補腎益精方對RCS大鼠視網膜變性損傷的保護作用研究

李雪麗，唐由之，范吉平，，許　凱，梁　潔，梁麗娜

·論著：實驗研究·

補腎益精方對RCS大鼠視網膜變性損傷的保護作用研究

李雪麗1，2，唐由之2，范吉平2，3，許凱3，梁潔2，梁麗娜2

目的從形態及功能兩個方面觀察補腎益精方（BSYJ）對RCS大鼠視網膜變性損傷的保護作用。方法采用先天性視網膜色素變性RCS大鼠作為動物模型，將36只RCS大鼠隨機分為蒸餾水組和BSYJ組，每組18只，分別予蒸餾水及BSYJ水煎劑灌胃（8.8 g·kg-1），每日1次，以SD大鼠作為正常對照組常規飼養。分別于干預7 d、14 d和28 d進行指標觀察，采用視覺電生理儀檢測各組大鼠視網膜電圖變化；HE染色觀察視網膜各層細胞結構和形態的變化，并計數外核層的細胞核數目。結果視網膜電圖結果顯示，與正常大鼠比較，RCS大鼠ERG波幅明顯降低，在7周齡時波幅幾近消失。與蒸餾水組相比，治療7 d時，BSYJ組明視ERG，暗視ERG以及Ops波幅略有提高，但差異無統計學意義（P＞0.05），在治療14d時，BSYJ組暗視ERG波幅值較蒸餾水組明顯提高（P＜0.05），治療28 d時，BSYJ組明視ERG，暗視ERG以及Ops波幅均較蒸餾水組有明顯改善（P＜0.05，P＜0.01）。病理學檢查顯示，與SD大鼠相比，隨著觀察時間延長，RCS大鼠視網膜外核層逐漸變薄，外核層細胞數減少。與蒸餾水組比較，BSYJ組在7 d、14 d、28 d觀察時間點視網膜形態改善，外核層細胞核數目明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。結論BSYJ方對RCS大鼠視網膜變性損傷具有一定的保護作用，可能延緩病情的發展過程。

補腎益精方；視網膜變性；視網膜電圖；外核層；內核層

視網膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是嚴重的致盲性眼病，主要表現為光感受器細胞和色素上皮細胞進行性損傷而導致的視功能障礙〔1〕。目前，典型的RP在世界各地發病率約為1/3000～1/5000〔2〕，世界范圍內約有150萬RP患者〔3〕，且至今尚無有效的治療方法。目前研究的方法主要有藥物干預、基因治療、細胞移植替代、神經營養因子干預〔4-6〕。后三種方法雖極具前景，但由于技術、倫理及價格昂貴等難題限制了其臨床應用的進程。中醫認為RP屬于高風雀目范疇，其病機與腎精不足，目失所養有關。補腎益精方（BSYJ）是唐由之研究員多年治療RP的經驗方，前期臨床初步觀察發現，BSYJ對RP患者的視功能具有較好的改善作用，但缺乏確切的實驗依據以及規范的臨床研究予以證實。為進一步明確BSYJ對視網膜色素變性的作用，本研究選擇先天性RP動物RCS大鼠為動物模型，從形態學及功能兩個方面觀察BSYJ對其視網膜變性損傷的保護作用，為BSYJ臨床治療RP提供實驗依據和理論參考。

1　材料與方法

1.1動物

SD大鼠，18只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供；RCS大鼠，36只，由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供。大鼠均為3周齡，雄性，飼養于屏障環境，室溫控制在20～26℃，相對濕度控制在40～70%，光照12 h明暗交替。

1.2主要試劑及儀器

實驗用藥為BSYJ（藥物組成：首烏，黃精，枸杞子等）按原方配伍制備水煎液濃縮而成，由中國中醫科學院眼科醫院藥學部提供。水合氯醛（國藥集團工業股份有限公司）；鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業有限公司）；鹽酸塞拉嗪注射液（吉林省華牧動物保健品有限公司）；復方托吡卡胺滴眼液（參天制藥中國有限公司）；鹽酸奧布卡因滴眼液（參天制藥中國有限公司）；卡波姆滴眼液（Dr.Gerhard Mann， Chem.-Pharm.Fabrik GmbH，德國）；HE染色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；RETI-scan系統視覺電生理檢測儀、Ganzfeld全視野刺激器（均為羅蘭公司，德國）；EG1150模塊化組織包埋中心HI1210、RM2245輪轉式切片機、HI1210攤片機、HI1220烘片機、DM2500顯微鏡（均為LEICA，德國）。

1.3分組與給藥

SD大鼠18只為正常組（Control group）；RCS大鼠為實驗組動物，共36只，隨機分為蒸餾水組（Vehicle group）和中藥組（BSYJ group），每組18只。中藥組：BSYJ 8.8 g·kg-1灌胃給藥，每日1次，蒸餾水組灌服等量的蒸餾水，分別于7 d、14 d、28 d進行相關指標評價，每個時間點取6只動物，進行相應操作和各個實驗指標測定。

1.4閃光視網膜電圖（flashelectroretinogram，F-ERG）測定

實驗前將各組大鼠轉移至暗房過夜，暗適應后采用鹽酸氯胺酮-鹽酸塞拉嗪混合麻醉藥（v：v=1：7）肌注麻醉大鼠，行雙眼ERG檢測，所有步驟均在暗紅燈下操作。首先，采用復方托吡卡胺滴眼液常規散瞳20 min，再滴鹽酸奧布卡因行角膜表面麻醉。測定前，于角膜中央滴卡波姆眼用凝膠，安裝金箔環狀角膜電極，參考電極和接地電極分別置于大鼠額部中央和同側下肢皮下。以Ganzfeld全視野刺激器進行刺激，檢測暗適應條件下3.0 cd·s·m2ERG和振蕩電位（oscillatory potentials，OPs）；再以30 cd·m2白色背景光下明適應10 min后測定3.0 cd·s·m2ERG。測定過程中，所有刺激間隔時間為30 s，采樣頻率為0.06 Hz；通頻帶為0.3～150 Hz，各電極間阻抗始終保持＜5 kΩ。分別記錄ERG的a波和b波峰時值（ms）和振幅值（μv），并對暗適應條件下3.0 cd·s·m2ERG b波、OPs和明適應條件下3.0 cd·s·m2ERG b波的振幅值（μv）進行統計學分析。

1.5HE染色觀察視網膜組織病理學變化

F-ERG檢查結束后，水合氯醛麻醉大鼠（ip.350mg·kg-1），快速摘取眼球，置于4%多聚甲醛中固定，常規脫水，石蠟包埋，經視神經矢狀面行連續4 μm切片，切片過視神經。常規HE染色，光學顯微鏡下觀察視網膜各層結構變化，計數內核層（inner nuclear layer，INL）和外核層（outer nuclear layer，ONL）細胞核層數，并于400放大倍數，選擇不重疊的4個視野（以視神經為中點的兩側各拍攝2個視野）攝片。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計數每個視野中兩個50 μm長度范圍內ONL的細胞核數并取平均值，進行統計學分析。

1.6統計學方法

用origin 8.0軟件進行統計，各組實驗數據通過正態性分布、方差齊性檢驗后，以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1ERG檢測結果

暗視ERG：由圖1可見，與各自正常組相比，蒸餾水組ERG b波振幅均明顯降低（F=1.19664，P= 2.87068E-5；F=1.1804，P=2.78186E-10；F=0.60715，P=2.44214E-15）；蒸餾水組14 d和28 d未記錄到較典型的ERG反應圖形，且28 d時ERG反應圖形接近熄滅型。BSYJ治療7 d后，RCS大鼠ERG b波振幅與模型組相比沒有明顯差異；BSYJ治療14 d和28 d后，ERG呈現較典型的ERG反應圖形，且b波振幅呈明顯升高，與蒸餾水組相比，差異具有統計學意義（F=1.1804，P=0.01977；F=0.60715，P=1.35215E-5）。

圖1　A各組大鼠暗適應ERG混合反應圖形

圖1　BBSYJ對RCS大鼠暗適應ERG混合反應b波的影響（，n=6）

明視ERG：蒸餾水組和BSYJ組28 d時均無典型的明適應ERG反應圖形，除此外，其余各組均可記錄到典型的明適應ERG反應圖形（圖2A）。與各自正常組相比，蒸餾水組ERG b波振幅值均明顯降低（F=0.67571，P=3.71493E-4；F=2.04519，P=0.01667；F=1.49947，P=2.5325E-9）；BSYJ分別治療7 d和14 d后，ERG b波振幅與各自蒸餾水組相比差異無統計學意義；BSYJ治療28 d后，RCS大鼠明視ERG b波振幅值明顯增加，與蒸餾水組相比（F=1.44947， P=0.02454），差異具有統計學意義（圖2B）。

OPs：除蒸餾水組28 d時無典型的明適應OPs圖形外，其余各組均可記錄到典型的OPs圖形（圖3A）。與各自正常對照組相比，蒸餾水組RCS大鼠OPs總振幅值均明顯降低（F=5.13529，P=8.61137 E-9；F=3.36573，P=4.44844E-12；F=3.21127，P= 7.47635E-14）；而BSYJ治療28 d后，RCS大鼠OPs總振幅值明顯增加，與蒸餾水組相比（F=3.21127，P=0.00608），差異具有統計學意義（圖3B）。

2.2HE染色觀察視網膜組織病理學改變

光學顯微鏡下觀察各組大鼠視網膜HE染色切片（圖4A）。正常組7 d、14 d和28 d大鼠視網膜分層清晰，各層細胞排列整齊，結構無異常（圖4B），INL由4～7層相對較大的細胞核構成；ONL由10～14層排列緊密、相對較小的細胞核構成。蒸餾水組7 d時RCS大鼠視網膜INL由4～6層細胞核組成，ONL由6～8層細胞核組成，與正常組7 d時相比，ONL胞核排列疏松，且數量明顯減少（F=3.05179，P= 1.04968E-8）；BSYJ治療7 d后，視網膜ONL胞核排列整齊致密，數量明顯增加（F=3.05179，P=0.01576）。蒸餾水組14 d、28 d時RCS大鼠視網膜ONL逐漸變薄，由4～6層變為2～4層，細胞核排列更加疏松，可見空泡，特別是胞核數目均明顯減少，與各自正常組比較差異均有統計學意義（F=1.58262，P=2.82334 E-8；F=1.49625，P=1.86896E-13）。BSYJ分別治療14 d和28 d后，ONL能夠維持在5～8層和3～5層，細胞排列相對整齊，胞核的丟失得到明顯控制，與各自蒸餾水組相比（F=1.58262，P=0.01442；F=1.49625，P=1.54975E-5），差異均有統計學意義（表1）。

圖2　A各組大鼠明適應ERG反應圖形

圖2　BBSYJ方對RCS大鼠明適應ERG b波振幅的影響（，n=6）

圖3　A各組大鼠暗適應OPs反應圖形

3　討論

本研究選擇RCS大鼠為研究對象，觀察了BSYJ對實驗性RP的保護作用。RCS大鼠是一種較成熟的視網膜退化性病變動物，具有人類RP的主要特征，是廣泛用于RP病因及治療方法研究的經典模型〔7〕。RCS大鼠出生后2周視網膜形態和功能表現正常，3周時光感受器細胞核數目開始減少，5周后F-ERG波幅值開始下降，約8周時呈熄滅狀態，且光感受器細胞接近消失，在本實驗中也發現，同齡的RCS大鼠與SD大鼠相比，無論是視網膜ERG檢查還是組織病理學觀察，RCS大鼠均出現了明顯的異常改變，提示RCS大鼠在病變過程中，視網膜的形態和功能都出現了類似于RP的改變，這與已有的研究報道〔8〕是相似的。

圖3　BBSYJ對RCS大鼠暗適應OPs總振幅的影響（，n=6）

圖4　A視網膜各層示意圖（HE染色，400×）

圖4　B各組大鼠視網膜組織病理學改變（HE染色，400×）

表1　BSYJ對大鼠視網膜感光細胞數量的影響（，n=6）

表1　BSYJ對大鼠視網膜感光細胞數量的影響（，n=6）

注：①與正常組比較，P＜0.01；與蒸餾水組比較，②P＜0.05，③P＜0.01。正常組：SD大鼠；蒸餾水組和BSYJ組為RCS大鼠。BSYJ：補腎益精方

外核層細胞核數/ 5 0 μ m 7 d 1 4 d 2 8 d正常組2 1 5 ± 2 2 1 9 8 ± 2 2 1 8 2 ± 1 2蒸餾水組1 1 3 ± 8①9 4 ± 1 1①4 4 ± 6①B S Y J組1 4 0 ± 9②1 2 4 ± 1 2②8 0 ± 9③組別

本實驗以BSYJ對3周齡RCS大鼠進行治療，于治療7 d，14 d，28 d后分別進行相關評價。結果發現，BSYJ治療14 d后暗視ERG波幅值較蒸餾水組顯著增加，BSYJ治療28 d的RCS大鼠暗視ERG、明視ERG波幅值及OPs上升支節律性小波〔9〕總振幅值與蒸餾水組相比均明顯增加。暗視ERG及明視ERG主要反映了視桿細胞和視錐細胞的功能，而OPs被認為起源于內層視網膜，可能來自無長突細胞到雙極細胞間的抑制性反饋回路〔10〕，這表明BSYJ能夠較好的維持并改善RCS大鼠外層視網膜和內層視網膜的功能。本研究進一步通過組織病理學觀察了RCS大鼠視網膜的形態結構。隨著鼠齡的增加，RCS大鼠視網膜外核層逐漸變薄，細胞核排列漸變疏松且數目減少；而BSYJ治療7 d、14 d、28 d后視網膜各層結構排列相對規整，外核層層數以及細胞核密度較蒸餾水組明顯增加，表明視網膜形態和結構得到了改善。

中醫認為RP是由于先天稟賦不足或臟腑內損，氣血不足，真元耗傷，精氣不能上榮于目所致，故以“補腎益精”為其基本治則。BSYJ由唐由之研究員多年臨床經驗總結而得，該方重用制首烏、黃精為君藥，以補肝腎、益精血、填精髓，枸杞子滋養肝腎、益精明目，菟絲子補腎益精、養肝明目共為臣藥，同時佐以其它理氣活血之藥，使其補而不滯，靜中有動，精血得以上注暢達于目〔11〕，使髓海得充，目絡得養，共奏補腎明目之功效。現代藥理學研究表明，制首烏的有效成分二苯乙烯苷對神經細胞有保護作用，并且能促進神經干細胞的自我更新，向神經元方向分化〔12-13〕。黃精中有效成分黃精多糖對APP轉基因小鼠學習記憶能力及海馬CAI區超微結構具有改善作用，可使腦組織中神經元數目增多，神經變性減輕〔14〕。枸杞子自古被譽為“養肝明目”之圣藥，近年來的研究表明枸杞子及其多糖成分對防治RP、年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、青光眼等眼部疾病均有一定功效〔15-19〕。隨著現代藥理研究的逐步深入，各單味藥的作用機制也將更加明確，這不僅為BSYJ治療實驗性RP的研究提供重要依據，也為其進一步開發提供重要參考。

綜上所述，本研究初步證明BSYJ對RCS大鼠視網膜進行性損傷具有較好的保護作用，一定程度上延緩了疾病的進程，但其作用環節及機制還有待進一步研究闡明。

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Study of Bushenyijing Decoction's protective effect on retinal degeneration in RCS rats

LI Xueli,TANG Youzhi,FAN Jiping,et al.
Post-doctoral Research Station,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing, 100700,China

OBJECTIVE To investigate the effect of Bushenyijing Decoction（BD）on retinopathy in RCS rats by studying the retinal function and histopathology.METHODS Royal College of Surgeons（RCS）rats were used as an animal model of retinal degeneration.Thirty-six RCS rats were randomly divided into two groups:the distilled water group and the Bushenyijing Decoction（BD）group while SD rats were used as normal control group.The mice of BSYJF group were administrated with Bushenyijing Decoction（BD）solution by gavage（8.8 g·kg-1）,and the mice in distilled water group were treated with distilled water by gavage,while the SD mice were fed normally.At the 7thdays,14thdays and 28thdays after treatment,their effects were assessed respectively.The flash electroretinogram（FERG）was used to detect the function of the retina.Hematoxylin-eosin（HE）staining was used to evaluate the retinal histopathological changes and the number of photoreceptor nucleiin the outer nuclear layer（ONL）.RESULTS The ERG result showed that in contrast with normal control group,the amplitude of RCS rats was significantly decreased,and it almost disappeared when the RCS rats were 7 weeks old.At 7thday after treatment,in comparison with the distilled water group,the amplitude of photopic ERG,scotopic ERG and Ops of the Bushenyijing Decoction（BD）group was increased slightly,but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.At 14thday after treatment,b-wave amplitudes of scotopic ERG in the BSYJ group was significantly higher than the distilled water group（P＜0.05）.At 28thday after treatment, the amplitudes of scotopic ERG,photopic ERG,andOPs in Bushenyijing Decoction（BD）group were all markedly higher than that in distilled water group（P＜0.05,P＜0.01）.It was shown by pathological examination that in comparison with SD mice,the ONL layer in the RCS rats attenuated gradually,and the number of nucleus decreased either.Comparing with the distilled water group,the pathological change in the BSYJ group was improved and more nuclei were preserved at all three time points.（P＜0.05,P＜0.01）.CONCLUSION BThe Bushenyijing Decoction（BD）had protective effect on retinal degeneration lesion in RCS rats,and it might delay the development process of retinal degeneration.

Bushenyijing Decoction（BD）;retinal degeneration;flash electroretinogram;outer nuclear layer; inner nuclear layer

R285.5

A

1002-4379（2016）03-0144-06

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.03.002

國家自然科學基金（81473736）；國家人力資源和社會保障部留學人員科技活動擇優項目

1中國中醫科學院博士后流動站，北京100070 2中國中醫科學院眼科醫院，北京100040 3中國中醫科學院，北京100070

梁麗娜，E-mail：lianglina2001@hotmail.com