降解菌最佳接種量 如圖4所示，CJC-3降解菌株接種量為0.5%～5%時降解率迅速提升，接種量至5%后，繼續增加接種量降解率提升效率變化不明顯，因此最適接種量為5%。

綜合上述最優條件，在溫度28 ℃、培養時間48 h、農藥濃度為2 000 mg/L、接種量為5%（D600 nm=1）的條件下，CJC-3菌株的降解率最高值可達到76.03%。

2.4 CJC-3對其他常用有機磷農藥的降解特性

2.4.1 有機磷農藥濃度對CJC-3降解效果的影響

設置敵敵畏濃度分別是20、40、60、80、160、240、320、400、480 mg/L。如圖5所示，敵敵畏濃度在80 mg/L時CJC-3菌株降解敵敵畏效果最好，降解率為42.72%。

如圖6所示，辛硫磷濃度在260 mg/L時CJC-3菌株對辛硫磷的降解最好，為39.54%。

如圖7所示，乙酰甲胺磷濃度在240 mg/L時CJC-3菌株對乙酰甲胺磷的降解率最佳，為24.15%。

如圖8所示，草甘膦濃度在120 mg/L時CJC-3菌株對草甘膦的降解效果最佳，為15.32%。

綜合上述，農藥濃度對CJC-3菌株降解效果有顯著的影響。CJC-3菌株對這4種農藥的降解率，隨著農藥濃度的升高降解率逐漸升高，當農藥濃度達到最適濃度時，降解率達到最大，最后隨著農藥濃度升高而逐漸減小。當農藥濃度超過菌體所能承受的濃度后，菌體逐漸裂解死亡，降解率逐漸減小。

2.4.2 溫度對CJC-3降解效果的影響

每種有機磷農藥分別設置了5個溫度梯度：20、24、28、32、36 ℃，通過測定培養溫度對CJC-3菌株降解4種有機磷農藥的降解率變化和影響，如圖9所示。

CJC-3菌株在4種有機磷農藥中表現一致，在20～28 ℃ 之間隨著溫度升高而逐漸增大。在28 ℃時達到最大，在28～36 ℃之間隨著溫度升高而降低。在28 ℃下，4種農藥降解率分別為：草甘膦36.12%、敵敵畏41.54%、辛硫磷50.95%、乙酰甲胺磷26.15%。

2.4.3 培養時間對CJC-3降解效果的影響

分別測定4種有機磷農藥條件下，培養時間對CJC-3降解效果的影響。試驗結果表明，CJC-3菌株對草甘膦、敵敵畏、乙酰甲胺磷的降解率，隨著培養時間的增加降解率逐漸增大。在48 h降解率達到最大，分別為：草甘膦35.21%、敵敵畏50.47%、乙酰甲胺磷23.4%，之后隨著培養時間的增加降解率逐漸減小，辛硫磷在60 h降解率達到最大，為65.29%（圖10）。

3 結論與討論

以毒死蜱為底物，采用梯度馴化法篩選得到菌株CJC-3。通過降解特性研究，CJC-3對毒死蜱的最佳降解條件為：溫度28 ℃、培養時間48 h、農藥濃度為2 000 mg/L，降解率達76.03%。然而，在實際農業生產中，為保證有效防治有害生物，常常施用多種農藥。為更好地發揮CJC-3降解菌的廣泛應用性，試驗還研究了CJC-3對敵敵畏、辛硫磷、乙酰甲胺磷3種有機磷殺蟲劑以及1種有機磷除草劑草甘膦的降解特性。結果表明，CJC-3菌株對4種農藥的降解率從大到小依次為：辛硫磷65.29%、敵敵畏50.47%、草甘膦36.12%、乙酰甲胺磷24.15%，證明該菌株對有機磷農藥具有廣泛的降解特性，除可降解有機磷殺蟲劑外，對有機磷除草劑也有一定降解作用，可作為農藥殘留控制的新途徑，為修復有機磷農藥污染的土壤提供了有效參考。

參考文獻：

[1]李慧珍，韋燕莉，游 靜. 我國南方不同功能區域水體沉積物中常見農藥的分布及毒性風險[J]. 吉林大學學報：地球科學版，2015，45（1）：1508-1527.

[2]賀紅武. 有機磷農藥產業的現狀與發展趨勢[J]. 中國農藥，2008，30（6）：29-33.

[3]姜書凱. 毒死蜱產業發展現狀和前景[J]. 農化新世紀，2008（6）：23-24.

[4]鄭永權. 農藥殘留研究進展與展望[J]. 植物保護，2013，39（5）：90-98.

[5]董慶龍，劉嘉芬，安 淼，等. 嗜鐵細菌CAS17的分離鑒定及其對毒死蜱的降解特性研究[J]. 環境科學學報，2014，34（1）：136-142.

[6]馮發運，朱 宏，李俊領，等. 一株小飛蓬內生毒死蜱降解菌的分離鑒定及其降解特性研究[J]. 農藥學學報，2015，17（1）：89-96.

[7]田連生，陳 菲. 多菌靈降解菌T8-2的分離及其降解條件研究[J]. 江蘇農業科學，2008（6）：271-274.

[8]曹 銳. 毒死蜱及TCP對生物DNA損傷和土壤微生物多樣性的影響[D]. 泰安：山東農業大學，2009.

[9]唐 亮. 降解有機磷農藥微生物的篩選及降解條件研究[D]. 重慶：西南大學，2008.

[10]明惠青. 有機磷農藥降解菌的篩選及降解特性研究[D]. 沈陽：沈陽農業大學，2006.

[11]布瑞德. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 8版. 北京：科學出版社，1984.

[12]葉 磊，楊學敏. 微生物檢測技術[M]. 北京：化學工業出版社，2009：141-142.

[13]李依韋，銀 玲，薛蘭蘭. 甲磺隆降解菌的降解特性及降解體系[J]. 江蘇農業科學，2011，39（6）：614-616.