復(fù)合菌發(fā)酵海藻渣降解甲醛殘留工藝研究

蘇東海+魏玉西+陳應(yīng)運(yùn)+陳婷婷

摘要：以海藻渣為研究對(duì)象，使用自制復(fù)合菌劑進(jìn)行發(fā)酵，以甲醛含量作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明，復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻渣最佳工藝條件為培養(yǎng)基組成為海藻渣100 g、麩皮20 g、豆粕25 g，發(fā)酵溫度為45 ℃，發(fā)酵時(shí)間為10 d，復(fù)合菌劑接菌量為5%，海藻渣采用優(yōu)化工藝經(jīng)復(fù)合菌發(fā)酵后甲醛含量可由367.88 mg/kg降至57.14 mg/kg。

關(guān)鍵詞：海藻渣；復(fù)合菌；發(fā)酵；甲醛

中圖分類(lèi)號(hào)： S188+.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0495-03

我國(guó)海藻養(yǎng)殖量居世界首位。海藻工業(yè)產(chǎn)值在海洋經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。海藻營(yíng)養(yǎng)豐富，具有藥用、食用等多種用途[1]。海藻渣是褐藻（海帶、巨藻等）經(jīng)過(guò)一系列工序提取海藻膠、碘、甘露醇等產(chǎn)品后所剩余的廢棄物[2]。研究發(fā)現(xiàn)，海藻渣內(nèi)仍有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）和粗纖維，且其蛋白質(zhì)組成中精氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量較高，因而有可能成為食品原料或動(dòng)物飼料的組成成分[3]。盡管如此，由于海藻加工過(guò)程中浸泡工序使用甲醛作為固色劑[4]，致使藻渣因甲醛殘留高，加之海藻渣粗纖維含量高達(dá)35%以上，海藻渣不宜直接用于動(dòng)物飼料。目前，我國(guó)海藻加工企業(yè)將大部分海藻渣經(jīng)簡(jiǎn)單漚制后用作肥料，對(duì)農(nóng)作物具有一定的營(yíng)養(yǎng)、抗病、增產(chǎn)的功效[5-6]。但是，現(xiàn)有海藻渣的利用效率不高，亟待進(jìn)行高值化利用研究。

利用微生物發(fā)酵，改善食物的口感、風(fēng)味，甚至生產(chǎn)出高值化功能性產(chǎn)品，已經(jīng)深入人類(lèi)生活的諸多方面[7-12]。微生物發(fā)酵飼料早在20世紀(jì)90年代就在我國(guó)被廣泛應(yīng)用，分別經(jīng)歷了糖化飼料、酵母飼料以及如今的微生物發(fā)酵飼料發(fā)展階段[13]。由于海藻渣組成的特殊性，將其作為飼料的研究備受關(guān)注。韓玲證實(shí)了海藻粉作為飼料添加劑的可行性[14]。然而，采用海藻渣作為飼料添加劑，尚面臨海藻生產(chǎn)過(guò)程中因使用甲醛造成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變（交聯(lián)）問(wèn)題，從而影響其作為動(dòng)物飼料蛋白質(zhì)的吸收利用。本研究利用自制復(fù)合菌劑，以甲醛含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)海藻渣發(fā)酵工藝進(jìn)行探索，以期為將海藻渣作為動(dòng)物飼料添加劑利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海藻渣、麩皮、紅糖、豆粕均為市售。復(fù)合菌劑由青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院自制。甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液從中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院購(gòu)置。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；721G型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密儀器有限公司）；101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料處理 海藻渣為烘干的顆粒狀固體，過(guò)20目篩，放置陰涼干燥處備用。

自制復(fù)合菌劑配制：將無(wú)菌水、紅糖、菌粉按質(zhì)量比15 ∶1 ∶0.1 比例配制，30～40 ℃活化5～7 d后，經(jīng)pH試紙測(cè)試顯酸性則為活化成功，密封備用。

1.3.2 復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻渣的工藝

參照文獻(xiàn)[15-16]中復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻渣的工藝，并加以改進(jìn)。取100 g海藻渣，分別添加一定量的麩皮、豆粕作為碳源、氮源，混勻后加入稀釋后的菌液，添加量以握手成團(tuán)、松開(kāi)即散的程度為準(zhǔn)。在一定溫度下厭氧培養(yǎng)、固態(tài)發(fā)酵，直至發(fā)酵品發(fā)出濃郁酒曲香味為發(fā)酵終點(diǎn)。

1.3.3 甲醛含量測(cè)定

采用乙酰丙酮分光光度法對(duì)甲醛含量進(jìn)行檢測(cè)[17-18]。

乙酰丙酮溶液制備：將乙酸銨25 g、冰乙酸3 mL、乙酰丙酮溶液0.25 mL試劑定容至100 mL水中。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制10.4 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入到25 mL 具塞比色管中，加水至10 mL，分別加入2 mL乙酰丙酮溶液，混勻后于100 ℃水浴中加熱15 min。取出冷卻后，于波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)處理重復(fù)3次。以甲醛濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

樣品處理：稱(chēng)取樣品15 g，用100 mL 50 ℃蒸餾水洗入250 mL容量瓶中，加入10 mL冰醋酸，85 ℃水浴1 h，取出冷卻至室溫，加入亞鐵氰化鉀溶液2.5 mL、乙酸鋅溶液2.5 mL以除去蛋白質(zhì)，以蒸餾水定容，搖勻靜置，去除上層脂肪。經(jīng)過(guò)濾，舍棄30 mL初濾液，再過(guò)濾得待測(cè)濾液。

顯色反應(yīng)：取樣品濾液2 mL于比色管中，定容至10 mL，加入乙酰丙酮溶液2 mL于100 ℃水浴中反應(yīng)15 min，取出冷卻，于波長(zhǎng)412 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甲醛含量：樣品中甲醛含量（mg/kg）=標(biāo)準(zhǔn)曲線算得甲醛含量（μg/mL）×125/15。

1.3.4 復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻渣的單因素試驗(yàn) 以乙酰丙酮法測(cè)定發(fā)酵樣品甲醛含量，以此評(píng)價(jià)發(fā)酵效果并確定單因素?cái)?shù)值范圍。

1.3.4.1 麩皮添加量的選擇 取海藻渣100 g，分別添加5、10、15、20、25 g麩皮，20 g豆粕，接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的菌液，調(diào)節(jié)濕度后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵6 d。

1.3.4.2 豆粕添加量的選擇 取海藻渣100 g，添加20 g麩皮，分別添加10、15、20、25、30 g豆粕，接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的菌液，調(diào)節(jié)濕度后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵6 d。

1.3.4.3 接種量的選擇 取海藻渣100 g，添加20 g麩皮，25 g 豆粕，分別接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1、2、3、4、5、6%的菌液，調(diào)節(jié)濕度后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵6 d。

1.3.4.4 發(fā)酵溫度的選擇 取海藻渣100 g，添加20 g麩皮，25 g豆粕，接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的菌液，調(diào)節(jié)濕度后分別放入29、33、37、41、45 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵6 d。

1.3.4.5 發(fā)酵時(shí)間的選擇 取海藻渣100 g，添加20 g麩皮，25 g豆粕，接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的菌液，調(diào)節(jié)濕度后放入41 ℃恒溫培養(yǎng)箱分別發(fā)酵4、6、8、10、12 d。

1.3.5 正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在復(fù)合菌接種量為5%條件下，選用L9（34）正交試驗(yàn)表，綜合考察麩皮添加量、豆粕添加量、發(fā)酵溫度、時(shí)間對(duì)復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻渣的影響。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻渣中甲醛含量的測(cè)定結(jié)果

按照“1.3.3”節(jié)中的方法制作甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程：y=0.021x+0.006（r2 = 0.999 3）。測(cè)得原海藻渣中甲醛含量為367.875 mg/kg。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 麩皮添加量對(duì)甲醛含量的影響 由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，海藻渣發(fā)酵品發(fā)酵前后甲醛含量的差值隨麩皮添加量增加而增加，當(dāng)麩皮添加量為15%時(shí)，經(jīng)復(fù)合菌發(fā)酵的海藻渣中甲醛含量下降最多，隨后下降量減少。這可能是因?yàn)辂熎ぬ砑恿窟^(guò)多時(shí)，復(fù)合菌過(guò)多地利用麩皮，而減少了對(duì)海藻渣的降解。

2.2.2 豆粕添加量對(duì)甲醛含量的影響 由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，海藻渣發(fā)酵品發(fā)酵前后甲醛含量差值隨豆粕添加量增加而增加，當(dāng)豆粕添加量為20%時(shí)，經(jīng)復(fù)合菌發(fā)酵的海藻渣中甲醛含量下降最多，隨后下降量減少。這可能是因?yàn)槎蛊商砑恿窟^(guò)多時(shí)，復(fù)合菌更多地分解豆粕，減少了對(duì)海藻渣的降解。

2.2.3 復(fù)合菌劑接種量對(duì)甲醛含量的影響 由圖3可知，海藻渣發(fā)酵品甲醛含量隨著復(fù)合菌劑接種量的增加而逐漸降低，當(dāng)復(fù)合菌劑接種量超過(guò)5%后，發(fā)酵品中甲醛含量不再有明顯降低，這可能是因?yàn)閺?fù)合菌劑達(dá)到了最大發(fā)酵接種量。

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)甲醛含量的影響 由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，海藻渣發(fā)酵品甲醛含量隨發(fā)酵溫度的升高而降低，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)41 ℃時(shí)，發(fā)酵品中甲醛含量最低；當(dāng)發(fā)酵溫度繼續(xù)升高，發(fā)酵品中甲醛含量隨之增多。說(shuō)明41 ℃為復(fù)合菌降解甲醛的最佳溫度，這可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高抑制了復(fù)合菌生長(zhǎng)及分解作用，不利于海藻渣降解。

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)甲醛含量的影響 由圖5可知，海藻渣發(fā)酵品中甲醛含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而降低，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)10 d 時(shí)，發(fā)酵品中甲醛含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)不再明顯降低，這可能因?yàn)榘l(fā)酵產(chǎn)物抑制了復(fù)合菌生長(zhǎng)，降低了其分解海藻渣的能力。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2中的極差（R）值可知，各因素對(duì)甲醛含量影響的大小順序依次為發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>豆粕添加量>麩皮添加量。通過(guò)分析k1、k2、k3可知，最優(yōu)工藝組合為A3B3C3D2，在該條件下，發(fā)酵的海藻渣樣品，甲醛含量由未經(jīng)發(fā)酵的367.88 mg/kg降至發(fā)酵后的57.14 mg/kg，該結(jié)果均小于9組正交試驗(yàn)結(jié)果，證明該工藝所得最優(yōu)組合的可靠性。

3 結(jié)論與討論

以海藻加工廢渣為原料，輔以麩皮、豆粕為碳源、氮源，以復(fù)合菌為發(fā)酵菌劑進(jìn)行發(fā)酵，開(kāi)展單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：在海藻渣中添加20%麩皮和25%豆粕，在45 ℃下發(fā)酵10 d，發(fā)酵產(chǎn)物中甲醛含量最低，甲醛含量可由367.88 mg/kg 降至57.14 mg/kg。

本研究通過(guò)復(fù)合菌發(fā)酵海藻渣，降解其生產(chǎn)加工過(guò)程中變性的纖維素及蛋白質(zhì)，釋放并利用海藻加工時(shí)大量殘留的甲醛，該工藝方法具有可行性。本研究為海藻渣應(yīng)用于牲畜、魚(yú)類(lèi)飼料或其他高值化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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