麻黃堿和偽麻黃堿的毛細(xì)管電泳分離研究

喬姍姍 王雄飛 丁月珠 何夢(mèng)婷 楊歡 袁瑞娟

摘要：目的 建立毛細(xì)管電泳分離麻黃堿與偽麻黃堿的方法。方法 分別以甲基化-β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精為添加劑，采用毛細(xì)管電泳法分離麻黃堿和偽麻黃堿。考察添加劑的種類和濃度、緩沖溶液的濃度和pH值、運(yùn)行電壓、有機(jī)溶劑對(duì)麻黃堿和偽麻黃堿分離的影響。結(jié)果 采用甲基化-β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精為添加劑均可以使麻黃堿和偽麻黃堿實(shí)現(xiàn)分離。前者的最佳分離條件為：分離電壓10 kV，25 mmol/L Tris-磷酸緩沖液（pH 2.42）含20 mg/mL甲基化-β-環(huán)糊精，此條件下麻黃堿和偽麻黃堿的分離度為1.56，在13 min內(nèi)獲得快速基線分離；后者的最佳分離條件為：分離電壓10 kV，25 mmol/L Tris-H3PO4緩沖液（pH 3.00）含50 mg/mL羥丙基-β-環(huán)糊精，此條件下麻黃堿和偽麻黃堿的分離度為2.73，在15 min內(nèi)獲得快速基線分離。結(jié)論 此方法可靠、快速、重復(fù)性好，可作為麻黃堿和偽麻黃堿分離測(cè)定的方法。

關(guān)鍵詞：麻黃堿；偽麻黃堿；毛細(xì)管電泳；環(huán)糊精

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.022

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）11-0090-04

Abstract： Objective To establish a capillary electrophoresis method to separate ephedrine and psedudoephedrine. Methods RM-β-CD and HP-β-CD were set as additives. A capillary electrophoresis method was set up. The effects of types and concentrations of additives， the concentrations and pH values of buffered solution， running voltage and organic solvent on the separation of ephedrine and psedudoephedrine were investigated. Results Ephedrine and pseudoephedrine could be successfully separated by using either RM-β-CD or HP-β-CD as additives. When RM-β-CD was used as additive， the best separation conditions were as follows： separation voltage 10 kV， 25 mmol/L Tris-H3PO4 （pH 2.42）， 20 mg/mL of RM-β-CD. Under the conditions， the resolution of ephedrine and pseudoephedrine was 1.56 and they were separated successfully within 13 min. When HP-β-CD was used as additive， the best separation conditions were as follows： separation voltage 10 kV， 25 mmol/L Tris-H3PO4 （pH 3.00）， 50 mg/mL of HP-β-CD. Under the conditions， the resolution of ephedrine and pseudoephedrine was 2.73 and they were separated successfully within 15 min. Conclusion This method is reliable， rapid and repeatable. It can be used as separation determination method for ephedrine and pseudoephedrine.

Key words： ephedrine； pseudoephedrine； capillary electrophoresis； cyclodextrin

麻黃具有發(fā)汗解表、宣肺平喘等功效，生物堿類成分是其主要活性成分，其中麻黃堿和偽麻黃堿是最主要的活性成分，二者互為立體異構(gòu)體。麻黃堿具有平喘、抑制高血糖、興奮中樞神經(jīng)和交感神經(jīng)等作用，偽麻黃堿具有抗炎和利尿作用，是麻黃藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[1]。目前分離麻黃堿和偽麻黃堿的方法主要有高效液相色譜法[2-4]、氣相色譜法[5-6]、薄層掃描法[7]、毛細(xì)管電泳法[8-10]等。毛細(xì)管電泳法由于分離速度快、模式多、消耗少等特點(diǎn)在手性分離分析中具有明顯優(yōu)勢(shì)。目前采用毛細(xì)管電泳法對(duì)麻黃堿和偽麻黃堿進(jìn)行分離的報(bào)道，主要是在分離過(guò)程中加入氨基酸[11]、絡(luò)合物[12-13]、離子液體[14]、有機(jī)添加劑[15]等改變二者的淌度，或?qū)Χ哌M(jìn)行衍生后改變淌度使其分離[16]。本試驗(yàn)以環(huán)糊精衍生物為添加劑，采用毛細(xì)管電泳分離麻黃堿與偽麻黃堿，為麻黃的質(zhì)量控制提供新思路。

1 儀器與試藥

毛細(xì)管規(guī)格為75 mm內(nèi)徑，360 mm外徑（河北永年銳灃色譜器件有限公司）。TriSep-2100電色譜系統(tǒng)（通微，Unimicro Technologies），TriSep2003色譜工作站（通微，Unimicro Technologies），F(xiàn)E20/EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基化-β-環(huán)糊精，山東濱州智源生物科技有限公司；鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，中國(guó)食品藥品檢定研究院；磷酸、氫氧化鈉、甲醇、乙腈、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液及樣品配制

吸取一定體積的0.1 mol/L磷酸，滴加0.1 mol/L Tris至所需pH，然后加入適量水，得到一定濃度的Tris-磷酸緩沖溶液。取適量添加劑，直接加入上述溶液中，即得到含一定濃度添加劑的緩沖溶液，經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾，再超聲脫氣15 min后使用。

稱取鹽酸麻黃堿、酸鹽偽麻黃堿適量，用80%甲醇配成終濃度均約為1.00 mg/mL的混合樣品。

2.2 毛細(xì)管電泳條件

石英毛細(xì)管柱總長(zhǎng)度為60 cm，有效長(zhǎng)度40 cm；溫度為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；虹吸進(jìn)樣，高度10 cm，時(shí)間5 s。每日分析前依次用1 mol/L氫氧化鈉溶液、水、緩沖液對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行沖洗，每次分析之間用電泳緩沖液沖洗2 min。

2.3 分離度計(jì)算方法

麻黃堿和偽麻黃堿分離度計(jì)算：Rs=2（tR2-tR1）/（W1+W2）。其中tR1、tR2分別為兩峰的保留時(shí)間，W1、W2分別為兩峰的峰寬。

2.4 添加劑種類的選擇

麻黃堿和偽麻黃堿為立體異構(gòu)體，可采用環(huán)糊精及其衍生物為手性添加劑對(duì)其進(jìn)行分離。以25 mmol/L Tris-磷酸（pH 3.00）為緩沖溶液，在15 kV電壓條件下，分別以濃度均為15 mg/mL β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精、甲基化-β-環(huán)糊精為添加劑，考察添加劑種類對(duì)分離的影響。

結(jié)果顯示，β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精選擇性較差，改變條件后均未能完全分離麻黃堿與偽麻黃堿；甲基化-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)麻黃堿與偽麻黃堿有很好的分離效果和選擇性，且峰形較好，分離色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。故可選用羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基化-β-環(huán)糊精為添加劑，并進(jìn)行系統(tǒng)的條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.5 緩沖溶液種類的選擇

磷酸鹽緩沖溶液由于可調(diào)pH范圍較寬，因此常用作毛細(xì)管電泳的緩沖溶液。試驗(yàn)考察NaOH-H3PO4和Tris-H3PO4對(duì)分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同pH和濃度條件下2種緩沖溶液體系的分離結(jié)果相似，故選用Tris-H3PO4緩沖體系進(jìn)行濃度和pH的考察。

2.6 緩沖溶液濃度的選擇

以羥丙基-β-環(huán)糊精為添加劑，考察了Tris-H3PO4（pH 3.00）緩沖溶液濃度在10～50 mmol/L范圍內(nèi)變化時(shí)麻黃堿、偽麻黃堿的手性分離效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)，隨著緩沖溶液濃度增高，麻黃堿和偽麻黃堿的分離度逐漸升高。原因可能是緩沖溶液濃度高時(shí)，電滲流較小，樣品和手性添加劑有較長(zhǎng)的相互作用時(shí)間，有利于麻黃堿和偽麻黃堿的拆分。但緩沖溶液濃度較高時(shí)電流較大，焦耳熱現(xiàn)象較嚴(yán)重，容易了生斷流，故選擇濃度為25 mmol/L，通過(guò)改變添加劑濃度、分離電壓等對(duì)分離結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。

2.7 緩沖溶液pH值對(duì)分離的影響

緩沖溶液的pH值一方面影響樣品的帶電性質(zhì)，另一方面對(duì)電滲流的大小有直接影響，因此會(huì)對(duì)分離產(chǎn)生重要影響。試驗(yàn)中使用25 mmol/L Tris-H3PO4為緩沖溶液，分別以羥丙基-β-環(huán)糊精和甲基化-β-環(huán)糊精為添加劑，在10 kV電壓下，考察緩沖溶液pH值對(duì)分離的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，以甲基化-β-環(huán)糊精為添加劑，當(dāng)緩沖溶液pH值為2.42時(shí)，麻黃堿與偽麻黃堿分離效果最好；以羥丙基-β-環(huán)糊精為添加劑，當(dāng)緩沖溶液pH值為3.00時(shí)，麻黃堿與偽麻黃堿分離效果最好。隨著pH值升高，分離度逐漸下降。原因可能是隨著pH值升高，二者逐漸呈電中性，所使用的添加劑均為中性環(huán)糊精，因此2種麻黃堿或二者與環(huán)糊精的包合物遷移速度均與電滲流速度相同，得不到有效分離。在pH 7.0以上的條件下，2種環(huán)糊精對(duì)麻黃堿和偽麻黃堿的分離度均為0。因此，使用甲基化-β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精為添加劑時(shí)，最適的pH值條件分別為2.42和3.00。

2.8 添加劑濃度對(duì)分離的影響

分別以甲基化-β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精為添加劑，在最適pH值條件下，運(yùn)行電壓均為10 KV，考察添加劑濃度對(duì)分離的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。可見(jiàn)，隨著甲基化-β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精濃度增加，麻黃堿和偽麻黃堿的分離度逐漸增加，但增加到一定程度后分離度有緩慢下降趨勢(shì)。甲基化-β-環(huán)糊精濃度在20 mg/mL時(shí)出現(xiàn)最佳分離，羥丙基-β-環(huán)糊精濃度在50 mg/mL時(shí)出現(xiàn)最佳分離。原因可能是隨著添加劑濃度加，麻黃堿和偽麻黃堿與添加劑的相互作用增強(qiáng)，因此分離度增加；而添加劑濃度過(guò)高時(shí)，由于溶液黏度增加，電滲流減小，分離時(shí)間延長(zhǎng)，擴(kuò)散作用嚴(yán)重，造成分離度下降。

2.9 電壓對(duì)分離的影響

分別以甲基化-β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精作為添加劑，在優(yōu)化的pH值條件下，考察不同電壓對(duì)分離的影響，結(jié)果如圖6所示。從圖6結(jié)果可以看出，隨著分離電壓的增大，麻黃堿和偽麻黃堿的分離度逐漸降低，原因可能是隨著電壓的增大，電滲流速度加快，樣品與手性添加劑的作用時(shí)間縮短，因此分離度下降。在此條件下，當(dāng)添加劑為甲基化-β-環(huán)糊精，運(yùn)行電壓為10 kV時(shí)，麻黃堿與偽麻黃堿分離效果最好，分離度達(dá)到1.56；當(dāng)添加劑為羥丙基-β-環(huán)糊精，運(yùn)行電壓為10 kV時(shí)，麻黃堿與偽麻黃堿分離效果最好，分離度達(dá)到2.73。

2.10 有機(jī)溶劑對(duì)分離的影響

有機(jī)溶劑一方面可能會(huì)和客體競(jìng)爭(zhēng)環(huán)糊精空腔，從而不利于環(huán)糊精與客體的包合；另一方面，還可能參與形成環(huán)糊精-客體-溶劑三元包合物，三元包合物一般比二元包合物更為穩(wěn)定，因此可以增強(qiáng)環(huán)糊精與客體的包合作用。這2種相反的作用同時(shí)存在，其產(chǎn)生的最終效果取決于哪種因素占主導(dǎo)地位。本試驗(yàn)考察了加入10%甲醇、10%乙腈對(duì)分離的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。結(jié)果表明，無(wú)論甲基化-β-環(huán)糊精還是羥丙基-β-環(huán)糊精作為添加劑，甲醇或者乙腈的加入均降低了分離效率，且乙腈對(duì)分離度的降低作用更顯著。故認(rèn)為有機(jī)溶劑的加入對(duì)分離產(chǎn)生了不良影響。

3 小結(jié)

甲基化-β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精均能使麻黃堿和偽麻黃堿得到有效分離。使用甲基化-β-環(huán)糊精為添加劑的最佳分離條件為：分離電壓10 kV，25 mmol/L Tris-H3PO4緩沖液（pH 2.42）含20 mg/mL甲基化-β-環(huán)糊精，此條件下麻黃堿和偽麻黃堿的分離度為1.56。使用羥丙基-β-環(huán)糊精為添加劑的最佳分離條件為：分離電壓10 kV，25 mmol/L Tris-H3PO4緩沖液（pH 3.00）含50 mg/mL羥丙基-β-環(huán)糊精，此條件下麻黃堿和偽麻黃堿的分離度為2.73。本研究為麻黃及麻黃制劑提供了一種簡(jiǎn)便、快速、低成本的分析方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：320-321.

[2] PELLATI F， BENVENUTI S. Determination of ephedrine alkaloids in Ephedra natural products using HPLC on a pentafluorophenylpropyl stationary phase[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2008，48（2）：254-263.

[3] 李紅霞，丁明玉，呂琨，等.高效液相色譜法測(cè)定麻黃及其制劑中的麻黃類生物堿和川芎嗪[J].色譜，2001，19（2）：161-163.

[4] ANSELL R J， WANG D. Imprinted polymers for chiral resolution of （±）-ephedrine. Part 3：NMR predictions and HPLC results with alternative functional monomers[J]. Analyst，2009，134（3）：564-576.

[5] HOLNESS H K， JAMAL A， MEBEL A， et al. Separation mechanism of chiral impurities， ephedrine and pseudoephedrine， found in amphetamine-type substances using achiral modifiers in the gas phase[J]. Analytical and bioanalytical chemistry，2012，404（8）：2407-2416.

[6] MORRISON C， SMITH F J， TOMASZEWSKI T， et al. Chiral gas chromatography as a tool for investigations into illicitly manufactured methylamphetamine[J]. Chirality，2011，23（7）：519-522.

[7] BHUSHAN R， MARTENS J， ARORA M. Direct resolution of （+/-）-ephedrine and atropine into their enantiomers by impregnated TLC[J]. Biomedical Chromatography，2001，15（3）：151-154.

[8] AHMAD A， TORGNY R， MAY-BRITT G R， et al. Characterization of sulfated beta-cyclodextrins and determination of enantiomeric purity of （1 R， 2S）-ephedrine by capillary zone electrophoresis[J]. Journal of Separation Science，2004，27（13）：1102-1108.

[9] Hellriegel C， H?ndel H， Wedig M， et al. Study on the chiral recognition of the enantiomers of ephedrine derivatives with neutral and sulfated heptakis （2，3-O-diacetyl）-β-cyclodextrins using capillary electrophoresis， UV， nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2001，914（1/2）：315-324.

[10] Bicker W， Hebenstreit D， L?mmerhofer M， et al. Enantiomeric impurity profiling in ephedrine samples by enantioselective capillary electrochromatography[J]. Electrophoresis，2003，24（15）：2532-2542.

[11] LIU Y M， SHEU S J. Determination of ephedrine alkaloids by capillary electrophoresis[J]. Journal of Chromatography A，1992， 600（2）：370-372.

[12] 鄭一寧，謝天堯，莫金垣，等.雙黃連粉針劑中黃芩苷的高效毛細(xì)管電泳-電導(dǎo)法測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2001，20（6）：21-24.

[13] LI F， DING Z T， CAO Q E. Separation and determination of ephedrine and pseudoephedrine in Ephedrae Herba by CZE modified with a CUOO-L-lysine complex[J]. Electrophoresis，2008，29：658-664.

[14] 馬永鈞，李瓊琳，王偉峰，等.毛細(xì)管電泳-電致化學(xué)發(fā)光法分離測(cè)定麻黃中的麻黃堿、偽麻黃堿與甲基麻黃堿[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012， 31（2）：127-132.

[15] WEI F， ZHANG M， FENG Y Q. Application of poly （methacrylic acid-ethylene glycol dimethacrylate） monolith microextraction coupled with capillary zone electrophoresis to the determination of opiates in human urine[J]. Electrophoresis，2006，27（10）：1939-1948.

[16] 徐靜，李軍，胡強(qiáng)，等.毛細(xì)管電泳/發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光法測(cè)定麻黃中麻黃堿與偽麻黃堿含量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012，31（8）：977-981.