長程表面等離子體共振生物傳感器的制備與應用

褚立強，陶 順，王 磊，鄒雪娜

（天津科技大學化工與材料學院，天津 300457）

長程表面等離子體共振生物傳感器的制備與應用

褚立強，陶 順，王 磊，鄒雪娜

（天津科技大學化工與材料學院，天津 300457）

長程表面等離子體共振（LRSPR）是超薄金屬膜兩側的衰逝場發生耦合后所形成的一種新型表面光學現象.與傳統的表面等離子體共振（cSPR）相比，LRSPR的表面衰逝場具有更強的表面電磁場強度、更長的表面傳播距離以及更大的穿透深度.因此，基于 LRSPR現象的生物傳感器被認為特別適合細胞或細菌等較大生物分子的檢測及行為研究.為了更好地了解LRSPR生物傳感器的最新研究進展，本文總結了LRSPR的光學原理、生物傳感芯片的制備以及LRSPR傳感器在生物檢測領域的最新應用.

生物傳感器；長程表面等離子體共振（LRSPR）；氟碳薄膜；熒光光譜；拉曼光譜

生物傳感器在臨床診斷、生命科學研究、環境監測、食品與國防安全等諸多領域具有十分廣泛的應用前景，因此生物傳感器的研究與開發吸引了世界各國科學家的普遍關注.基于表面等離子體共振（SPR）現象的生物傳感器具有無需標記、高靈敏、對樣品無損傷、可在液體環境中動態實時檢測等眾多優勢［1-2］，從而成為過去30年中發展最快的一種光學生物傳感技術，被廣泛地應用于各種生物分子的原位實時檢測［3-6］.

近年來，隨著對低濃度（＜1，ng/mL）和低分子質量生物分子（MW＜1，000）檢測的需求不斷擴大，人們開始探索各種方法提升傳統表面等離子體共振（cSPR）傳感器的檢測靈敏度［7］.盡管 cSPR已經被應用于細胞等生物大分子的研究，但是由于cSPR的衰逝場穿透深度（Lp）大概在 100～150，nm，僅僅能夠檢測到細胞的一小部分［8］.針對 cSPR技術的上述兩個局限，人們開始研究長程表面等離子體共振（LRSPR）生物傳感器.與cSPR相比，LRSPR生物傳感器是在高折射率棱鏡和貴金屬薄膜之間增加一定厚度的介電緩沖層，金屬薄膜兩側的表面電磁場發生相互耦合，所形成的新衰逝場具有更強的表面電磁場強度、更長的表面傳播距離和更大的穿透深度［9-11］.因此，LRSPR生物傳感器被認為特別適合于細胞或細菌等較大生物分子的檢測及行為研究［12-14］. 此外，LRSPR表面衰逝場可以激發金屬表面更廣和更遠范圍內的熒光或拉曼信號分子［15-19］，從而提高傳統光學技術的檢測靈敏度.

LRSPR光學現象在1969年Otto研究cSPR時就已經被討論過［20］，但是當時并沒有提出這個概念.直到20世紀80年代初，Sarid和Quail等研究組才從理論和實驗證實了 LRSPR的激發原理［21-23］.2001年Nenninger等［24］利用LRSPR傳感器檢測溶液的折光指數，結果顯示經過優化的 LRSPR傳感器的檢測靈敏度是cSPR的7倍，之后LRSPR作為傳感器才開始受到關注.2005年 Wark等［25］首次報道了LRSPR顯微成像技術用于生物小分子DNA的檢測，其檢測靈敏度與 cSPR相比可以提高 40%，.最近幾年，LRSPR生物傳感器被成功用于各種條件下細胞或細菌的行為研究，因此這種新型生物傳感器開始獲得越來越多的認可.為了更好地了解 LRSPR生物傳感器技術，本文從 LRSPR的光學原理、生物傳感芯片的制備以及其在生物檢測領域的應用等幾個方面述評該技術.

1　LRSPR原理

目前LRSPR生物傳感器通常是基于Kretschmann構型，即利用高折射率棱鏡在一定光波條件下激發LRSPR，因此本文主要介紹該種設計 LRSPR的物理原理.LRSPR是超薄貴金屬膜兩側金屬/介電質界面上的衰逝場發生耦合后所形成的一種新型表面光學現象.根據SPR物理理論，金屬中的電子自由運動形成所謂的“電子氣體”，受到表面限制形成電荷密度分布，被認為是一種“等離子體”.它們在電磁波的干擾下發生電荷密度振蕩，具有電磁波的特性，被稱為“表面等離子體共振（SPR）”.關于 cSPR的詳細物理理論及應用，可閱讀其他綜述［2］.

當采用較薄的金屬膜并且金屬膜兩側介電質的折光指數相同或接近時，金屬膜兩側的 SPR衰逝場可以透過金屬膜而發生耦合作用，進而形成一個新的表面增強電磁場，即所謂的LRSPR［26］.如圖1所示，cSPR中常用的金膜厚度為50，nm，而LRSPR中金膜的厚度多在 15～30，nm.根據傳統的電磁學理論，LRSPR本質上是一種表面縱向（TM）電磁波，在金屬/介電質界面上沿 x方向以衰減諧振波形式傳播，在 z方向 LRSPR的電磁場強度呈指數衰減，即在 z方向形成衰逝場.衰逝場對于介電質的介電常數變化非常敏感，因此可以利用 LRSPR現象來檢測金屬表面的物質變化.

圖1　LRSPR和 cSPR的芯片結構及表面衰逝場比較示意圖Fig.1　Schematic comparison between LRSPR and cSPR in their chip structures and evanescent fields

理論模擬計算獲得的兩種不同介電緩沖層材料構建的 LRSPR與 cSPR表面電磁場強度分布如圖2［27］所示.

圖2　理論模擬獲得兩種LRSPR和cSPR的表面電磁場強度分布比較圖Fig.2　Comparison of the simulated electromagnetic field intensity profiles between two LRSPR chips and one cSPR

從圖 2可以發現，LRSPR衰逝場的表面電磁場強度是入射光強度的約 150倍，即具有表面增強效應，可以用于增強拉曼或熒光等光學信號.另外，圖2也顯示 LRSPR衰逝場在介電質中的穿透深度 Lp在484～1，037，nm，遠遠大于cSPR的約150，nm穿透深度，所以 LRSPR可用于細胞等較大生物分子的檢測.LRSPR的激發受入射光波長和入射角度、棱鏡的折光指數、金屬膜的厚度與折光指數、介電緩沖層的厚度與折光指數、芯片表面粗糙度等多因素的影響.

2　LRSPR芯片的制備

根據LRSPR的原理及圖1所示，LRSPR芯片的主要組成部分包括介電緩沖層和金屬薄膜.考慮到金屬薄膜的穩定性和可修飾性，LRSPR芯片中最常用的是金膜（Au），最近也有報道用金-銀雙金屬薄膜［28］.金膜通常是通過熱蒸鍍法或磁控濺射法來沉積制備，金膜厚度可以通過沉積時間來控制.金膜厚度的細微誤差對于LRSPR的激發及最終檢測效果都至關重要.當金膜的厚度低于 20，nm時，由于金的吸收作用顯著增強，所以并不適合于構建 LRSPR傳感器［11］.除了厚度，其表面粗糙度對最終 LRSPR傳感器的性能也有一定影響［11，29］.

構建LRSPR芯片的另一個關鍵是介電緩沖層的的制備.根據LRSPR的原理，介電緩沖層需要滿足4個要求：①介電緩沖層與檢測環境的折光指數盡量接近，這樣才可以在金膜兩側形成對稱環境.對于生物傳感應用，分析物通常是水相樣品，因此介電緩沖層的折光指數要接近于水（nw≈1.33）；②介電緩沖層的厚度要可以調控，因為不同厚度的金膜需要采用不同厚度的介電緩沖層；③介電緩沖層與玻璃基底和金膜都要有很好的黏附性，保證芯片在液體環境中具有一定穩定性；④介電緩沖層要具有較低的表面粗糙度，避免表面粗糙造成的 LRSPR表面衰逝場的減弱.

考慮到對折光指數的特殊要求，可以用于LRSPR芯片制備的緩沖層材料多為含氟化合物或聚合物，包括氟化鎂、共聚物 Teflon AF1600、聚合物Cytop、等離子體沉積氟碳薄膜ppPFOE等，這幾種材料的基本特性列在表1中.氟化鎂是LRSPR領域中使用時間最長的一種材料，可以通過熱蒸鍍法方便地控制膜厚度［30］.氟化鎂的折光指數 nd≈1.38，與水相比略高.氟化鎂具有一定的毒性，并且在水中具有（極低）溶解性，因此限制了這種材料在生物傳感器領域內的應用.

表1　LRSPR芯片中常用介電緩沖層材料的特性比較Tab.1 Comparison of various dielectric buffer materials used for the fabrication of LRSPR chips

Teflon AF1600是美國杜邦公司生產的一種可溶于特殊溶劑的含聚四氟乙烯共聚物［27］，其折光指數nd≈1.31，比水的折光指數低.該材料可通過旋轉涂層法來制備不同厚度的薄膜.由于其介電常數與水接近，因此所制備的 LRSPR芯片可以獲得很高的表面電磁場強度和最大的穿透距離（見圖 2）［11，27，23］.不過，該材料的表面能低，造成其與玻璃基底和金膜之間的黏附性較差，所制備芯片存儲一段時間后氟碳薄膜會從玻璃上脫離下來.為了提升Teflon AF1600與玻璃基底的黏附性，在旋涂前要先在玻璃基底上涂一層氟硅烷溶液，形成自組裝層［31］.另一方面，在沉積金膜之前，也需要對Teflon AF1600進行表面處理或者沉積另外一層高表面能薄膜［27］.因此整個芯片制備過程非常繁瑣且耗時長.

Cytop是日本Asahi公司提供的一種可溶性含氟聚合物，該聚合物與玻璃基底和金膜的黏附性要優于Teflon AF1600［27，29］.另外，Cytop的折光指數 nd≈1.34，與細胞或細菌的折光指數接近（nc≈1.35～1.38）［8］.因此，近年來在研究細胞行為時多采用Cytop材料構建 LRSPR芯片［11，25］.Cytop和 Teflon AF1600 兩種聚合物均要溶于特定的溶劑，通過調節溶液濃度和旋轉涂層的速度來控制介電緩沖層膜厚.之后相應的溶劑必須采用熱處理等技術去除.旋轉涂層法制備薄膜的厚度并不能連續可調，另外該方法也不適合于大規模生產.

2015年，本課題組提出利用等離子體聚合法沉積ppPFOE氟碳薄膜來構建LRSPR芯片［32］.以十七氟-1-癸烯為單體（PFOE），通過調節射頻等離子體反應器的操作參數和沉積時間，直接在玻璃基底上沉積各種厚度的 ppPFOE薄膜.該薄膜的折光指數nd≈1.38，與傳統的氟化鎂基本一致.考慮等離子體聚合過程的特點，ppPFOE薄膜具有交聯網絡結構，與玻璃基底和金膜具有很好的黏附性，而且在水中和乙醇中都具有很好的穩定性.

圖 3是本課題組利用光學波導譜（OWS）來檢測1，678，nm厚 ppPFOE膜在水中時的厚度和折光指數變化［32］.可以看出其折光指數 nd在 8，h內變化僅為0.000，9，而膜厚在8，h內的變化也僅為23.7，nm（即總膜厚度的1.4%，），基本保持穩定.利用ppPFOE膜來構建 LRSPR芯片過程步驟簡單（見圖 4），等離子體聚合操作容易，無需溶劑，膜厚容易控制，所構建芯片具有較好的檢測效果.考慮該方法適合于大規模生產，因此該方法對于未來實現 LRSPR芯片的大規模制備及應用具有重要意義.

圖3　OWS測試ppPFOE薄膜在水中的厚度和折光指數變化Fig.3 Evolution of the thickness and the refractive index of a ppPFOE film in water as measured using OWS

圖4　等離子聚合沉積法制備LRSPR芯片的過程示意圖Fig.4 Schematic representation of the preparation of LRSPR chip by using plasma polymerization technique

3　LRSPR生物傳感器的應用

過去十多年中LRSPR生物傳感器已經被用于檢測各種生物分子，其中包括 DNA［25］、病毒［33-34］、細胞［35-36］、細菌等［37-38］.與 cSPR類似，LRSPR生物傳感器需要固定不同的生物分子識別體系（BIE），讓待測樣品流過傳感器表面，若樣品中有物質能夠與芯片表面的 BIE發生特異性結合，就會引起反射光信號的變化［39］.

Wong等［33］報道了利用LRSPR生物傳感器來直接檢測人體血液中的登革熱病毒.他們比較了兩種BIE固定方法對傳感器檢測性能的影響.結果表明LRSPR生物傳感器完全可以實現對血液中的登革熱病毒的有效檢測.表面血漿固定法相比于傳統的抗原固定法，減少了非特異性結合的發生，提高了檢測儀器的靈敏度與準確度.前者所得實驗結果可以和酶聯免疫法（ELISA）所測實驗結果相媲美，進一步印證了LRSPR傳感器的可靠性。

2015年Beland等［14］利用LRSPR生物傳感器對尿液中的致病菌進行檢測.實驗結果表明，該方法對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有良好的選擇性，且濃度檢測限可以低至1×105mL-1（國際認可的對尿路感染診斷的濃度閾值）.Krupin等［35］利用LRSPR生物傳感器檢測人血液中紅細胞.實驗結果證明，經抗 A型血免疫球蛋白修飾的傳感器表面，可以對 A型、AB型紅細胞選擇性識別，檢測限可以低至 3×105mL-1.

B型淋巴細胞白血病的病人血清溶液中免疫 G蛋白的κ/λ 值會出現異常.如果能對血清中免疫G蛋白的κ/λ值進行檢測，就可以實現B型淋巴細胞白血病的快速診斷.Krupin等［36］利用LRSPR生物傳感器直接檢測樣品中免疫 G蛋白的κ/λ值.實驗數據表明，在對High Lambda、High Kappa、Normal 3種類型血清溶液的檢測中，反向法得到的κ/λ 值和目前醫療診斷時用的密度計法得到的值在趨勢上保持一致，且在對High Lambda血清溶液的檢測上，反向法得到的結果比密度計法所得結果值還要高.這說明 LRSPR生物傳感器可以有效分辨 G蛋白成分的區別，并能快速得到樣本中免疫G蛋白的κ/λ值.

細胞的形態變化反映著細胞的新陳代謝、內骨架重組、運動能力、浸潤性等生物信息.LRSPR生物傳感器的衰逝場具有較大的穿透深度，因此可以穿過細胞膜深入到細胞內，對細胞內高折射指數區域內的成分（如肌動蛋白纖維等）變化進行跟蹤檢測.Vala等［13］以 Cytop為介電緩沖層構建 LRSPR生物傳感器，并將其用于實時監測鼠腎部上皮細胞在不同滲透壓環境下的形態變化.實驗結果表明，LRSPR傳感器能夠有效地反映出細胞體積的變化，并且比cSPR生物傳感器的響應更快，強度更高，檢測信號更準確.

2012年Chabot等［40］以Teflon AF1600為介電緩沖層構建LRSPR生物傳感器，之后研究HEK-293細胞對不同濃度脂多糖（LPS）的毒性反應.結果表明其檢測靈敏度比 cSPR要高 50%，.最近，Yang等［12］利用LRSPR生物傳感器對纖維原細胞和人乳腺癌細胞的微移動進行監測.研究發現，LRSPR生物傳感器對于由細胞的微移動導致的光學波動能夠產生很強的檢測信號，而cSPR生物傳感器的檢測信號在整個變化過程中始終很弱.

2014年 Mejard等［41］系統地比較了 LRSPR和cSPR兩種生物傳感器檢測3T3小鼠成纖維細胞在表面的吸附和擴展過程.在不同細胞吸附密度時測量的cSPR和LRSPR譜圖，以及不同密度下的細胞光學圖片如圖5［41］所示.，結果顯示，盡管在這個研究中LRSPR與cSPR的靈敏度沒有很大區別，但是LRSPR傳感器的分辨率要高于cSPR.作者認為LRSPR可能更適合檢測細胞內發生的變化.

圖5　不同密度3T3細胞條件下的cSPR和LRSPR譜圖以及不同密度下光學圖片Fig.5 Experimental spectra recorded for cSPR and LRSPR sensor at different cell coverage values and the optical micrographs at three different cell coverage of 3T3 cells

4　LRSPR增強熒光或拉曼光譜

LRSPR的表面增強電磁場可以激發其穿透深度內熒光或拉曼信號分子［42-43］.2006年 Kasry等［42］發現在 LRSPR增強熒光生物傳感器中，隨著入射角的變化，熒光信號的強度也會相應改變，在共振角附近達到最大值.因此，可以通過反射性光譜調節熒光增強的最佳角度，然后以此角度進行相應的熒光檢測. 2007年 Dostalek等［11］系統比較了 LRSPR和 cSPR兩種傳感器激發熒光分子的性能與熒光分子到金膜的距離之間的關系.當熒光分子距離金膜表面為460，nm時，LRSPR由于具有大的穿透深度，因此依然可以激發熒光信號.而 cSPR則不能有效激發熒光，這個結果表明 LRSPR增強熒光將獲得更高的檢測靈敏度.當熒光分子分布在 LRSPR衰逝場全部范圍內時，LRSPR增強熒光的信號強度是cSPR的12倍.之后 Huang等［44］將水凝膠波導層（HOW）引入到LRSPR增強熒光傳感器芯片上，以提高表面捕捉熒光信號分子的能力.圖6［44］是Huang等設計芯片的結構示意圖，利用LRSPR和HOW共同作用來提高熒光檢測信號強度，對免疫球蛋白分子的檢測極限可達到 20，fmol.

圖6　LRSPR與HOW結合增強熒光檢測芯片結構示意圖Fig.6　Schematic representation of fluorescence detection chips through combining LRSPR and HOW

LRSPR增強熒光光譜也被應用于精液中的前列腺游離特異抗原［45］和牛奶中的黃曲霉毒素［19］的檢測.前者的抗原識別采用夾心型模式［45］，即先在芯片表面固定過量的抗體 Ab，然后加入一定量的未標記抗原 Ag，免疫反應后，再加入已標記熒光物質的抗體L-Ab.熒光強度越大表明抗原Ag的濃度越大.后者的抗原識別采用競爭型模式［19］，即先在芯片表面固定一定濃度的抗體 Ab和標記抗原 L-Ag，隨后被加入的未標記抗原Ag和標記抗原L-Ag競爭結合抗體 Ab.熒光強度越小表明未標記抗原 Ag的濃度越大.實驗數據表明，該LRSPR增強熒光生物傳感器對精液中前列腺游離特異抗原的檢測限低至 34，fmol，對牛奶中黃曲霉毒素的檢測限低至 1，pg/mL.相比于普通的熒光分析，檢測限降低了至少三個數量級，且整個檢測過程只需要不到1，h就能完成.Huang等［46］研究LRSPR增強熒光生物傳感器對溶液中大腸桿菌的檢測能力.結果表明，該傳感器對于大腸桿菌的濃度變化非常靈敏，檢測過程不超過 40，min，檢測限低至10，mL-1.之后Huang等［16］還系統研究了溶液流動等對細菌檢測的影響.

表面增強拉曼散射（SERS）經過40多年的發展，已經在材料分析、生物、醫學、食品安全、環境監測和國家安全等領域獲得了實際應用.SERS技術的主要優點包括無需標記，可直接獲得化學結構信息，靈敏度高，不受水干擾等.2011年Liu等［17］首先報道了利用LRSPR表面衰逝場來增強SERS信號.他們以氟化鎂為介電緩沖層制備了LRSPR芯片，檢測4-巰基吡啶在銀膜表面的拉曼光譜.由于 LRSPR具有更強的表面電磁場，信號是傳統SPR增強拉曼散射的15倍以上.之后該研究組進一步在 LRSPR模式上引入了單層AgNPs［18］，理論模擬顯示在銀膜與AgNPs之間將產生 2.1×104倍的電磁場增強，實驗結果顯示SERS信號提高了 40倍，這種條件下增強因子（EF）達到 9.2×108.該技術還允許通過調節入射光角度來調節衰逝場的穿透深度，進而調節被激發信號分子的范圍［47］.

5　結論與展望

LRSPR生物傳感器的制備與應用是一個涉及生物、物理、化學、材料、醫學等多學科交叉的研究領域.過去限制 LRSPR生物傳感器發展的主要困難是制備過程繁瑣及芯片穩定性低，因此人們對 LRSPR芯片的制備技術進行了不斷的優化與完善.以Cytop為原料，通過旋轉涂層法制備的 LRSPR芯片完全可以滿足實驗室研究的需要.最近，本課題組提出使用ppPFOE氟碳薄膜來構建芯片，盡管其折光指數偏高，但是可以實現大規模生產，相信可以促進本領域的發展.

經過20多年的研究，人們對于LRSPR芯片的結構與性能之間的關系已經有了一定的認識.其中最關鍵的一個問題是貴金屬薄膜的制備.很多研究組（包括我們）都發現金膜厚度的細微變化對于LRSPR的譜圖影響非常大，不同厚度金膜又需要用不同厚度的介電緩沖層與之匹配.目前常用的熱蒸鍍法和磁控濺射法制備金膜時對厚度的控制并不準確，因此未來還需要重點研究超薄金膜的制備技術.

近年來 LRSPR生物傳感器在生物檢測領域獲得了越來越多的關注.盡管有些報道顯示其靈敏度等要優于cSPR，不過也有些研究顯示其優勢并不明顯.最新的研究報道顯示，LRSPR生物傳感器在研究細胞或細菌的動態行為時具有一定的優勢，不僅可以實時監測細胞的吸附、分散、微移動和體積形態變化，而且可以跟蹤細胞對外界刺激或物質的反應過程.LRSPR生物傳感器穿透深度大，使其可能用于檢測細胞間相互作用或細胞內部反應過程.

不過，當利用LRSPR生物傳感器檢測細胞的折光指數變化時，并不能區分細胞中不同成分的變化.將 LRSPR與熒光或拉曼光譜技術聯用可以進一步增強靈敏性，而且可以通過標記分子或直接利用拉曼特征峰來區分細胞內不同成分.相信聯用技術在未來會有更大的發展前景.到目前為止還沒有將LRSPR和拉曼聯用技術用于生物檢測方面的報道，本課題組未來將嘗試這方面的研究.

總之，關于LRSPR生物傳感器的制備與應用研究才剛剛開始，對于LRSPR芯片的結構設計還需要優化和完善.相信隨著LRSPR芯片制備技術、光學檢測裝置、數據模擬分析等方面的發展，LRSPR生物傳感器在復雜樣品實時監測、細胞功能調控、藥物篩選等領域將獲得越來越廣泛的應用.

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責任編輯：周建軍

Preparation and Applications of Long-range Surface Plasmon Resonance Biosensors

CHU Liqiang，TAO Shun，WANG Lei，ZOU Xuena
（College of Chemical Engineering and Materials Science，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Long-range surface plasmon resonance（LRSPR）is a novel surface optical phenomenon by coupling the evanescent fields on the opposite interfaces of an ultrathin metallic film embedded between two dielectric layers with same/similar refractive indices.In contrast to conventional surface plasmon resonance（cSPR），LRSPR exhibits a stronger surface electromagnetic field，a longer propagation length，as well as a larger penetration depth.Consequently，LRSPR-based biosensors are believed to be particularly suitable for the detection of large biomolecules（e.g.，cells，bacteria，etc）and the real-time monitoring of cellular behavior.In order to better understand the state of the art in LRSPR biosensors，we herein summarize the physical principles behind the LRSPR，the fabrication of LRSPR chips and their biosensing applications.

biosensors；long-range surface plasmon resonance（LRSPR）；fluorocarbon thin films；fluorescence spectroscopy；Raman spectroscopy

O657.3

A

1672-6510（2016）04-0001-08

10.13364/j.issn.1672-6510.20160105

2016-03-24；

2016-05-06

教育部新世紀優秀人才支持計劃資助項目（NCET-12-1064）

褚立強（1974—），男，遼寧綏中人，教授，chuliqiang@tust.edu.cn.