低氧誘導高遷移率組蛋白B1對人胰腺癌細胞凋亡抵抗和遷移的作用研究

蘇兆亮，劉嫣方，宋 濂，陳雪蓮，石 卉，姜玉潔，張禮榮，朱海濤，王冬青

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低氧誘導高遷移率組蛋白B1對人胰腺癌細胞凋亡抵抗和遷移的作用研究

蘇兆亮，劉嫣方，宋 濂，陳雪蓮，石 卉，姜玉潔，張禮榮，朱海濤，王冬青

目的 觀察低氧誘導人胰腺癌細胞系(SW1990)分泌高遷移率組蛋白B1(HMGB1)作用，并探討胞外HMGB1在胰腺癌細胞凋亡抵抗及轉移中的作用。方法 取對數生長期SW1990細胞分別給予以下處理：(1)常氧+PBS；(2)低氧+PBS；(3)低氧+HMGB1(100 μg/L)；(4)低氧+HMGB1(100 μg/L)+EP(胞外HMGB1特異性抑制劑)。細胞處理72 h后，ELISA檢測(1)及(2)2組細胞培養上清中HMGB1表達的差異；AnnexinV/PI流式細胞術檢測(2)、(3)、(4)各組細胞的凋亡率；Transwell 遷移實驗檢測(2)、(3)、(4)各組細胞遷移能力差異；Western-blotting檢測(2)、(3)、(4)各組細胞凋亡相關蛋白(Bcl-2)及遷移相關蛋白(E-cadherin、MMP-9)表達的差異。結果 ELISA結果顯示低氧條件下，細胞培養上清中HMGB1表達含量升高，是常氧條件下的5倍；AnnexinV/PI流式細胞術檢測以上3組細胞的凋亡率分別為：(23.47±2.20)%、(6.57±1.20)%、(20.03±1.89)%；低氧+HMGB1處理組細胞凋亡比率明顯低于其他2組，差異有統計學意義(P<0.05)； Transwell 遷移實驗中各組穿至下室的細胞數分別平均為(161.3±16.0)、(399.7±13.0)、(184.3±16.0)個，差異有統計學意義(P<0.05)，提示低氧條件下HMGB1能明顯促進人胰腺癌SW1990細胞的遷移；Western-blotting結果顯示HMGB1處理組Bcl-2及MMP-9表達增高，E-cadherin表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 低氧可以促進腫瘤細胞釋放HMGB1，從而促進人胰腺癌SW1990凋亡抵抗與遷移。

低氧；高遷移率組蛋白B1；胰腺癌；細胞遷移

胰腺癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，因發病隱匿，親淋巴結轉移性等特性，胰腺癌的5年生存率不足5%[1-2]。因此深入研究胰腺癌的生物學特性對于改善胰腺癌生物學現狀具有非常重要的臨床意義。近年來，低氧對實體瘤生物學行為影響引起了學者廣泛關注。據報道，低氧是導致腫瘤放化療抵抗及轉移的關鍵因素[3]。然而其確切機制仍不明確。本實驗以人胰腺癌細胞系SW1990為研究對象，探討低氧誘導腫瘤細胞釋放高遷移率組蛋白B1(high mobility group protein B1, HMBG1)對低氧條件下腫瘤細胞凋亡抵抗及轉移的作用，并試圖闡釋其發揮作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 血清(FBS)、細胞培養基DMEM/F12均購于美國GIBCO公司；胰蛋白酶購于AMERSCO公司；AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)；Transwell小室和細胞培養板24孔板購自美國Corning公司；β-actin、E-cadherin、MMP-9和Bcl-2抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗則購于武漢博士德生物工程有限公司；CO2培養箱及天平(日立公司)；離心機80-2(中國上海精密儀器廠)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)，CA950-2超凈臺(上海凈化儀器廠)，CYTONICS FC500流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 細胞培養及分組處理 SW1990(中科院上海細胞研究所)培養三代左右直到細胞狀態穩定后培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基(內含青、鏈霉素各100 U/mL) 中，置于37 ℃、5% CO2條件下細胞培養箱中進行培養。細胞單層貼壁生長，至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代。分別給予以下4組處理：(1)常氧+PBS； (2)低氧+PBS；(3)低氧+HMGB1(100 μg/L)；(4)低氧+HMGB1(100 μg/L) +EP(胞外HMGB1特異性抑制劑)。參照以往文獻及前期預實驗結果[4]：HMGB1的最佳處理濃度為100 μg/L；低氧培養條件：低氧混合氣(1% O2，5% CO2，94% N2)購自南大恒通氣體廠，低氧培養時將細胞置于密封的低氧培養盒中，用低氧混合氣平衡10 min，然后轉移到37 ℃培養箱中培養。處理72 h后，將上述3組細胞在顯微鏡下觀察腫瘤細胞的形態學變化。

1.3 AnnexinV/PI檢測細胞凋亡 將以上步驟中各組細胞消化、離心、收集細胞，棄去上清，3 ml預冷的PBS漂洗2次，將細胞重懸于預冷的70%乙醇中，4 ℃固定1～2 h，離心棄去固定液，3 ml PBS重懸，400目篩網過濾、離心收集好細胞后，向細胞中加入含有1 μl PI和5 μl AnnexinV的緩沖液，在室溫下放置15 min，加入400 μl的緩沖液，混勻后利用流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測。

1.4 Transwell遷移試驗 將以上步驟中各組細胞消化，用PBS洗2遍，無血清的DF-12培養基重懸，調整細胞密度至5×105/ml。均勻加入400 μl細胞懸液至Transwell板上室，按照以上分組分別加入HMGB1及EP處理；下室加入含10% FBS的DMEM/F12培養基600 μl，每組設置3個復孔，低氧條件下培養箱中培養24 h。取出上室，用棉簽擦去上室細胞，多聚甲醛固定15 min，棄固定液，0.1%結晶紫染液染色10 min，PBS洗3遍，顯微鏡下攝片并計數。

1.5 Western-blotting檢測相關蛋白的表達 收集以上各組細胞，PBS清洗2遍，加入細胞裂解液及蛋白酶抑制劑, 提取細胞總蛋白并測濃度, 以等量蛋白質樣品與蛋白上樣緩沖液按1∶1混合于100 ℃沸水中煮10 min，冷卻后置于-20 ℃保存。然后在SDS-PAGE膠中進行電泳，每孔加樣10 μl蛋白樣品，電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉進行封閉處理1 h后，孵育一抗4 ℃過夜(E-cadherin、MMP-9均為兔抗人抗體，Bcl-2為鼠抗人抗體，工作濃度均為1∶400，兔抗人β-actin工作濃度為1∶500)。24 h后經TBST(150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris，0.1% Tween-20，pH 7.6)洗膜10 min×3次后，常溫下孵二抗1 h，再次經TBST漂洗5 min×3次后，用ECL化學發光液進行曝光。

1.6 HMGB1細胞因子檢測 細胞上清內HMGB1含量檢測采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，按試劑盒說明進行操作。

1.7 統計學處理 應用SPSS 16.0統計學軟件對統計數據進行分析，數據用均數±標準差(x±s)表示，每組實驗獨立重復3次后，兩樣本均數比較采用t檢驗，多樣本均數間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.01。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 常氧及低氧條件下細胞形態及HMGB1釋放在正常氧含量培養條件下，SW1990呈梭形生長；低氧培養后，部分細胞呈圓形生長，細胞生長速度減慢(圖1A)。ELISA檢測常氧及低氧培養條件下，2組細胞上清檢測HMGB1表達含量，結果顯示低氧培養上清中HMGB1表達含量為常氧條件下的5倍，2組比較差異有統計學意義(P<0.05，圖1B)。

注：圖A：a.常氧組細胞形態；b.低氧組細胞形態；圖B：HMGB1的釋放。與常氧組比較aP<0.05。HMGB1：高遷移率組蛋白B1圖1 SW1990在常氧及低氧條件下細胞形態及HGMB1的釋放

2.2 HMGB1對低氧SW1990細胞凋亡抵抗作用 AnnexinV/PI染色檢測細胞凋亡率結果顯示， 用PBS、HMGB1、HMGB1+EP分別處理SW1990，低氧條件培養72 h后，細胞凋亡率分別為(23.47±2.20)%、(6.57±1.20)%、(20.03±1.89)%；HMGB1處理組比其他2組細胞凋亡率明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3 HMGB1對低氧條件下SW1990細胞遷移作用Transwell實驗顯示，低氧條件下，PBS、HMGB1、HMGB1+EP處理后各組SW1990細胞低倍鏡下(×100)遷移至下室的細胞數分別為(161.3±16.0)、(399.7±13.0)、(184.3±16.0)個，HMGB1處理組遷移細胞要比其他實驗組細胞數明顯增多，與其他2組比較差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

注：a：PBS處理組；b：HMGB1處理組；c：HMGB1+EP處理組。HMGB1：高遷移率組蛋白B1圖2 HMGB1對SW1990細胞遷移的影響

2.4 HMGB1對低氧SW1990細胞遷移及凋亡相關蛋白表達 低氧條件下，HMGB1處理SW1990細胞6 h后，Western-blot結果顯示，抗凋亡蛋白Bcl-2及遷移相關蛋白MMP-9表達增高，而E-Cadherin表達降低，與PBS、HMGB1+EP 2組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 Western-blotting檢測細胞相關蛋白含量的表達

3 討論

胰腺癌位居因腫瘤而導致死亡的第四位，具有早期轉移，治療效果及預后極差等特點，惡性程度極高、總體5年生存率不足5%[2]；胰腺癌的發生與環境、飲食以及慢性炎癥等眾多的因素有關，長期的炎癥刺激會導致細胞化生，如長期的消化道功能紊亂，這一點在海上作業人員表現的尤為突出。胰腺癌的各種生物學行為是腫瘤細胞與腫瘤微環境相互作用的結果。低氧是包括胰腺癌在內的多種實體腫瘤共同特征，主要由于腫瘤細胞快速分裂和血管微環境異常造成血液供應不足而導致缺氧。近年來，越來越多的研究證實，低氧與腫瘤的治療后復發、轉移及腫瘤干細胞維持等密切相關[5-6]。然而，低氧誘導胰腺癌轉移的確切機制卻仍不十分明確，因此對其進行深入研究具有非常重要的臨床意義。低氧引發組織損傷和壞死所釋放的大量組織細胞碎片和蛋白質等，均可使組織局部堆積大量所謂損傷相關模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)分子，這些分子包括透明質酸、HMGB1等。研究結果[7]顯示，在低氧培養條件下，胰腺癌細胞培養上清中HMGB1的表達量明顯增高，提示HMGB1在低氧誘導的胰腺癌各種生物學行為中起著重要作用。

作為危險信號分子及炎癥介質，HMGB1首先必須通過主動分泌或被動釋放方式被運輸到胞外。胞外HMGB1可以介導一系列重要的生物學功能，包括觸發炎癥、激活固有及獲得性免疫應答，促進細胞的生長、發育、增殖、凋亡等過程[7-8]。在腫瘤組織中，HMGB1具有“雙刃劍”的作用，既可以通過誘導腫瘤新生血管的形成促進腫瘤發展，也可以觸發保護性的抗腫瘤T淋巴細胞應答而抑制腫瘤[9]。AnnexinV/PI 及Transwell實驗結果提示：低氧條件下，胞外HMGB1可以促進體外培養的腫瘤細胞凋亡抵抗，并促進腫瘤細胞遷移、轉移。胰腺癌細胞向遠處轉移是一個復雜的旅程，必須克服一系列的障礙才能在遠處形成轉移灶。腫瘤轉移有3個基本步驟：(1)通過EMT轉換，降低癌細胞之間的黏附性，從而脫離原發灶；(2)在遷移過程中抵抗各種凋亡信號的刺激，到達轉移部位；(3)在轉移組織增殖形成轉移灶。因此，HMGB1在腫瘤轉移的過程中發揮重要作用。為進一步證實HMGB1促進細胞轉移的確切機制，本研究檢測了EMT相關蛋白(MMP-9)及凋亡相關蛋白(Bcl-2)的表達。EMT是一個復雜的分子過程，該過程中上皮細胞失去極性，細胞間連接疏松，頂面-底側極性消失，獲得間質表型和主動轉移的特性。EMT過程的標志是上皮標記E-cadherin的下調以及間質標記(MMP-9)的上調，導致上皮細胞間連接松解而使細胞獲得主動轉移和浸潤特性[10]。結果顯示，HMGB1刺激后SW1990細胞MMP-9及抗凋亡蛋白Bcl-2表達量明顯增高，E-cadherin表達量明顯降低，從分子水平上說明了HMGB1可能調控胰腺癌細胞EMT轉換及凋亡抵抗而發揮其促進腫瘤轉移的作用。

本研究表明低氧條件下胰腺癌細胞主動分泌大量的HMGB1，分泌至胞外的HGMB1主要通過誘導細胞EMT轉換及表達抗凋亡蛋白而促進胰腺癌細胞轉移及凋亡抵抗，本研究為針對胰腺癌微環境的靶向治療提供了更多的依據。

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(本文編輯：張陣陣)

Effects of hypoxia-induced HMGB1 on the anti-apoptosis and metastasis of pancreatic cancer cellsSu

Zhaoliang, Liu Yanfang, Song Lian, Chen Xuelian, Shi Hui, Jiang Yujie, Zhang Lirong, Zhu Haitao, Wang Dongqing

(Department of Immunology, Jiangsu University, Zhenjiang 212001, China)

Objective To observe the effects of hypoxia-induced HMGB1 secreted in the human pancreatic cancer cell line (SW1990), and also to investigate the role of HMGB1 in the anti-apoptosis and metastasis of pancreatic cancer cells.Methods The cell line SW1990 in logarithmic growth phase was divided into 4 groups in accordance with different treatment methods, i.e. the normoxia + PBS group (or group 1), the hypoxia +PBS group (or group 2), the hypoxia + HMGB1 (100ng/ml) group (or group 3) and the hypoxia + HMGB1(100 ng/ml)+ EP (inhibitor of HMGB1) group (or group 4). Seventy-two hours after treatment, ELISA was used to detect the level of HMGB1 in the supernatant of the culture medium in group 1 and group 2. AnnexinV/PI was used to monitor the apoptosis of groups 1, 2 and 3. Transwell assay was employed to detect the differences in the metastasis of the cells in groups 1, 2 and 3. Western-blotting was employed to detect expression levels of E-Cadherin, MMP-9 and Bcl-2 in groups 1, 2 and 3.Results ELISA results showed that the HMGB1 expression level in the supernatant of the culture medium was elevated, which was 5 times higher than that of the normoxia group. AnnexinV/PI flow cytometry indicated that the rates of apoptosis in the above 3 groups were respectively (23.47±2.2)%, (6.57±1.2)% and (20.03±1.89)%. The apoptosis of the hypoxia + HMGB1 group was significantly lower than that of the other 2 groups, and statistical significance could be seen, when comparisons were made between them(P<0.05). Transwell chemotaxis assay indicated that the cells of different groups that migrated to the lower chamber were respectively 161.3±16.04, 399.7±13.01 and 184.3±16.04, indicating that HMGB1 could significantly promote the migration of human pancreatic carcinoma cells SW1990 under hypoxic conditions. Western-blotting showed that the expressions of Bcl-2 and MMP-9 in the HMGB1 group were increased, while the expressions of E-cadherin was decreased(P<0.05).Conclusion Hypoxia could induce the secretion of HMGB1 in SW1990 and HGMB1 could prompt the apoptosis of pancreatic carcinoma cells.

Hypoxia; high mobility group protein B1; Pancreatic carcinoma; Migration

國家自然基金項目(81502663)；江蘇省社會發展項目(BE2015668)；鎮江市社會發展項目(SH2014053、SH2013024，SH2015053)；鎮江市重點實驗室基金項目(SS2013017)；江蘇省六大人才高峰基金項目(2013-WSN-002, 2015-WSN-005)

212001 江蘇 鎮江，江蘇大學醫學院免疫學系(蘇兆亮)；江蘇大學附屬醫院影像科(宋濂、陳雪蓮、石卉、姜玉潔、張禮榮、朱海濤、王冬青)；江蘇大學附屬人民醫院中心實驗室(劉嫣方)

張禮榮，電子信箱：tianzchen684@163.com

R735.9

A [DOI] 10.3969/j.issn.1009-0754.2016.05.010

2016-01-10)