黃芪莖葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

叢晶男 張宇 趙宏 王宇亮 秦永麗 榮芳悅

摘要：目的 建立黃芪莖葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別；采用藥典法測(cè)定黃芪莖葉水分、總灰分、浸出物的含量，采用比色法測(cè)定總皂苷、黃芪多糖的含量，采用HPLC測(cè)定黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)圓整、清晰、重復(fù)性好；黃芪莖葉水分為6.24%～12.24%，總灰分為8.21%～10.55%，水溶性浸出物為12.12%～27.30%，醇溶性浸出物為6.89%～10.28%，總皂苷為23.74～26.52 mg/g，黃芪多糖為23.31～45.70 mg/g，黃芪甲苷為0.047%～0.18%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷為0.21%～0.26%。結(jié)論 所建立的方法簡(jiǎn)便快捷，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能有效控制黃芪莖葉質(zhì)量，可作為黃芪莖葉質(zhì)量的主要控制指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：黃芪莖葉；薄層色譜法；比色法；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.023

中圖分類號(hào)：R282.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）11-0094-05

Abstract： Objective To establish quality standards for stem leaf of Astragali Radix. Methods A method of TLC identification was used for qualitative discrimination. The moisture， total ash and extracts contents of the stem leaf of Astragali Radix were determined by pharmacopoeia method. Total contents of astragaloside and astragalus polysaccharide were measured by colorimetry. The astragaloside Ⅳ and calycosin-7-O-β-D-glucoside contents were detected by HPLC. Results The spots of TLC were round and clear with good repeatability. The moisture contents of the stem leaf of Astragali Radix were between 6.24%–12.24%； the total ash was between 8.21%–10.55%； the water- solubility extracts were between 12.12%–27.30%； alcohol-solubility extracts were between 6.89%–10.28%； the total contents of astragaloside were between 23.74–26.52 mg/g； astragalus polysaccharide were between 23.31–45.70 mg/g； the astragaloside Ⅳ contents were between 0.047%–0.18%； the calycosin-7-O-β-D-glucoside were 0.21%–0.26%. Conclusion The method is convenient， fast and repeatable， and the results are accurate and reliable， which can be used to control the quality of the stem leaf of Astragali Radix effectively， and as the main index of the quality standard.

Key words： the stem leaf of Astragali Radix； TLC； colorimetry； HPLC； quality standard

黃芪為豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge和蒙古黃芪A. membranaceus（Fisch.）Bunge var. mongholicus（Bunge）Hsiao的干燥根[1]。早在漢末時(shí)期，《名醫(yī)別錄》曾記載以黃芪莖葉入藥，其味甘、辛，性平，入心、肝二經(jīng)，具有生津止渴、舒筋活血、消腫療瘡等功效。其豐富的資源及良好的藥用價(jià)值，使黃芪地上部分具有較好的開(kāi)發(fā)利用前景。因此，本研究對(duì)不同采收期的9批黃芪莖葉的主要活性成分進(jìn)行了定性、定量測(cè)定，旨為制定黃芪莖葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、開(kāi)發(fā)黃芪地上部分、擴(kuò)大藥用資源提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

765紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；Waters-D600半制備型色譜儀，美國(guó)Waters公司，包括四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters-2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、Empower色譜工作站；Agilent-1100型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司。

黃芪對(duì)照藥材（批號(hào)120974-201311）、黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781-201314，含量以95.8%計(jì)）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)111920-201304，含量以98.3%計(jì)），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲酸、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水（自制）；黃芪莖葉樣品購(gòu)于哈爾濱綠達(dá)生動(dòng)物藥業(yè)有限公司，由佳木斯大學(xué)藥學(xué)院張宇教授鑒定，為膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge莖葉。樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃芪莖葉中黃芪甲苷的鑒別 黃芪莖葉粉碎過(guò)四號(hào)篩，按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）黃芪項(xiàng)下薄層鑒別法進(jìn)行鑒別。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，紫外光燈（365 nm）下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)。

2.1.2 黃芪莖葉藥材的鑒別 黃芪莖葉粉碎過(guò)四號(hào)篩，按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）黃芪項(xiàng)下薄層鑒別法進(jìn)行鑒別。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。

2.2 檢查

黃芪莖葉粉碎過(guò)四號(hào)篩，按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅸ測(cè)定法測(cè)定水分、總灰分，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 浸出物

黃芪莖葉粉碎過(guò)四號(hào)篩，按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄ⅩA水溶性浸出物及醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的冷浸法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 總皂苷含量測(cè)定

2.4.1 供試品溶液的制備 黃芪莖葉粉碎過(guò)四號(hào)篩，取5 g（精確至l mg），用95%乙醇在索氏提取器中回流6 h，提取液蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?0 mL，供純化用。將上述提取液加于中性氧化鋁柱上，再用50%甲醇50 mL洗脫，洗脫液蒸干，殘?jiān)詿o(wú)水乙醇定容至100 mL，作為供試品溶液[2]。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系考察 精密稱取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品4 mg，蒸餾水定容，得濃度為0.4 mg/mL黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于具塞試管中，水浴蒸干，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，密塞。70 ℃水浴恒溫加熱20 min，冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻。用765紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，以黃芪甲苷質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=0.078 9X-0.005 7，r=0.999 9，線性范圍為0.04～0.2 mg。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果黃芪莖葉中總皂苷含量RSD=0.28%，表明精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h檢測(cè)，結(jié)果黃芪莖葉中總皂苷含量RSD=0.22%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品，制備供試品溶液，平行6份，測(cè)定，結(jié)果黃芪莖葉中總皂苷含量RSD=1.81%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品6份，每份約5 g，精密加入黃芪甲苷對(duì)照品約25 mg，按供試品溶液制備方法制備，結(jié)果見(jiàn)表3。黃芪莖葉中黃芪總皂苷平均回收率為98.88%，RSD=0.26%。

2.4.7 測(cè)定法 精確吸取黃芪莖葉定容液0.1 mL于具塞試管中，置水浴上蒸干，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作項(xiàng)下方法操作，用765紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，按線性方程求出X，再按以下公式計(jì)算黃芪莖葉中總皂苷含量。總皂苷含量（mg/g）=10-3XV定容÷5V樣。

2.5 黃芪多糖含量測(cè)定

2.5.1 供試品溶液的制備 黃芪莖葉粉碎過(guò)四號(hào)篩，取4 g（精確至l mg）于圓底燒瓶中，加蒸餾水40 mL，回流提取2 h，過(guò)濾，殘?jiān)偌铀?0 mL，回流提取2 h，合并2次濾液，離心，上清液濃縮至干，殘?jiān)哉麴s水定容至50 mL，作為供試品溶液[3]。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系考察 精密稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，蒸餾水定容得濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于具塞試管中，加水至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，40 ℃水浴中保溫15 min，冷卻，用765紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y=12.650X+0.026 9，r=0.999 1，線性范圍為0.01～0.5 mg/mL。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果黃芪莖葉中黃芪多糖含量RSD=0.31%，表明精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h檢測(cè)，結(jié)果黃芪莖葉中黃芪多糖含量RSD=0.23%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次黃芪莖葉，制備供試品溶液，平行6份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果黃芪莖葉中黃芪多糖含量RSD=1.64%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品6份，每份約4 g，精密加入葡萄糖對(duì)照品約20 mg，按供試品溶液制備方法制備，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。黃芪莖葉中黃芪多糖平均回收率為98.93%，RSD=0.88%。

2.5.7 測(cè)定法 分別量取供試品溶液0.1 mL定容于10 mL容量瓶中，量取1 mL供試品溶液置于試管中，并分別加入1 mL蒸餾水。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作項(xiàng)下方法操作，用765紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃芪多糖含量。

2.6 黃芪甲苷含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件 色譜柱：依利特C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（32∶68）；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；ELSD漂移管溫度：90 ℃；霧化器模式：加熱（功率60%、36 ℃）；載氣：N2；氣流壓力：40 psi。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液， 0.22 ?m濾膜過(guò)濾，即得[4]。

2.6.3 供試品溶液的制備 黃芪莖葉粉碎過(guò)四號(hào)篩，按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）黃芪項(xiàng)下含量測(cè)定中黃芪甲苷供試品溶液制備方法制備，所得藥液0.22 ?m濾膜過(guò)濾，即得。

2.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液5、8、10、15、20 ?L注入液相色譜儀。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=2.3×104X+2.6×104，r=0.999 2，線性范圍為2.5～10 ?g。

2.6.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果黃芪甲苷峰面積RSD=1.71%，表明精密度良好。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h檢測(cè)，結(jié)果黃芪甲苷峰面積RSD=1.32%，表明樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.6.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次黃芪莖葉平行6份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果黃芪甲苷含量RSD=1.48%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.6.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品6份，每份約4 g，精密加入黃芪甲苷對(duì)照品約5 mg，按供試品制備方法制備，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。黃芪甲苷平均回收率為98.96%，RSD=0.24%。

2.6.9 樣品測(cè)定 取9批黃芪莖葉樣品，按“2.6.3”項(xiàng)下方法處理，精密吸取供試品溶液20 ?L，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算。

2.7 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件 Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～20 min，20%→40%乙腈；20～30 min，40%乙腈），流速1 mL/min，柱溫20 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，色譜圖見(jiàn)圖2。

2.7.2 對(duì)照品溶液的制備 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，0.22 ?m濾膜過(guò)濾，即得。

2.7.3 供試品溶液的制備 黃芪莖葉粉碎過(guò)四號(hào)篩，按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）黃芪項(xiàng)下含量測(cè)定中毛蕊異黃酮葡萄糖苷供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，所得藥液經(jīng)0.22 ?m濾膜過(guò)濾，即得。

2.7.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液5、8、10、15、20 ?L注入液相色譜儀。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=1.58×103X-2.23，r=0.999 5，線性范圍為0.25～1 ?g。

2.7.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD=1.56%，表明精密度良好。

2.7.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h檢測(cè)，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD=1.41%，表明樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.7.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次黃芪莖葉平行6份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量RSD=1.64%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品6份，每份約1 g，精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品約2 mg，按供試品溶液制備方法制備，結(jié)果平均回收率為99.27%，RSD=0.14%，見(jiàn)表6。

2.7.9 樣品測(cè)定 取9批黃芪莖葉樣品，按“2.7.3”項(xiàng)下方法處理，精密吸取供試品溶液10 ?L，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算。

2.8 總皂苷、黃芪多糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定結(jié)果

9批黃芪莖葉樣品中總皂苷、黃芪多糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量分別為25.03 mg/g、35.63 mg/g、0.095%、0.24%，見(jiàn)表7。

3 討論

本試驗(yàn)參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）黃芪項(xiàng)下的鑒別方法對(duì)黃芪莖葉進(jìn)行定性鑒別，所得薄層色譜斑點(diǎn)圓整、清晰、重復(fù)性好。

2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）規(guī)定，黃芪藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)包括水分、總灰分、浸出物、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷等，研究表明黃芪莖葉中還含有總皂苷、黃芪多糖等有效成分[5-6]，故本試驗(yàn)將這2種成分也作為黃芪莖葉的質(zhì)量控制指標(biāo)。

本試驗(yàn)對(duì)不同采收期的9批黃芪莖葉的主要質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行了含量測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，規(guī)定本品水分不得過(guò)15.0%，總灰分不得過(guò)12.0%，水溶性浸出物含量不得少于12.0%，醇溶性浸出物含量不得少于5.0%，總皂苷含量不得少于2.0%，黃芪多糖含量不得少于2.0%；參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）黃芪項(xiàng)下的要求，規(guī)定黃芪甲苷含量不得少于0.040%；毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量不得少于0.020%。

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