腦脊液流式細胞術在兒童中樞神經系統白血病早期診斷中的意義

安美玉+陳芬

[摘要] 目的 探討腦脊液流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）在診斷兒童中樞神經系統白血?。–entral Nervous System Leukemia，CNSL）中的意義。方法 采用單克隆抗體雙重直接免疫熒光素標記法對2015年1 月—2016 年3月期間該院收治的45例可疑中樞神經系統浸潤患兒的腦脊液進行細胞免疫表型分析，同時進行腦脊液細胞形態學（Conventional Cytology，CC）檢測，比較兩種方法的差異。結果 45例患兒中，FCM有15例發現異常免疫表型，陽性率為33.33%，CC發現9例存在原始幼稚細胞，陽性率為20%，兩者差異具有統計學意義（P<0.01）。結論 腦脊液FCM在兒童CNSL的診斷中具有重要的臨床意義。

[關鍵詞] 流式細胞術；細胞形態學；腦脊液；中樞神經系統白血病

[中圖分類號] R725.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）10（b）-0042-03

[Abstract] Objective To evaluate the value of flow cytometric of cerebrospinal fluid cells in the diagnosis of central nervous system leukemia in children. Methods Used Double immunofluorescence staining with monoclonal antibodies，45 cerebrospinal fluid samples who had central nervous system involvement was analyzed with flow cytometric immunophenotyping and conventional cytology in January 2015 to March 2016，the results of flow cytometry were compared with conventional cytology. Results The results showed that 33.33% children had abnormal cells by flow cytometry and 20% children had abnormal cells by conventional cell morphology in 45 cases。The difference had statistical significance （P < 0.01）. Conclusion Flow cytometriy analysis of cerebrospinal fluid has important clinical significance in the diagnosis of CNSL in children。

[Key words] Flow cytometry；Conventional cytology；Cerebrospinal fluid；Immunophenotyping；Central nervous system leukemia

隨著化療方案的改進，我國兒童急性淋巴細胞白血?。╝cutelymphoblastic leukemia，ALL）的療效獲得了顯著改善，兒童ALL誘導緩解率高達91%～94%，5年無事件生存（EFS）率達70%～80%[1-3]。中樞神經系統白血?。–entral Nervous System Leukemia，CNSL）是導致白血病化療失敗的主要原因之一，如何早期診斷CNSL具有重要意義。該文將對2015年1月—2016年3月期間45例急性淋巴細胞白血?。ˋcute Lymphoblastic Leukemia，ALL）的腦脊液進行分析，以研究腦脊液FCM在CNSL診斷中的意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據2014年制定的兒童 ALL診療建議（第四次修訂）為診斷標準[4]，以明確診斷急性淋巴細胞性白血病的患兒為對象，方便選取該院收治的臨床疑似中樞神經系統浸潤45例進行腦脊液CC及FCM檢測。符合以下任何一項，并除外其他原因導致的樞神經系統病變時，列為可疑中樞神經系統浸潤病例：①有神經系統癥狀；②腦脊液常規白細胞計數大于5×106 個/L時；③頭顱核磁或CT提示影像學病變。

1.2 腦脊液細胞常規計數

將留取無菌新鮮腦脊液標本2 mL充入細胞計數板，高倍鏡下計數有核細胞數。

1.3 腦脊液細胞學檢查

吸取 2～3 mL腦脊液，標本離心后涂片，干燥后進行瑞氏染色，顯微鏡下觀察細胞形態，發現原始幼稚細胞則判定結果陽性。

1.4 FCM分析

采用單克隆抗體雙重直接免疫熒光素（FITC/PE）標記法。留取2～3 mL新鮮腦脊液于無菌試管中，離心（1 400 r/min，5 min）后棄上清，留取100 μL，加入相應抗體，充分混勻，在室溫、避光條件下孵育15 min，加入1 mL溶血素1 mL，混勻后避光，室溫放置8 min，離心（1 400 r/min，5 min）棄上清，用PBS洗滌細胞，離心（1 400 r/min，5 min）后，棄上清，加入約3 mL PBS洗滌細胞，離心后棄上清，加入約100 μL PBS后，震蕩混勻，立即上機檢測。流式細胞儀及所有抗體來自美國BD公司。含六種熒光抗體標記：FICT、PE、APC、PerCP、APC-Cy7、PE-Cy7。

1.6 統計方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以例數表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。陽性率指所檢查標本中陽性結果所占比例。

2 結果

2.1 45例兒童ALL的臨床特點

可疑中樞神經系統浸潤者45例，所有病例均進行FCM及CC檢測，其中男性28例， 女性17例， 年齡1～18歲，平均年齡（9.09±5.41）歲，其中B系20例，T系25例。45例病例中3例患兒有頭痛、嘔吐表現，44例患兒腦脊液常規白細胞計數≥5×106個/L，未發現頭顱核磁及CT的影像學改變。兩組檢測方法在年齡、性別、免疫型、白細胞計數及神經系統癥狀方面，差異無統計學意義。見表1。

2.2 FCM與CC兩種方法對45例ALL腦脊液異常細胞的檢測結果

45例懷疑中樞神經系統侵潤者的腦脊液細胞，其中FCM有15例發現異常免疫表型，其中B系6例，T系9例，陽性率為33.33%，CC發現9例存在原始幼稚細胞，其中B系3例，T系6例，陽性率為20%，兩者檢測方法的差異具有統計學意義（P<0.01）。見表2。

3 討論

兒童CNSL發病率在2%～10%之間[5]，目前CNSL診斷金標準仍是腦脊液細胞形態學發現異常幼稚細胞，但腦脊液標本細胞數量少，離體環境下容易發生自溶，受主觀經驗性判斷影響大，容易出現CNSL的誤診及漏診，假陰性率高達20%～60%[6]，單純依靠腦脊液細胞學檢查并不能完全排除CNSL的診斷。FCM的細胞免疫分型是檢測微量異常細胞非常敏感的方法，通過細胞表面標記片段確定各細胞群性質，受細胞形態變化影響小，亦不易受主觀影響，能夠準確的檢測惡性腫瘤細胞，已廣泛用于腦脊液檢查中。

早期CNSL可無臨床表現、影像學陽性發現，甚至腦脊液常規檢查也無細胞數增高。蔣能剛等[7]報道，多參數FCM 分析在細胞數量較少情況下，顯示出明顯優越性。該次130例腦脊液中，發現1例細胞數為4×106 個/L的ALL（T系），CC-FCM+發現異常細胞群，異常細胞群占總細胞的54.14%，表達CD5。在45例懷疑CNSL的腦脊液中，15例診斷CNSL的病例中白細胞數在4～100×106個/L之間有6例，其中FCM+有4例，CC+有2例。腦脊液白細胞計數越高，形態學及FCM越容易發現異常細胞，其中細胞形態學更為明顯。而腦脊液白細胞數少時，FCM相較于CC更敏感。此外，有報道指出[8]，當行FCM及CC檢測時，CC容易受到FCM結果影響。該次研究也存在類似問題，有2例腦脊液發現FCM陽性結果后，CC更改了起初陰性結果的判讀，可見，細胞形態學分析對于良惡性細胞的判斷主觀性仍較強。

腦脊液FCM在CNSL診斷中，具有很高的靈敏度和特異性。Mitri Z等[8]報道，腦脊液流式細胞術和CC的特異性均為100%，但前者的敏感性明顯高于CC，接近100%。Ranta S等[9-11]研究顯示，在高度懷疑中樞神經系統侵潤的淋巴瘤中，FCM的CNSL檢出率是細胞形態學的2～3倍。該研究對70例ALL患兒，共130例次腦脊液標本進行FCM及CC檢測，其中45例懷疑有CNSL可能，CC陽性檢出率為 20%（9/45），FCM的陽性檢出率為33.33%（15/45），是CC檢出率的1.67倍，與報道類似。建議對懷疑有中樞神經系統病變的患者，在進行腦脊液細胞形態學檢測的同時，進行FCM的評估，以提高早期診斷CNSL的陽性率。

綜上所述，腦脊液FCM 的陽性檢出率及準確性明顯高于傳統腦脊液CC方法，對CNSL的診斷具有極大的應用價值，是診斷CNSL方法的重要補充。由于CNSL發病率較低，對于FCM及CC診斷的一致性仍需要今后大樣本進一步研究論證。

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（收稿日期：2016-07-16）