療癬卡西甫散提取物對腫瘤壞死因子—α誘導角質形成細胞增殖的影響

彭曉明 高莉 霍仕霞 趙茉 閆明

摘要：目的 觀察療癬卡西甫散提取物（LE）對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導角質形成細胞株HaCaT細胞增殖及白細胞介素-8（IL-8）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表達的影響，探討其作用機制。方法 將培養的HaCaT細胞分為正常組、TNF-α組和LE低、中、高劑量組。除正常組外，其余各組細胞均給予40 ng/mL TNF-α誘導，各給藥組再分別給予8、40、200 μg/mL LE作用48 h。MTT法檢測HaCaT細胞增殖；ELISA檢測HaCaT細胞IL-8和ICAM-1含量；PI和Hoechst33342熒光染色觀察HaCaT細胞凋亡；半定量RT-PCR檢測HaCaT細胞IL-8和ICAM-1的mRNA表達。結果 與正常組比較，TNF-α組HaCaT細胞吸光度、IL-8和ICAM-1含量及其mRNA表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與TNF-α組比較，LE各劑量組HaCaT細胞吸光度、IL-8和ICAM-1含量及其mRNA表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結論 LE通過促進HaCaT細胞凋亡及抑制HaCaT細胞IL-8和ICAM-1基因表達，從而維持皮損處HaCaT細胞的正常水平。

關鍵詞：療癬卡西甫散提取物；腫瘤壞死因子-α；HaCaT；細胞增殖；白細胞介素-8；細胞間黏附分子-1

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.016

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0067-04

Abstract： Objective To investigate the effects of extracts of Liaoxuan Kaxifu Powders （LE） on proliferation and transcription of IL-8 and ICAM-1 in HaCaT induced by TNF-α； To discuss its mechanism of action. Methods Cultured HaCaT was assigned into normal group， TNF-α group and low-， medium- and high-dose of LE group. Every group was induced by 40 ng/mL TNF-α except for normal group， and then LE groups were treated by different concentrations （8， 40， 200 μg/mL） of LE for 48 h. The proliferation of HaCaT was evaluated by MTT and the apoptosis was detected by inverted fluorescence microscope. Levels of IL-8 and ICAM-1 in HaCaT were assessed by ELISA， and their mRNA expressions was detected by semi-quantitative RT-PCR. Results Compared with normal group， the absorbency of HaCaT and the contents and mRNA expressions of IL-8 and ICAM-1 increased in TNF-α group （P<0.05， P<0.01）； compared with TNF-α group， LE of all dose groups could significantly inhibit the absorbency， decrease the contents and mRNA expressions of IL-8 and ICAM-1 （P<0.05， P<0.01）. Conclusion LE is able to inhibit the proliferation of HaCaT induced by TNF-α， and the mechanism is probably related to promoting apoptosis and down-regulating the gene expressions of IL-8 and ICAM-1， and then maintaining the normal level of HaCaT.

Key words： extracts of Liaoxuan Kaxifu Powders； TNF-α； HaCaT； proliferation； IL-8； ICAM-1

銀屑病是一種免疫系統參與的慢性、炎癥性、復發性皮膚病。療癬卡西甫散是維吾爾醫治療銀屑病的常用復方，由歐菝葜、菝葜、黃連和芝麻（白）組成，具有燥濕、止癢、清除堿性異常黏液質的作用[1]。臨床應用及動物實驗表明，療癬卡西甫散對角質形成細胞的增殖具有顯著抑制作用，但其作用機制尚不清楚[2-3]。本實驗觀察療癬卡西甫散提取物（LE）對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導角質形成細胞株HaCaT細胞增殖及白細胞介素-8（IL-8）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表達的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物及制備

LE，本實驗室自制，歐菝葜、菝葜、黃連和芝麻藥材購自新疆本草堂中藥飲片有限公司，經新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所斯拉甫·艾白主任藥師鑒定為正品。將藥材粗粉按處方比例與芝麻混合，加入10倍量80%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h，提取液過濾濃縮后，冷凍干燥至浸膏。然后稱取0.1 g LE，加500 μL DMSO超聲溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2 細胞株

人永生化角質形成細胞株HaCaT，中國典型培養物保藏中心。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM（高糖）培養基，GIBCO公司；胎牛血清，Hyclone公司；TNF-α、MTT、氨芐青霉素鈉和硫酸鏈霉素，Sigma公司；Hoechst33342/PI Kit，上海美季生物技術有限公司；人IL-8、ICAM-1 ELISA kit，R&D;公司；TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、DNA Marker、PCR Master Mix、Taq酶，北京天根生物科技有限公司；TRIpure LS Reagent總RNA抽提試劑，北京百泰克生物科技有限公司。超凈工作臺（蘇凈，SW-CJ-1F），倒置熒光顯微鏡（上海光學六廠，37XAY），CO2培養箱（SANYO，MCO-18AIC），酶標儀（ThermoFisher，Multiskan Go 1510），PCR儀（PE，GeneAmp PCR system 9700）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養、分組、給藥及細胞增殖檢測

將HaCaT細胞以5×105個/mL接種于含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、鏈霉素的DMEM（高糖）培養基中，置于37 ℃、CO2培養箱培養，每隔3 d換液1次。當細胞融合約80%時，0.25%胰酶消化，DMEM培養基將細胞稀釋至5×104個/mL，接種于96孔培養板，培養48 h后吸棄培養基。將HaCaT細胞分為正常組、TNF-α組和LE低、中、高劑量組（以DMEM培養基稀釋）。除正常組外，其余各組均給予40 ng/mL TNF-α誘導，同時LE各劑量組分別加入8、40、200 μg/mL LE。將HaCaT細胞置于37 ℃、CO2培養箱48 h后，加入5 mg/L MTT 20 μL/孔，繼續培養4 h。吸棄培養液，加入DMSO 200 μL，充分震蕩溶解后，于酶標儀波長490 nm處測定光密度（OD）值。

2.2 ELISA檢測白細胞介素-8、細胞間黏附分子-1含量

細胞給藥處理后，吸取細胞培養上清液用于測定IL-8和ICAM-1。稀釋標準品并設定標準孔15個，空白孔3個。空白孔和測定孔分別加入40 μL樣品稀釋液，然后吸取測定樣品10 μL加入待測孔，37 ℃溫育30 min，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干。然后每孔加50 μL酶標試劑（空白孔除外）。37 ℃溫育30 min、洗滌液洗滌5次，拍干。每孔加50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL后，于酶標儀450 nm處測定OD值。之后以標準品濃度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制標準曲線并計算線性回歸方程，并由線性回歸方程得出測定樣品IL-8和ICAM-1含量。

2.3 倒置熒光顯微鏡觀察HaCaT細胞凋亡

以DMEM（高糖）培養基調節HaCaT細胞濃度至5×105個/mL，鋪至25 cm3培養瓶培養48 h，分組及給藥同“2.1”項。然后以0.25%胰酶消化，收集各組細胞1×106個以上。室溫1000×g離心10 min，PBS洗滌3次，收集細胞，并重懸于200 μL PBS中，加入PI和Hoechst33342各20 μL（終濃度分別為50、10 mg/L），于37 ℃孵育10 min。然后1000×g離心10 min，棄上清，加入80 μL PBS，吹打混勻，滴片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 引物設計與合成

根據NCBI網站上報道基因序列，利用Premier5.0軟件設計內參基因GAPDH及目的基因IL-8和ICAM-1的引物。GAPDH（458 bp）：上游5'-GACCAC AGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TGAGGTCCACC ACCCTGTTGC-3'；IL-8（292 bp）：上游5'-ATGCCA CTGAAACTGCTTCAAGC-3'，下游5'-GTTCGGATA TTCTCTTGGCC-3'；ICAM-1（185 bp）：上游5'-GAG GGGTCTCAGCAGACTCTT-3'，下游5'-TGCACGTC CCTGGTGATACT-3'。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2.5 半定量RT-PCR檢測白細胞介素-8、細胞間黏附分子-1的基因表達

細胞分組及給藥同“2.1”項，根據TRIpure LS Reagent總RNA抽提試劑說明書，提取給藥后HaCaT細胞總RNA，測定RNA濃度，并將各組RNA濃度調節一致。按TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行RT-PCR。PCR反應條件為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，54 ℃、45 s，72 ℃、45 s，30個循環后72 ℃延伸10 min，然后冷卻至4 ℃。吸取10 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳。紫外透射儀下觀察結果并拍照，通過Tannon凝膠成像系統測定條帶光密度值，計算每個樣本IL-8、ICAM-1 mRNA表達水平，均以ICAM-1和GAPDH的OD值比值表示。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 療癬卡西甫散提取物對HaCaT細胞增殖水平及白細胞介素-8和細胞間黏附分子-1含量的影響

與正常組比較，TNF-α組HaCaT細胞OD值及IL-8、ICAM-1含量明顯增加（P<0.01）；與TNF-α組比較，LE各劑量組HaCaT細胞吸光度及IL-8、ICAM-1含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表1。

4.2 療癬卡西甫散提取物對HaCaT細胞凋亡的影響

正常組和TNF-α組HaCaT細胞形態規整、細胞核較大，大多被Hoechst33342染成藍色，且2組壞死細胞（紅色）數目差異不明顯。但經不同濃度LE作用48 h后，視野中正常或早期凋亡細胞（藍色）逐漸減少，而被PI紅染的壞死細胞數量逐漸增加。且LE濃度在8～200 μg/mL范圍內，其對HaCaT細胞凋亡誘導作用強度呈現一定濃度依賴性。結果見圖1。

4.3 療癬卡西甫散提取物對HaCaT細胞白細胞介素-8和細胞間黏附分子-1基因表達的影響

與正常組比較，TNF-α組HaCaT細胞IL-8和ICAM-1 mRNA表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與TNF-α組比較，LE各劑量組HaCaT細胞IL-8和ICAM-1 mRNA表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），并呈現一定的濃度依賴性。結果見表2、圖2、圖3。

5 討論

銀屑病的發病機制至今尚未明確。維吾爾醫理論認為，該病多見于異常黏液質體液人群，人體在咸味異常黏液質的影響下，導致機體內異常物質增多，并通過血液影響到皮膚組織。然后反復刺激皮膚、破壞皮膚正常的物質代謝，影響皮膚的影響力、攝住力、生長力等，從而導致銀屑病。銀屑病患者皮損病理特征表現為HaCaT過度增殖及分化異常。現代醫學研究表明，TNF-α是銀屑病斑塊形成和HaCaT細胞增殖過程中的首要細胞因子[4]。本實驗通過40 ng/mL TNF-α誘導HaCaT細胞，成功模擬獲得銀屑病皮損細胞異常增殖癥狀。8、40、200 μg/mL LE干預后，可顯著抑制TNF-α誘導的HaCaT細胞增殖，促進HaCaT細胞凋亡，且其細胞增殖抑制和凋亡促進作用呈現濃度依賴性。

炎癥前細胞因子如IL-6和IL-8在銀屑病皮損中過度表達，可導致銀屑病的病理改變[5-6]。ICAM-1作為一種重要的炎癥因子，不僅可促進細胞間的黏附，還在誘導炎癥細胞的聚集、活化損傷反應中起著重要的作用。在體實驗發現，抗ICAM-1單克隆抗體能明顯抑制白細胞與內皮細胞的黏附，從而減輕炎癥反應[7]。本研究結果顯示，經TNF-α誘導后，HaCaT細胞IL-8和ICAM-1含量及mRNA表達顯著上調，而經8～200 μg/mL LE作用48 h后，其可顯著降低HaCaT細胞IL-8和ICAM-1的生成及mRNA表達。

綜上所述，LE對TNF-α誘導的HaCaT細胞增殖具有抑制作用，其作用機制可能與LE促進HaCaT凋亡及抑制HaCaT細胞IL-8和ICAM-1基因表達水平，進而維持皮損處HaCaT細胞的正常水平相關。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國衛生部“藥品標準”—維吾爾藥分冊（第1版）[M].烏魯木齊：新疆科技衛生出版社，1999：139.

[2] 張迪，宋洋，蘭嵐，等.療癬卡西甫丸加百癬夏塔熱片治療老年人尋常型銀屑病的臨床觀察[J].中國老年學雜志，2013，33（16）：4074-4075.

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