血瘀質非創傷性股骨頭壞死基因多態性研究

李盛華 周明旺 郭鐵峰 柳海平 葉丙霖 王承祥

摘要：目的 研究非創傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）高發體質類型血瘀質與ApoA1位點多態性的相關性。方法 選擇93例NONFH患者作為病例組，隨機選取無血緣關系健康志愿者83例作為對照組。對病例組進行中醫體質問卷調查，將NONFH患者分為血瘀質32例、非血瘀質61例。受試者取血樣2 mL，提取DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行DNA測序，檢測PAF-AH G994T、NOS1基因rs9658282位點多態性，進行統計學分析。結果 ApoA1基因-75G/A位點AA基因型（OR：2.578；95%CI：1.174-5.663；P=0.018）與A等位基因（OR：1.726；95%CI：1.121-2.658；P=0.013）可能是NONFH發病的危險因素之一。結論 ApoA1基因-75G/A可能與NONFH發病相關。ApoA1基因-75G/A位點基因多態性與血瘀質NONFH發病無相關性，ApoA1基因+83C/T位點基因多態性與血瘀質NONFH發病無相關性。

關鍵詞：非創傷性股骨頭壞死；ApoA1基因-75bp/+83bp位點；中醫體質；血瘀質

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.005

中圖分類號：R272.968.3 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0017-05

Abstract： Objective To study the correlation between nontraumatic osteonecrosis of femoral head （NONFH） and ApoA1 polymorphism of blood stasis type. Methods Totally 93 cases of NONFH were selected as the case group， and 83 healthy volunteers were randomly selected as the control group. With TCM constitution questionnaire survey， the case group was screened out 32 cases of blood stasis NONFH type and 61 cases of non blood stasis NONFH type. In the case group and control group， the subjects took blood samples 2 mL， extracted DNA for PCR amplification， PCR products for DNA sequencing. G994T PAF-AH and rs9658282 gene NOS1 site polymorphism were detected for tatistical analysis. Results -75G/A gene AA ApoA1 genotype （OR： 2.578； 95%CI： 1.174-5.663； P=0.018） and A allele （OR： 1.726； 95%CI： 1.121-2.658； P=0.013） may be one of the risk factors of NONFH. Conclusion -75G/A gene ApoA1 may be related to the pathogenesis of NONFH. There was no correlation between the ApoA1 gene polymorphism of -75G/A gene and the pathogenesis of blood stasis NONFH. There was no correlation between the ApoA1 gene polymorphism of +83C/T gene and the pathogenesis of blood stasis NONFH.

Key words： nontraumatic osteonecrosis of femoral head （NONFH）； ApoA1 gene-75bp/+83bp point； TCM constitutions； blood stasis

非創傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）發病機制目前尚不完全清楚，其治療有一定的盲目性和經驗性。對其病因分子生物學機制及藥物防治早期NONFH的研究是當今骨科研究熱點之一。中醫藥防治NONFH顯示出了一定的優勢，主要體現在中醫辨證論治的治療原則重視對個體體質狀態的辨析，在治療過程中發揮“因人制宜”的防治思想。本課題組前期研究顯示，血瘀質是NONFH的高發體質類型之一。本研究通過檢測血瘀質NONFH患者ApoA1基因多態性，探討中醫血瘀體質與NONFH的相關性，為通過體質辨別運用中醫藥干預NONFH提供新的思路和依據。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標準

NONFH診斷、納入及排除標準依據2006年中華醫學會骨科學分會關節外科學組提出的《股骨頭壞死診斷與治療的專家建議》[1]及《中藥新藥臨床研究指導原則》[2]制定。

1.2 中醫體質判定標準

依據《中醫體質分類與判定》[3]制訂“非創傷性股骨頭壞死中醫體質類型及相關基因多態性研究”調查表，中醫體質分為平和質、氣虛質、陽虛質、陰虛質、痰濕質、濕熱質、血瘀質、氣郁質、特稟質9種類型。

1.3 一般資料

應用臨床流行病學方法，于2011年1月-2013年8月在甘肅省中醫院骨科門診、住院部對NONFH患者及非血緣關系健康志愿者進行問卷調查，以NONFH患者作為病例組，無血緣關系健康志愿者為對照組。病例組93例，其中血瘀質32例，非血瘀質61例；對照組83例，與病例組在居住地分布上基本一致。2組性別、年齡比較差異無統計學意義（P>0.05），體質指數比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。本研究方法經本院倫理委員會討論并批準。受試者均簽訂知情同意書。

1.4 病例調查與樣本采集

對調查者進行相關理論知識、調查方法及實驗方法培訓。因NONFH分布不集中，故指定專職調查者進行病例的收集，并采取空腹外周血2 mL，置入裝有EDTA抗凝劑的無菌管中，混勻，-80 ℃冰箱保存。

1.5 試驗材料

TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），Premix Ex Taq Version2.0，TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。引物1（10 ?mol/L）、引物2（10 ?mol/L），TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。QuickCutTM MspI限制性內切酶試劑盒，TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。滅菌蒸餾水，蘭州軍區總醫院水處理系統，高壓滅菌。

1.6 試驗方法

1.6.1 DNA提取 采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）自血液中提取DNA。

1.6.2 PCR擴增 ApoA1基因-75bp/+83bp位點引物序列：上游5'-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACT CTTAAG-3，下游5'-TTAGGGGACACCTAGCCCTCA GGAAGAGCA-3，擴增片段長度433 bp。PCR反應體系：Premix Ex Taq 25 ?L，上游引物（10 ?mol/L）2 ?L，下游引物（10 ?mol/L）2 ?L，模板DNA 4 ?L，滅菌三蒸水17 ?L，總體積50 ?L。將上述體系加入0.5 mL Eppendorf離心管后瞬時離心，防止體系內液體附壁。ApoA1基因-75bp/+83bp位點的PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃延伸7 min；保存溫度4 ℃。瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳驗證，結果見圖1。

1.6.3 PCR擴增產物的酶切 ApoA1基因-75bp、+83bp位點的PCR擴增產物在快速酶切反應體系中37 ℃溫浴30 min。①ApoA1基因-75bp位點酶切產物檢測：配制1.5%瓊脂糖凝膠。取5 ?L DL500 DNA Marker加入1.5%瓊脂糖凝膠第一個樣品槽中；因10×QuickCut Green Buffer中含有電泳時所必需的色素等試劑，酶切產物可直接進行電泳檢測，取6 ?L酶切產物依次按標記序號直接加樣于瓊脂糖凝膠板其他樣品槽中，電泳槽內加入1×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。設定電壓為125 V，電流保持在80 mA以上進行電泳分離。20 min后，當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2 cm，DL500 DNA Marker條帶散開可辨時停止電泳。電泳結果使用YLNCCAP OF OLP凝膠成像系統進行觀察并拍照。ApoA1基因-75bp位點G被A取代，MspI酶切位點丟失，-75bp處由于堿基的變異而形成GG（113bp及66bp片段）、GA（179bp、113bp及66bp片段）和AA（179bp片段）3種等位基因型。②ApoA1基因+83bp位點酶切產物檢測：方法同上。ApoA1基因+83bp處C被T取代后，MspI酶切位點丟失，+83bp處的堿基變異形成CC（209bp及45bp片段）、CT（209bp、254bp及45bp片段）、TT（254bp片段）或GG、GA、AA 3種等位基因型。

1.7 統計學方法

采用SPSS18.0統計軟件進行分析。首先通過χ2檢驗分析總體上各基因型及等位基因分布差異（P<0.05表示差異有統計學意義），基因型分布符合Hardy- Weinberg遺傳平衡定律，其次通過多項logitic分析找到具有顯著差異（P<0.05）的基因型或等位基因。

2 結果

2.1 基因檢測及分型結果

176例樣品中，MspI酶切共檢測出6種基因型：GG（113bp及66bp片段）、GA（179bp、113bp及66bp片段）、AA（179bp片段）、CC（209bp及45bp片段）、CT（209bp、254bp及45bp）、TT（254bp片段）。結果見圖2。

2.2 ApoA1基因-75G/A位點多態性與血瘀質非創傷性股骨頭壞死的關系

ApoA1基因-75G/A位點病例組與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異有統計學意義（χ2=7.391，P<0.05；χ2=6.183，P<0.05），病例組AA基因型的發病風險是GG基因型的2.578倍，A等位基因的發病風險是G等位基因的1.726倍，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。提示ApoA1基因-75G/A的突變使NONFH的發病風險增高。

將病例組血瘀質、非血瘀質與對照組兩兩比較，其中血瘀質與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統計學意義（χ2=5.434，P>0.05；χ2=2.657，P>0.05），非血瘀質與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統計學意義（χ2=5.848，P>0.05；χ2=2.377，P>0.05），血瘀質與非血瘀質總體上各基因型及等位基因分布差異無統計學意義（χ2=0.664，P>0.05；χ2=0.100，P>0.05），見表3。提示ApoA1基因-75G/A位點多態性與血瘀質高發NONFH不具有相關性。

2.3 ApoA1基因+83C/T位點多態性與血瘀質非創傷性股骨頭壞死的關系

ApoA1基因+83C/T位點病例組與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統計學意義（χ2=1.168，P>0.05；χ2=0.650，P>0.05），見表4。提示ApoA1基因+83C/T位點基因多態性與NONFH發病無相關性。

將病例組血瘀質、非血瘀質與對照組兩兩比較，其中血瘀質與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統計學意義（χ2=0.353，P>0.05；χ2=0.345，P>0.05），非血瘀質與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統計學意義（χ2=1.138，P>0.05；χ2=0.504，P>0.05），血瘀質與非血瘀質總體上各基因型及等位基因分布差異無統計學意義（χ2=0.141，P>0.05；χ2=0.000，P>0.05），見表5。提示ApoA1基因+83C/T位點多態性與血瘀質高發NONFH不具有相關性。

3 討論

我們前期研究結果顯示，NONFH的病因病機以過量攝入激素類藥物及酒精中毒引起脂代謝紊亂為主[4]，脂代謝紊亂是NONFH發病的重要機制之一，血脂的異常升高可引起一系列的血管病變，如血管栓塞（脂肪滴隨血流流經較細的股骨頭微小動脈時，形成栓塞，阻斷微循環血供）[5]、血管損傷（血液中游離脂肪酸增多造成微血管內皮細胞功能障礙，主要包括活性氧的產生、凋亡的誘導以及內皮細胞依賴性血管舒張功能的異常）[6]、血管修復功能異常（游離脂肪酸破壞血管內皮細胞增值與凋亡的平衡，導致血管修復功能減弱），以及凝血異常（游離脂肪酸引起促凝血狀態，纖維溶解活性降低，血小板的活性和功能增強）。由此可見，脂代謝紊亂引起血脂增高是NONFH血管病變的重要因素。ApoA1作為構成高密度脂蛋白的重要載脂蛋白，是脂質代謝過程的關鍵調節因子。如果ApoA1的結構或表達量發生變化，則可引起血脂代謝的紊亂，導致血中脂肪酸含量異常，進一步引起上述的血管病變。ApoA1基因結構的改變影響著ApoA1的分子結構、生成和向血液中釋放的速率，進而影響血中ApoA1與HDL的水平。本研究選取ApoA1 -75G/A和+83C/T多態性位點，以血瘀質NONFH患者為研究對象，并將血瘀質NONFH、非血瘀質NONFH及對照組進行兩兩比較，探討血瘀質高發NONFH與ApoA1 -75G/A和+83C/T的相關性。結果表明，AA基因型及A等位基因可能是發生NONFH的分子生物學機制之一。但并未發現血瘀質NONFH與ApoA1 -75G/A和+83C/T具有相關性。

ApoA1-75G/A多態性不僅可以破壞MspI內切酶識別位點，還能夠改變GGGCCGG序列，后者是ApoA1基因轉錄的調控元件，具有激活轉錄的作用。當該序列發生變化時，可能會影響基因的轉錄和表達，從而影響ApoA1的合成。早期報道顯示，ApoA1基因啟動子-75bp A等位基因與血漿ApoA1和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平密切相關，并認為是A堿基的置換促進了ApoA1基因的表達及合成[7]。本研究發現，A等位基因分布頻率低可能與NONFH的發病相關。說明ApoA1表達量過低可能與本病的發生相關。如ApoA1的表達及合成減少，首先影響血漿中脂類的傳輸，其次影響激活卵磷脂膽固醇脂酰基轉移酶（LCAT），阻礙成熟HDL的形成，從而增加肝外組織細胞及血漿中脂類的沉積，進一步使血脂升高并引起血管病變。主要可導致血管內皮細胞凋亡，內皮依賴性舒張功能下降并形成高凝血、低纖溶的病理狀態，脂質過氧化形成xo-LDL沉積于血管局部，參與脂質斑塊的形成，最終阻塞微血管，血管局部氧化性損傷及舒張性降低可阻斷微血管血流，是微循環障礙的重要因素。而這些血管病變有可能是股骨頭局部血運障礙的主要因素，這與本課題組前期研究NONFH發病的重要機制“脂代謝紊亂-血管病變”一致。本研究結果亦顯示，ApoA1-75G/A位點及A等位基因與NONFH相關。所以推斷ApoA1基因-75G/A位點A等位基因可能與NONFH發病具有相關性。也有報道顯示，ApoA1的生成率在GG純合子中顯著高于GA雜合子，同時體外觀察發現A等位基因伴有啟動子活性降低，并且表達水平降低[8]。本研究未發現GG、GA基因型與NONFH具有相關性。而A等位基因對ApoA1表達的影響，本課題組會在后續試驗中進一步研究，并擴充樣本量，探討NONFH高發體質類型的分子生物學機制。

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