肝細胞性肝癌超聲造影定量分析與P53表達相關性研究

馬 振，楊 紅，何 云，盧景寧，彭金波，吳玉泉

（1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院超聲科，廣西 南寧 530023；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021）

肝細胞性肝癌超聲造影定量分析與P53表達相關性研究

馬 振1，楊 紅2，何 云2，盧景寧2，彭金波2，吳玉泉2

（1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院超聲科，廣西 南寧 530023；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021）

目的：探討肝細胞性肝癌（HCC）中突變型P53蛋白表達與超聲造影定量分析參數的相關性。方法：回顧性分析57 例HCC患者超聲造影定量分析的各項參數，取得腫瘤組織并用免疫組化染色的方法測定P53蛋白的表達，分析它與造影定量分析參數的相關性。結果：①P53的陽性表達率為54.3%（31/57）。②在P53陽性表達組和陰性表達組中峰值強度、平均渡越時間、達峰時間之間無顯著差異（P＞0.05），而上升斜率、流出時間之間有顯著差異（P＜0.05）。③P53的陽性表達與峰值強度、平均渡越時間、達峰時間無明顯相關性（P＞0.05）；P53的陽性表達與上升斜率呈正相關，r=0.377（P＜0.05），與流出時間呈負相關， r=-0.410（P＜0.05）。結論：HCC超聲造影參數的上升斜率、流出時間與突變型P53蛋白的表達之間存在一定的相關性，通過時間-強度曲線，可以無創性的評估P53的表達。

肝腫瘤；癌，肝細胞；基因，p53；超聲檢查，多普勒，彩色

肝細胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝臟惡性腫瘤[1]。肝癌發病率位居全國腫瘤發病率的第2位，每年我國死于肝癌的人數約占全球總人數的45%[2]。突變型P53基因在HCC的形成過程中發揮著重要作用，通過多條信號轉導通路調控HCC的發生發展，與腫瘤的侵襲、轉移密切相關[3]。本研究應用超聲造影（Contrast-enhanced ultrasound，CEUS）定量分析參數與P53基因表達的相關性進行分析，對相關超聲造影定量參數進行篩選，擬通過無創的超聲造影定量分析的方法評估P53基因的表達，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2012年1月—2014年12月在廣西醫科大學第一附屬醫院行CEUS檢查的57例HCC患者。其中男37例，女20例，年齡21～75歲，平均（45.6±13.7）歲，單發病灶43例，多發病灶14例，多發病灶選取其中最大的一個病灶進行觀察。病灶最大直徑1.5～11.4 cm，平均（4.2±1.5）cm，病灶經手術或肝穿刺活檢病理證實。

1.2 儀器與方法

1.2.1 CEUS檢查

使用GE-LOGE9超聲診斷儀，凸陣探頭，頻率1～5MHz。機械指數0.17～0.19，超聲造影劑使用SonoVue（Bracco公司），使用前瓶內注入生理鹽水5mL，振蕩直到凍干粉完全分散。先常規進行二維超聲檢查，確認目標病灶后先對病灶的大小、內部回聲、邊界、與周圍組織的關系進行觀察，然后固定探頭位置不移動，切換至低機械指數造影模式，囑患者平靜呼吸，通過置于肘前靜脈的留置針快速推注1.5mL微泡混懸液。推注造影劑的同時啟動超聲儀上的計時器，觀察造影過程120 s并以DICOM格式存儲動態圖像。

1.2.2 分析軟件

使用TomTec公司開發的SonoLiver CAP軟件對造影動態影像資料進行定量分析，生成時間-強度曲線（Time-intensity curve，TIC），獲取能動態反應血流灌注的各項參數。

1.2.3 SonoLiver CAP軟件定量分析方法

在造影圖像上描畫三個感興趣區域（Regions of interest，ROI）：①肝臟切面ROI（藍色邊框），此為病灶所在區域的肝臟切面；②病灶ROI（綠色邊框），此區域為被分析病灶，ROI描畫輪廓不小于病灶的50%；③參考ROI（黃色邊框），選取在病灶周圍與病灶同等深度及大小的肝實質，避開大血管及囊性或壞死區域（圖1）。運用SonoLiver CAP軟件自帶的呼吸補償校正功能，盡量減少因呼吸或者探頭移動對數據或圖像產生的影響。

本研究中獲得的參數包括：峰值強度（Maximum intensity，IMAX）：最高灌注強度時病灶ROI與參考ROI的百分比；達峰時間（Time to peak，TTP）：造影劑從開始計時到達峰值強度的時間；平均渡越時間（Mean transit time，mTT）：從開始時間至TIC下降至最高強度值一半的時間；上升斜率（Rising slope，RS）：IMAX/TTP；流出時間（Washout time，WT）：從最高峰值強度到病灶ROI曲線與參考ROI曲線相交點的時間（圖2）。

圖1a HCC常規二維超聲圖。 圖1b HCC ROI示意圖：肝臟切面ROI（藍色邊框）；病灶區域ROI（綠色邊框）；參考區域ROI（黃色邊框）。 圖2 時間-強度曲線各參數示意圖。Figure 1a. Two dimensional ultrasonogram of HCC. Figure 1b. ROI illustration map:ROI(blue frame)on liver section,the lesion area ROI(green border)and the reference area ROI(yellow border).Figure 2.Time intensity curve diagram with all parameters.

1.3 病理學方法

1.3.1 樣本采集

所有病例均在超聲造影后1周內行手術切除腫瘤或者穿刺活檢，術后標本及時送病理檢查，甲醛固定后，選取腫瘤周邊組織標本，常規脫水后石蠟包埋。蠟塊連續切片張，每張厚4μm，作免疫組化。

1.3.2 檢測試劑

P53免疫組化的染色采用標準免疫組化S-P法，鼠抗人P53單克隆抗體購自福州邁新生物技術公司，即用型免疫組織化學超敏Ultrasensitive S-P試劑盒采用福州邁新生物技術有限公司的產品。空白對照PBS以代替一抗。

1.3.3 檢測方法

由一名具有15年以上臨床經驗的病理學專家在不知道病理診斷結果的情況下，分析P53的表達水平。P53陽性計數以細胞核染色呈棕黃色為標準。高倍鏡（×400）下隨機計數5個視野，每個視野200個細胞，當陽性細胞比例≥10%記錄為P53表達陽性，＜10%記錄為陰性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件包對數據進行統計描述和分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩計量資料間比較采用t檢驗。兩種非正態分布指標的相關性分析采用Spearman秩相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

所有病例均順利完成超聲造影檢查和定量分析及P53表達檢測。

病理分析結果：P53陽性表達組31例（54.3%），陰性表達組26例（45.6%）。

P53陽性組和陰性組CEUS參數的差異：在P53陽性組和陰性組中，IMAX、TTP、mTT在兩組間無統計學差異。而RS、WT均有統計學差異（P＜0.05）（表1，圖3～5）。P53陽性組RS較陰性組大，說明陽性組造影劑流入速度較快；P53陽性組WT較陰性組短，說明陽性組流出時間較短，病灶很快變為低增強。

表1 P53表達與超聲造影定參數的關系

圖3 P53不同表達時造影參數的差異。Figure 3. Differences in imaging parameters with different P53 expression.

圖4 P53陽性表達CEUS定量分析參數。圖4a：免疫組織化學P53染色陽性病理圖；圖4b：P53陽性表達HCC二維超聲圖像；圖4c：P53陽性表達HCC造影和ROI區域；圖4d：P53陽性表達HCC造影定量分析TIC。Figure 4. CEUS quantitative parameters in positive expression of P53.Figure 4a:Immunohistochemical staining with positive P53 expression.Figure 4b: HCC two-dimensional ultrasonogram with positive P53 expression.Figure 4c:HCC CEUS and ROI setting with positive expression of P53.Figure 4d:Quantitative analysis of TIC with positive expression of P53.

圖5 P53陰性表達CEUS定量分析參數。圖5a：免疫組織化學P53染色陰性病理圖；圖5b：P53陰性表達HCC二維超聲圖像；圖5c：P53陰性表達HCC造影和ROI區域；圖5d：P53陰性表達HCC造影定量分析TIC。Figure 5. CEUS quantitative parameters in negative expression of P53.Figure 5a:Immunohistochemical staining with negative P53 expression.Figure 5b:HCC two-dimensional ultrasonogram with negative P53 expression.Figure 5c:HCC CEUS and ROI setting with negative expression of P53.Figure 5d:Quantitative analysis of TIC with negative expression of P53.

2.3 P53陽性表達與造影參數相關性分析

經過相關分析發現P53的陽性表達與IMAX、mTT、TTP無明顯相關性 （P＞0.05），P53的陽性表達與RS呈正相關，相關系數0.377（P＜0.05）（見表2），說明隨著P53陽性表達率的增加上升斜率增快，造影劑流入的速度增快。P53陽性表達與WT呈負相關，相關系數-0.410（P＜0.05），說明P53陽性表達率越高造影劑流出時間越短，消退越快。

表2 P53陽性表達與超聲造影參數相關性分析

3 討論

突變型P53基因的表達與多種惡性腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移密切相關[4]，它能通過激活蛋白激酶C誘導血管內皮生長因子（Vascular endothelial cell growth factor，VEGF）的表達，從而促進血管的生成[5]。腫瘤血管的生成在腫瘤的發展和演變過程中起著重要作用，HCC是富血供的腫瘤，癌細胞的快速生長及轉移都有賴于滋養血管不斷生長提供養分[6]。超聲造影劑是一種微米級的純血池造影劑，能夠反映腫瘤內微血管的分布和血流動力學情況，隨著超聲造影定量分析技術的發展，目前已能夠利用定量軟件獲得造影的相關參數,精確反映腫瘤病灶內微血管的灌注情況以及增強模式，從而對腫瘤進行診斷和評估。

劉廣健等[7]對121個HCC病灶的研究表明，腫瘤分化程度越差，造影增強消退時間也越短。我們的研究發現，P53陽性組和陰性組中RS、WT均有統計學差異。RS代表造影劑流入后到達峰值強度的速率，WT表示造影劑從峰值強度流出變為等增強的時間。P53陽性表達的造影模式呈現快進快出的模式，流入的速率較快，并且很快流出變為低增強。這是因為突變型P53基因通過多種機制影響腫瘤組織的生長，導致腫瘤的惡性程度增加，通過促進腫瘤血管的生成，腫瘤微血管密度增高，動靜脈瘺增多，門靜脈血供減少，肝動脈供血增多[8]，循環呈高動力狀態，使得造影劑流入和流出增快，所以RS增高、WT縮短。而P53陰性表達組以門靜脈血供為主，腫瘤組織血竇較豐富，造影劑微泡廓清緩慢，因此造影劑流入速率較慢，流出時間較長。

李振洲等[9]對37例乳腺癌患者的研究發現P53陽性組的峰值強度及曲線下面積增大，造影劑通過時間延長，與陰性組有顯著差異（P＜0.05）。認為乳腺癌超聲造影參數與P53表達之間有相關性。Pei等[10]對130例HCC患者的研究表明，WT在不同分化程度HCC組中有顯著性差異。認為WT能夠提示腫瘤的分化程度。我們通過對HCC超聲造影定量參數進行統計學相關性分析，發現其中的參數RS、WT與突變型P53的表達具有一定的相關性。隨著P53表達的增加，WT縮短，RS增高。拉孜等[11]研究發現，血清P53抗體表達率在低分化的HCC中明顯高于中高分化的HCC，血清P53抗體陽性率與腫瘤病理分化程度呈負相關。表明血清P53抗體的過表達是HCC細胞低分化、高轉移的生物學潛能標志。突變型P53會影響腫瘤的分化和血管的生成，導致腫瘤惡性程度增高，瘤內血管結構紊亂、密度增高、管徑增大，動靜脈瘺增多，這會導致造影劑流入速度增快，流出時間變短。因此HCC超聲造影參數WT、RS能夠反映P53的表達情況，可以無創性的評估P53基因的表達，有利于評估療效和估計預后。

本研究的局限性在于樣本的例數還比較少，病人來源僅僅局限于HCC，沒有包含其他類型的肝癌。同時超聲造影定量分析的感興趣區域和對照區域的選取不可避免的帶有一定的主觀性。在未來的研究中，應該提供更大的樣本和更多類型的腫瘤研究。

以往我們了解P53基因的表達只能通過手術或穿刺活檢等有創的手段獲得，而隨著超聲造影定量分析技術的發展，通過對HCC超聲造影定量分析參數上升斜率和流出時間的測定，可以無創和可重復評估腫瘤P53基因的表達，進而了解HCC的組織分化程度及預后，并且可以對抗腫瘤血管治療和基因治療的療效進行評估，對臨床治療HCC具有重要意義。

[1]Jemal A,Center MM,Ward E,et al.Cancer occurrence[J].Cancer Epidemiol,2009,471(1):3-29.

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[9]李振洲，羅長銳，方凡，等.乳腺癌超聲造影定性及定量分析與p53表達的相關性研究[J].中國臨床醫學影像雜志，2012，23（7）：465-467.

[10]Pei XQ,Liu LZ,Liu M,et al.Contrast-enhanced ultrasonography of hepatocellular carcinoma:correlation between quantitative parameters and histological grading[J].Br J Radiol,2012,85 (1017):740-747.

[11]拉孜，官泳松，次白.血清P53抗體與原發性肝癌病理分化程度的相關性研究[J].西部醫學，2011，23（1）：93-95.

A correlation study of CEUS quantitative analysis and the expression of P53 in hepatocellular carcinoma

MA Zhen1,YANG Hong2,HE Yun2,LU Jing-ning2,PENG Jin-bo2,WU Yu-quan2
(1.Department of Medical Ultrasonics,the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530023,China;2.The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

Objective:To investigate the expression of mutant P53 protein and their correlation with contrast-enhanced ultrasound quantitative parameters in hepatocellular carcinoma(HCC).Methods:Fifty-seven cases of HCC were enrolled.A retrospective analysis of the contrast-enhanced ultrasound quantitative parameters was performed,and then their correlation with P53 protein by immunohistochemistry staining method was done.Results:①P53 positive expression rate was 54.3%(31/57).②In P53 positive and negative groups,the peak strength,the mean transit time and time to peak showed no significant difference(P＞0.05).There was significant difference in the rising slope and washout time(P＜0.05).③There was no correlation between the expression of P53 and maximum intensity,mean transit time or time to peak(P＞0.05).The positive expression of P53 was positively correlated with the rising slope with r=0.377(P＜0.05),and negatively correlated with washout time with r=-0.410(P＜0.05).Conclusion:For HCC contrast-enhanced ultrasound parameters,there is a certain correlation between rising slope,washout time and mutant P53 protein expression.The time-intensity curve might noninvasively assess the expression of P53.

Liver neoplasms;Carcinoma,hepatocellular;Genes,p53;Ultrasonography,Doppler,color

R735.7；R445.1

A

1008－1062（2016）01－0025－04

2015-04-26

馬振（1983－），男，山東菏澤人，主治醫師。E-mail：mg9.8@163.com

楊紅，廣西醫科大學第一附屬醫院超聲科，530021。E-mail：yanghonggx@163.com

國家自然科學基金（81260222）；廣西自然科學基金（2012GXNSFAA276041）；廣西衛生廳重點科研項目（桂衛重2011089）。