羊傳染性膿皰病毒PCR檢測方法的建立與應用

李海利,孫婷婷,辛曉玲,徐引弟,朱文豪,王克領

(1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所,河南 鄭州 450002; 2.河南農業大學牧醫工程學院,河南 鄭州 450002)

羊傳染性膿皰病毒PCR檢測方法的建立與應用

李海利1,孫婷婷2,辛曉玲1,徐引弟1,朱文豪1,王克領1

(1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所,河南 鄭州 450002; 2.河南農業大學牧醫工程學院,河南 鄭州 450002)

根據羊傳染性膿皰病毒GeneBank基因序列,設計合成一對引物。通過對PCR反應條件的優化,敏感性及特異性試驗,成功建立了用于檢測羊傳染性膿皰病毒DNA的PCR檢測方法。該方法成功擴增出390 bp的目的基因片段,敏感性試驗證明可以檢測出320×10-2ng/ L的DNA。特異性試驗羊痘病毒、山羊關節炎腦炎病毒均未擴增出相應片段。重復性試驗對3份羊傳染性膿皰病毒陽性病料進行檢測,結果均為陽性。臨床應用對臨床送檢的16份疑似羊傳染性膿皰病毒感染病料用上述建立優化的PCR方法進行檢測,結果顯示,9份為陽性,陽性樣品的PCR擴增產物克隆后進行序列分析顯示均為羊傳染性膿皰病毒。證明該方法具有良好的敏感性和特異性,可以用于臨床診斷。

羊傳染性膿皰病毒;PCR;檢測

羊傳染性膿皰病(Contagious ecthyma,CE)是由羊傳染性膿皰病毒(Contagious Ecthyma Virus)引起的一種山羊、綿羊的接觸性、病毒性、嗜上皮性人畜共患傳染病,本病也稱為羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎,俗稱羊口瘡(Or f)［1]。本病最早發現于歐洲,目前,世界各地所有養羊的地區都存在本病,我國新疆、甘肅、內蒙古、陜西、西藏、四川、云南等省區也有本病流行［2]。本病嚴重危害山羊和綿羊,綿羊、山羊可相互傳染,而且人、駱駝、貓和海豹也可感染本病［3]。本病呈地方流行,對于首次發病羊群,幼齡羊和成年羊均可感染,而常發地區的羊群,以3～6月齡羔羊發病最多［4]。本病的病原為痘病毒科副痘病毒屬,病毒核酸為雙股DNA,大小為130～150 kb,G+C含量約為64%［5-6]。本病的臨床癥狀表現為患羊嘴角及口腔出現紅斑、腫脹,繼而形成水皰、膿皰、潰瘍破裂,最后形成較厚的灰褐色痂皮,有時還表現為羔羊發育受阻,體溫正常或稍有升高,人可通過與病羊接觸引發感染［7-9]。敏感羊群發病率很高,通常可達到90%,病死率達1%～25%,本病有化膿菌和壞死桿菌等繼發感染,死亡率達50%。同時近年來隨著全國各地肉羊產業迅速發展,該病呈暴發趨勢,給養羊業造成極大的經濟損失。

目前,可通過臨床癥狀、流行病學調查對本病作出初步診斷,并通過實驗室檢查確診,通過采取病羊的水皰液,病死羊的口唇部、皮膚、內臟制成病理組織切片。試驗方法如電子顯微鏡檢查、病毒分離、動物接種試驗、血清中和試驗、酶聯免疫吸附試驗、免疫電泳、P C R方法、核酸探針法等［10-11]。有國外學者采用P C R方法,特異性和敏感性較高［12]。常規的病原分離和血清學檢測方法存在操作繁瑣、耗時長、敏感性低、易受不確定因素如病毒毒價的準確性、細胞量的多少及生長情況、病毒血清孵育時間長短影響等缺點［13]。由于羊傳染性膿皰的臨床癥狀與羊痘、口蹄疫臨床癥狀相似,且易繼發化膿菌和壞死桿菌感染,增加了臨床診斷的難度,因此本試驗建立了一種簡便快速、準確、特異性強、敏感度高的P C R檢測方法,對快速、有效檢測羊傳染性膿皰病毒具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 原材料試驗所用的羊傳染性膿皰病毒(Contagious Ecthyma Virus,CEV)及對照所用的羊痘病毒(Capri Pox Virus,CPV)、山羊病毒性關節炎-腦炎病毒(Caprine arthritis-encephalitis Virus, CAE)均由河南省農科院畜牧獸醫研究所實驗室保存。

1.2 主要試劑主要試劑:Ex Taq(5 U/μL)購自TaKaRa公司,2×Taq Mix Maste r(含染料)購自上海萊楓科技有限公司,病毒基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司,引物Forward Primer(10μm),Reverse Primer(10μm)由上海生物工程有限公司合成,DL 2000 DNA Marker購自TaKaRa公司,瓊脂糖購自BIOWEST公司,1%瓊脂糖凝膠:稱取0.5 g瓊脂糖溶于50 mL 1×TAE電泳緩沖液,溶化后加入5μL染色劑,50×TAE(T r is-乙酸):24.2 g Tris堿,冰乙酸10 mL,0.5 MEDTA (p H 8.0),加三蒸水定容至100 mL,工作液為1× TAE。

1.3 引物的設計與合成根據GeneBank中CE (K X579064.1)全基因序列設計一對引物,引物序列為P1(上游引物):5、-CCTACTTCTCGGAGTTCAGC-3、;P2 (下游引物):5、-GCAGCACTTCTCCTCGTAG-3、;預計擴增目的片段390 bp,引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 病毒基因組DNA DNA的提取按照Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒進行操作,提取的DNA保存在-20℃備用。

1.5 PCR 反應

1.5.1 PCR反應條件的優化

1.5.1.1 最適模板用量的確立分別取1、2、3、4、5、6μL DNA模板,進行PCR反應,以確定最適的模板用量。

1.5.1.2 最適引物用量的確立分別取不同用量的引物在50μL的反應體系中,上、下游引物分別加入0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2μL進行P C R擴增反應,以確定最適的引物用量。

1.5.1.3 最適變性溫度的確立分別在92、93、94、95、96℃下進行PCR擴增反應,以確定最適的變性溫度。

1.5.1.4 最適退火溫度的確立分別在51、53、55、57、59℃下進行PCR擴增反應,以確定最適的退火溫度。

1.5.2 PCR擴增反應PCR反應在50μL反應體系中進行,引物Forward Primer 1μL,Reverse Primer 1μL,DNA模板各9 μL,2×Taq Mix Master(含染料)25μL,DEPC水14 μL。反應條件為95℃預變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環,最后72℃延伸10 min,4℃保存。取5μL PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳測定,以1×TAE配成50 mL 1%瓊脂糖凝膠,膠內加入染色劑5μL,每份PCR樣品取5μL,在90～110 V電泳30 min,于G T-1凝膠成像儀上觀察結果。

1.6 PCR PCR特異性試驗分別取同體積的羊傳染性膿皰病毒、羊痘病毒的DNA、山羊病毒性關節炎-腦炎病毒、健康的羊皮組織及ddH2O,山羊病毒性關節炎-腦炎病毒先反轉錄為cDNA再進行PCR反應, ddH2O作為陰性對照,以確定建立的PCR反應特異性。

1.7 PCR PCR敏感性試驗將提取的羊傳染性膿皰病毒核酸用蛋白質核酸測定儀測定核酸濃度為320 ng/ μL,將DNA進行10倍系列稀釋第1～8孔,其濃度依次為320 ng/μL,320×10-1ng/μ L DNA,320× 10-2ng/μL DNA,320×10-3ng/μL DNA,320× 10-4ng/μL DNA,320×10-5ng/μL DNA,320× 10-6ng/μL DNA,320×10-7ng/μL DNA。以上述濃度體系為模板進行PCR擴增,測定其敏感性。

1.8 PCR PCR重復性試驗應用建立的PCR檢測方法,對羊傳染性膿皰病毒3份陽性病料和3份陰性病料,重復檢測3次,以驗證建立的PCR檢測方法的穩定性。

1.9 臨床應用用建立優化的PCR檢測方法,對臨床送檢的16份疑似羊傳染性膿皰病毒病料先提取DNA,應用PCR優化條件進行檢測。

圖1 PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electro phoresis of the PCR products

圖2 PCR特異性試驗結果Fig.2 The specific test results of PCR

2 結果與分析

2.1 擴增產物的檢測及鑒定在G I-1凝膠成像儀上觀察,結果顯示,該PCR體系可以擴增出一條約為390 b p的羊傳染性膿皰病毒的基因片段(圖1)。PCR產物應經切膠純化、克隆、測序,證明是該病毒的DNA。

2.2 特異性試驗結果提取羊傳染性膿皰病毒、羊痘病毒核酸,應用試驗設計的引物,以他們的DNA為模板進行PCR擴增,山羊病毒性關節炎-腦炎病毒反轉錄為cDNA后進行PCR擴增,結果顯示,只有羊傳染性膿皰病毒能擴增出約390 b p的條帶,而其他病毒、健康羊皮組織和ddH2O均未擴增出目的條帶。說明建立的PCR檢測方法具有良好的特異性,設計的引物與羊痘病毒、山羊病毒性關節炎-腦炎病毒核酸不能發生特異性結合(圖2)。

2.3 敏感性試驗結果將模板DNA經10倍系列稀釋后濃度分別為320 ng/μL,320×10-1ng/μL DNA, 320×10-2ng/μL DNA,320×10-3ng/μL DNA, 320×10-4ng/μL DNA,320×10-5ng/μL DNA, 320×10-6ng/μL DNA,320×10-7ng/μL DNA。分別進行PCR擴增,在濃度3.2×10-3ng/μL時仍出現目的片段,而在濃度3.2×10-4ng/μL時不出現目的片段,可檢測出濃度320×10-2ng/μL的模板,結果見圖3。

2.4 重復性試驗結果應用優化的PCR方法檢測羊傳染性膿皰病毒3份陽性病料和3份陰性病料,并重復檢測3次DNA樣品,檢測結果均一致,證明建立優化的PCR方法穩定性良好。

圖3 PCR敏感性試驗結果Fig.3 The sensitivity test results of PCR

2.5 臨床應用對臨床送檢的16份疑似感染羊傳染性膿皰病毒的動物取干痂加P BS緩沖液研磨10 min,用建立優化的PCR檢測方法檢測,發現有9份陽性、7份陰性。對陽性樣品PCR擴增產物進行序列分析,顯示均為羊傳染性膿皰病毒,如圖4。

3 討論

羊傳染性膿皰病毒是發生在綿羊、山羊身上的一種常見病,雖然發病率高,但病死率低,然而反復發作,給養羊業造成嚴重的經濟損失。本病的防控與羊場的管理關系較大,做好羊場的衛生消毒工作,加強飼養管理,提高動物的抗病力,將健康羊與病羊隔離飼養,在養殖場具體實施免疫接種、藥物預防、消毒、隔離等綜合措施［14],可降低本病的發病率。由于本病的臨床癥狀輕微,患羊口唇起水皰、膿皰、結痂,最后脫落,不易引起飼養人員的重視,采取的治療措施只是在患病處涂抹2%紫藥水,沒有真正消滅病原,幾天后雖然癥狀消失,但過一段時間會復發本病。

羊傳染性膿皰病毒與羊痘病毒、口蹄疫病毒在臨床上癥狀相似,且本病易繼發化膿菌和壞死桿菌感染,在臨床診斷上難以鑒別,易導致誤診,選錯治療方法,耗時耗力。羊傳染性膿皰病,綿羊、山羊均可發病,發病后無體溫升高等全身癥狀。本試驗采用PCR檢測方法,引物的選擇是影響PCR成功的一個關鍵因素。本試驗根據GeneBank公布CEV基因序列,設計合成一對引物,以CEV的DNA能擴增出390 bp的目的基因片段,而羊痘病毒、山羊病毒性關節炎-腦炎病毒DNA均不能擴增出目的條帶,該PCR檢測方法具有良好的特異性和敏感性,敏感性試驗表明可檢測出320×10-2ng/μL的病毒液。

圖4 臨床樣品的PCR檢測結果Fig.4 The result of clinical samples detected by PCR

該PCR檢測方法與病毒分離和血清中和試驗相比,具有良好的優越性,血凝、補反、凝集等常規試驗方法均無法檢測羊傳染性膿皰病毒,可能出現非特異性反應或交叉反應［15]。與中和試驗相比, ELISA法(酶聯免疫吸附試驗)快速、簡便、敏感,易于標準化［16-17],對流免疫電泳具有快速、簡便、準確的特點［18]。應用DNA雜交技術檢測CEV DNA的方法,用放射性同位素32P標記CEV DNA探針,對CEV DNA片段進行診斷和檢測［19-20]。由于電子顯微鏡價格昂貴,病原分離培養費時費力,血清中和試驗易受不確定因素的影響。應用PCR檢測方法診斷羊傳染性膿皰,操作簡便,只需2.5 h。應用PCR檢測方法對臨床病料檢測的檢出率可達到56%,檢出率高,不僅節省了開支,而且大大縮短了檢測時間,可保證臨床病料的及時確診。

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Establishment and Application of PCR Detection Method to Contagious Ecthyma Virus

Li Haili1,Sun Tingting 2,Xin Xiaoling1,Xu Yindi1,Zhu Wenhao1,Wang Keling1
(1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Henan Zheng zhou 450002; 2.College of animal husbandry and medical engineering,Henan Agricultural University,Henan Zheng zhou 450002)

According to the gene sequence of Gene Bank of contagious ecthyma virus(CEV),a pair of primers were designed.The PCR test to detect CEV was successfully established.By the optimization of PCR reaction conditions,a 390 bp fragments was amplified.The sensitivity of the assay can be up to 320×10-2ng/μL.This method is specific,it can distinguish contagious ecthyma virus from sheep pox virus and caprine arthritis encephalitis virus.Repeatability test in three suspicious-positive diseases of sheep contagious ecthyma for testing,the results were positive. Clinical application of the 16 suspected contagious ecthyma disease samples which were infected, showed 9 positive results.After cloning and analyzing sequence of the positive samples' PCR amplification product,it showed that all infected with CEV.The method has good sensitivity,specificity,and it can be used for clinical diagnosis.

Contagious Ecthyma Virus(CEV);P C R;Detection

S852.65

B

1672-9692(2016)10-0001-06

2016-07-17

李海利(1982-),男,河南省開封人,助理研究員,博士,主要從事獸醫傳染病防控研究工作。

河南省農業科學院自主創新基金。