利用谷氨酸棒桿菌轉化法合成4-羥基異亮氨酸

溫 冰，張成林，麻 杰，陳鵬杰，謝希賢，徐慶陽，陳 寧

（代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

利用谷氨酸棒桿菌轉化法合成4-羥基異亮氨酸

溫 冰，張成林，麻 杰，陳鵬杰，謝希賢，徐慶陽，陳 寧

（代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

4-羥基異亮氨酸（4-hydroxyisoleucine，4-HIL）具有葡萄糖依賴的促進胰島素分泌的活性，在 L-異亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）生產菌株谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）YILW 中過表達來源于蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）TCCC11826的L-異亮氨酸羥化酶（L-isoleucine dioxygenase，IDO）編碼基因ido，以期利用微生物轉化法合成 4-HIL，并研究α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）和 Fe2+添加量對菌株合成 4-HIL的影響.結果表明：構建的C. glutamicum YILW-IDO菌株能夠表達出有活性的IDO，并能夠利用菌體自身合成的L-Ile以及培養基中的α-酮戊二酸合成4-HIL.此外，α-酮戊二酸和Fe2+均能影響4-HIL的合成，在其添加量分別為40，mmol/L和4，mmol/L條件下，培養50，h，4-HIL產量達（35.7±1.0）mmol/L.本研究可為4-HIL及氨基酸衍生物的生物制造提供理論依據.

4-羥基異亮氨酸；L-異亮氨酸羥化酶；谷氨酸棒狀桿菌；微生物轉化

4-羥基異亮氨酸（4-hydroxyisoleucine，4-HIL）是一種自然界存在的非蛋白質氨基酸，主要存在于胡蘆巴屬植物種子中［1］.研究表明4-HIL具有葡萄糖依賴的促進胰島素分泌的活性，當葡萄糖濃度高于8.3，mmol/L時4-HIL能夠明顯促進胰島素分泌，且該活性隨血糖濃度的升高而增強，但當葡萄糖濃度低于該值時，4-HIL無此活性.此外，4-HIL還具有加速脂肪代謝、降血脂和保護肝功能的作用［2-6］，可見4-HIL具有廣泛的應用前景和市場需求.

4-HIL的合成方法包括提取法、化學合成法和酶法，目前主要采用提取法工業化生產 4-HIL.此方法獲得的4-HIL構型較多，但僅（2S，3R，4S）-4-HIL具有上述生物學活性，從而使得該方法存在提取率低（僅為 0.091%～0.60%，）、分離純化困難、原材料需求量大、成本高等不足［3，7］.因此利用 L-異亮氨酸羥化酶（L-isoleucine hydroxylase，IDO）特異性合成（2S，3R，4S）-4-HIL是較為理想的方法.

Haefelé等［8］在胡蘆巴種子中發現可將L-異亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）轉化為（2S，3R，4S）-4-HIL的活性成分，但未見將其分離純化的報道.Ogawa等［1］在蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）中發現了能特異性地催化 L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-HIL的IDO，為4-HIL的生物法合成奠定了基礎［9］.

在前期研究中，本研究室從蘇云金芽胞桿菌（B.thuringiensis）TCCC11826基因組克隆了 IDO編碼基因ido，其表達產物能夠特異性地催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-HIL，最適反應溫度和 pH分別為35，℃和 7.0，可見該酶反應條件溫合，比較適合用于生物法合成 4-HIL［9］.序列分析結果表明，該 IDO含有His1-X-Asp-Xn-His2基序，屬于Fe2+和α-KG依賴型羥化酶家族.因此前期在酶催化以及利用大腸桿菌（Escherichia coli）W3110進行微生物轉化合成 4-HIL時需加入底物L-Ile和α-KG以及FeSO4［9］.

本文在前期研究基礎上以L-Ile生產菌株谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）YILW 為出發菌株，過表達 ido基因，構建 4-HIL生產菌株YILW-IDO，以期利用 YILW-IDO自身合成的 L-Ile及外源添加α-KG和 Fe2+實現生物轉化法合成 4-HIL.在此基礎上研究α-KG和 Fe2+添加量對重組菌株合成4-HIL的影響.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質粒

大腸桿菌（E.coli）DH5α、L-Ile生產菌株谷氨酸棒狀桿菌（C. glutamicum）YILW（LeuL+AHVr+SGr+ Leu-MEr）以及質粒 pXMJ19（Cmr）和 pMD-ido為模板（ido基因經過密碼子優化）均由本實驗室保藏.

1.1.2培養基

LB培養基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0， NaCl 10.0，pH 7.0～7.2，121，℃高壓蒸汽滅菌20，min.

LBG培養基（g/L）：蛋白胨 10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，葡萄糖5.0，pH 7.0～7.2，115，℃高壓蒸汽滅菌15，min.

BHIS培養基（g/L）：腦心浸提物 37.0，山梨醇9.1，葡萄糖 0.5，pH 7.0～7.2，115，℃高壓蒸汽滅菌15，min.

發酵培養基［10］（g/L）：葡萄糖80.0，（NH4）2SO45.0，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.015，KH2PO4·3H2O 1.5，維生素 B10.015.玉米漿 35.0 mL/L，pH 7.0～7.2，115，℃高壓蒸汽滅菌15，min.

1.1.3主要試劑

限制性內切酶、T4，DNA 連接酶、Ex Taq DNA聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司；PCR產物回收及質粒提取試劑盒，北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；（2S，3R，4S）-4-HIL，美國 Sigma公司；其他試劑均為國產分析純.

1.2方法

1.2.1質粒pXMJ-ido的構建

以質粒 pMD-ido為模板，利用引物 HIL-F（5′-GCGAAGCTT AGAAAGGTGTGTTTCACCC-3′）和HIL-R（5′-GCGGGATCCTTACTTGGTCTCCTTGTA GG-3′）以及 Ex Taq PCR試劑盒擴增其 ido基因.PCR條件：94，℃ 5，min，1個循環；94，℃ 30，s、56，℃ 30，s、72，℃ 1，min，30個循環；72，℃ 10，min，1個循環，反應體系為50，μL.PCR產物經1.5%，瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收.

目的產物回收后經 Hind，Ⅲ和 BamHⅠ酶切、電泳、切膠回收后連接至經相同酶切的表達載體pXMJ19上并轉化至E. coli DH5α 感受態細胞中.經LB液體培養基活化后涂布于含氯霉素（30，μg/mL）的LB固體培養基.過夜培養后挑取單菌落，利用引物HIL-F和HIL-R進行PCR驗證，陽性菌株接入含氯霉素（30，μg/mL）的 LB液體培養基.經 37，℃、220，r/min振蕩培養24，h后提取質粒，利用引物HILF和HIL-R進行PCR驗證，并分別利用Hind，Ⅲ單酶切以及Hind，Ⅲ和BamHⅠ雙酶切，酶切產物經1.5%，瓊脂糖凝膠電泳驗證.將驗證正確的重組質粒命名為pXMJ-ido.

1.2.2YILW-IDO的構建

取5，ng重組質粒pXMJ-ido電轉化至YILW感受態細胞（2.5，kV，25，μF，200，?，2，mm電擊杯），經BHIS培養基37，℃活化1，h后，取200，μL涂布于含氯霉素（10，μg/mL）的 BHIS固體培養基上，于 32，℃倒置培養36，h.挑取單菌落接種至裝有5，mL含氯霉素（10，μg/mL）BHIS液體培養基的搖管中，于 37，℃220，r/min振蕩培養 48，h.離心收集菌株提取其質粒并利用Hind，Ⅲ單酶切及Hind，Ⅲ和BamHⅠ雙酶切，酶切產物經 1.5%，瓊脂糖凝膠電泳驗證.將驗證正確的重組菌株命名為YILW-IDO.

1.2.3實時熒光定量PCR（Real-time PCR）

將YILW-IDO種子培養物以10%，的接種量接種至 LB液體培養基中，32，℃、200，r/min振蕩培養至A600=0.6～0.8時，加入終濃度為 0.2，mmol/L 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）繼續培養 4，h.根據ido及C.glutamicum ATCC13032 16S rDNA（內參）基因序列利用Primer 5.0軟件設計用于Real-time PCR 引物IDO-1（5′-GGTAAAGTTAGACAGTTC CATAGCA-3′）和 IDO-2（5′-CAAATAGGTGAACTA AAAGATGGTC-3′）以及16S-F（5′-AGAACCACCGC CTGCTCACC-3′）和 16S-R（5′-CCGTCGTCGTAGTT GTACTCCTTG-3′）分別采用 Trizol和 Prime Script TMRT試劑盒提取總RNA并反轉錄成cDNA.然后采用SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ熒光定量PCR 試劑盒及Real-time PCR 儀進行擴增和檢測.PCR反應程序：95，℃預變性30，s，1 個循環；95，℃變性5，s，60，℃退火和延伸共34，s，40 個循環.采用2-ΔΔCT相對定量法［11］分析 ido的轉錄水平，以未經 IPTG誘導的YILW-IDO為對照.

1.2.4IDO活性檢測

收集經IPTG誘導的菌體用PBS緩沖液重懸浮，經超聲破碎儀超聲破碎（功率 350，W，工作時間 5，s，間隔時間 10，s，5 個循環，于冰上操作）后 5，000，g離心5，min.取上清液20，μL至PBS緩沖液（含終濃度為 30，mmol/L α-KG、30，mmol/L L-Ile、1，mmol/L FeSO4、1，mmol/L 維生素 C）中，反應體系為 1，mL，于30，℃反應1，h后加入10，μL乙酸終止反應［12］.采用高效液相色譜測定4-HIL含量，酶活性以每毫克總蛋白每分鐘內催化生成 4-HIL的量計算，單位為nmol/（min·mg）.

1.2.5YILW-IDO搖瓶發酵

分別將含質粒pXMJ19的 C. glutamicum YILW（YILW-pXMJ19，對照組）及重組菌株YILW-IDO（實驗組）經斜面培養基活化后接種至 LB液體培養基中，于32，℃、200，r/min振蕩培養15，h，使A600=1.2～1.6.將種子培養物以 10%，的接種量接種至含有30，mL 發酵培養基的 500，mL擋板瓶中，于 32，℃、200，r/min振蕩培養至 A600=0.6～0.8時，加入IPTG（終濃度為 0.2，mmol/L），同時加入α-KG 和FeSO4（終濃度分別為 30，mmol/L和 2，mmol/L）繼續發酵至50，h，檢測發酵液中4-HIL的濃度.發酵過程中補加10%，的尿素，維持發酵液pH 6.7～7.0.

在 FeSO4終濃度為 2，mmol/L條件下，考察 0、30、35、40、45、50，mmol/L α-KG 對4-HIL產量的影響.在α-KG 終濃度為 30，mmol/L條件下，考察 0、1、2、3、4、5、6，mmol/L Fe2+對4-HIL產量的影響.在α-KG 終濃度分別為0、30、35、40、45、50，mmol/L條件下，考察1、2、3、4、5、6，mmol/L Fe2+對4-HIL產量的影響，以研究α-KG與Fe2+的交互作用.

1.2.64-HIL的檢測

將IDO反應液或發酵液于8，000，g離心5，min后取上清液，經體積分數為0.8%，的2，4-二硝基氟苯衍生后采用高效液相色譜測定 4-HIL含量，檢測條件為：Agilent C18（150，mm×4.6，mm，5，μm），采用乙腈/醋酸鈉二元梯度洗脫，柱溫 33，℃，檢測波長360，nm［13］.

1.3數據分析

每組實驗均設3個平行并重復3次，利用SPSS 19.0統計軟件對實驗數據進行分析和處理.采用SPSS 19.0統計軟件分析α-KG與Fe2+的交互作用.

2　結果與分析

2.1重組質粒pXMJ-ido的構建

經篩選挑取陽性菌落活化后提取質粒進行酶切驗證，結果如圖 1所示.經 Hind，Ⅲ單酶切獲得約7，000，bp的片段，經 Hind，Ⅲ和 BamHⅠ雙酶切獲得約6，600，bp及750，bp的片段，與重組質粒、pXMJ19以及ido分子質量接近（分別為7，300，bp、6，574，bp和723，bp），證明 ido基因已成功連接到表達載體上.將重組質粒命名為pXMJ-ido.

2.2YILW-IDO菌株的構建

提取重組質粒 pXMJ-ido并電轉化至 C. glutamicum YILW 感受態細胞中，經篩選、活化后提取質粒進行酶切驗證，結果如圖 2所示.經 Hind，Ⅲ單酶切獲得約7，000，bp的片段，經Hind，Ⅲ和BamHⅠ雙酶切獲得約 6，600，bp及 750，bp的片段與重組質粒、pXMJ19以及ido接近，表明重組菌株構建成功，將其命名為YILW-IDO.

圖1　ido PCR擴增及 E.，coli DH5α中質粒 pXMJ-ido酶切驗證Fig.1 ido PCR products and identification of recombined pXMJ-ido plasmids in E.，coli DH5α digested by restricted endonuclease

圖2　菌株YILW-IDO中質粒pXMJ-ido酶切驗證Fig.2 Identification of recombined pXMJ-ido plasmids in YILW-IDO strain digested by restricted endonuclease

2.3重組菌株 YILW-IDO中 ido轉錄水平及 IDO活性測定

分別提取未經IPTG誘導（對照組）及經IPTG誘導的 YILW-IDO（實驗組）總 RNA并測定其轉錄水平.結果表明，經誘導后YILW-IDO中ido的相對轉錄量為（31.6±0.5），表明該基因能夠于谷氨酸棒桿菌C.glutamicum YILW中成功轉錄.收集經IPTG誘導的YILW-IDO細胞，超聲破碎并離心后取上清液，測定 IDO活性，以含質粒 pXMJ19的 C.glutamicum YILW為對照.結果顯示，YILW-IDO破碎液IDO比活力達（1.1±0.3）nmol/（min·mg），表明該 ido基因可在YILW-IDO中表達出具有活性的酶.

2.4利用重組菌株YILW-IDO轉化法合成4-HIL

分別將 YILW-pXMJ19（對照組）及重組菌株YILW-IDO（實驗組）于含有 30，mL 發酵培養基的500，mL擋板瓶中發酵培養 50，h，測定其 L-Ile和 4-HIL濃度，結果如圖 3所示.YILW-IDO可積累 4-HIL達（13.7±0.4）mmol/L，同時生成 L-Ile（26.5± 0.5）mmol/L；而對照組僅積累L-Ile（39.1±1.2）mmol/L，未檢測到4-HIL.

圖3　YILW-IDO 4-HIL產量Fig.3 Production of 4-HIL with YILW-IDO

2.4.1α-KG的添加量對4-HIL合成的影響

IDO在催化過程中需底物α-KG.YILW-IDO在發酵結束時，培養基中仍含（26.5±0.5）mmol/L L-Ile，但 4-HIL產量僅（13.7±0.4）mmol/L，而 YILW-pXMJ19，L-Ile產量（39.1±1.2）mmol/L，推測可能因培養基中底物α-KG不足使得YILW-IDO合成的LIle未反應完全而積累.

因此，研究了不同α-KG的添加量對4-HIL產量的影響，結果如圖 4所示.當α-KG濃度為40，mmol/L時，4-HIL產量最高，但仍有少量L-Ile積累.隨著α-KG添加量的增加，盡管無L-Ile積累但4-HIL產量逐漸降低.前期研究表明，α-KG濃度為40～60，mmol/L時，重組IDO活性并未受到抑制.本實驗發現，α-KG添加量為45，mmol/L和50，mmol/L時 YILW-IDO生物量較α-KG添加量為 40，mmol/L時低 9.6%，和 14.2%，（結果未顯示），這可能是該條件下4-HIL合成量低的原因.

圖4　α-KG濃度對4-HIL產量的影響Fig.4　Effects of different concentration of α-KG on 4-HIL production

2.4.2FeSO4的添加量對4-HIL合成的影響

IDO屬于 Fe2+及α-KG依賴的羥化酶家族，因此，研究了不同Fe2+添加量對4-HIL產量的影響，結果如圖 5所示.隨著 Fe2+添加量的增加 4-HIL產量逐漸升高，Fe2+濃度為4，mmol/L時，4-HIL產量達到最高，隨后逐漸降低.前期研究表明，當 Fe2+高于4，mmol/L時，重組 IDO活性降低，因此 Fe2+添加量為5，mmol/L和6，mmol/L時，可能因IDO活性受到抑制而使得4-HIL產量降低.

圖5　Fe2+濃度對4-HIL產量的影響Fig.5 Effects of different concentration of Fe2+on 4-HIL production

2.4.3α-KG和FeSO4添加量對4-HIL合成的影響

α-KG和FeSO4添加量對4-HIL合成量的影響及其交互作用實驗結果見表1和表2.結果表明：α-KG和 FeSO4均能顯著影響 4-HIL的合成（P＜0.05），當α-KG添加量一定時，FeSO4添加量為4，mmol/L條件下 4-HIL合成量最高；當 FeSO4添加量一定時，α-KG添加量為40，mmol/L條件下4-HIL合成量最高；α-KG和FeSO4添加量分別為40，mmol/L和4，mmol/L時4-HIL達到最高值，為（35.7±1.0），mmol/L.由表2可知，α-KG和 Fe2+對4-HIL合成的影響不具有交互作用（P＞0.05）.

表1　α-KG和FeSO4添加量對4-HIL合成的影響Tab.1 Effects of different concentration of FeSO4and α-KG on 4-HIL production

表2　實驗結果方差分析Tab.2 Variance analysis of the results

3　討 論

目前工業化生產 4-HIL所采用的胡蘆巴種子提取法具有收率低、成本高等不足.IDO的發現使得具有生物學活性的（2S，3R，4S）-4-HIL高效合成成為可能［1］.

本文在前期研究［9］的基礎上，以 L-Ile生產菌株C.，glutamicum YILW 為出發菌株通過過表達 ido基因能夠成功合成 4-HIL.Smirnov等［13］以 E.coli MG1655為出發菌株，通過敲除α-酮戊二酸脫氫酶編碼基因以及異檸檬酸裂解酶編碼基因以增加α-KG的積累量，在此基礎上過表達ido并在發酵過程中添加L-Ile，在優化條件下其轉化率為 0.82，mol/mol.本文利用C.glutamicum YILW-IDO自身合成的L-Ile并向培養基中添加α-KG，在初步優化條件下其轉化率為0.86，mol/mol.

IDO屬于α-KG和 Fe2+依賴型羥化酶家族.由IDO的酶反應式可知，1，mol α-KG和L-Ile可生成等物質的量的 4-HIL.搖瓶實驗結果表明，含質粒pXMJ19的 YILW 可生成 L-Ile（39.1±1.2）mmol/L，因此在發酵過程中添加 40，mmol/L的α-KG使得 4-HIL產量達到最高值.值得注意的是，盡管發酵過程中不添加α-KG，仍可積累4-HIL（14.3±0.9）mmol/L（圖4），其原因可能是菌體可利用自身合成的α-KG與L-Ile反應生成4-HIL.Yi等［14］在研究利用脯氨酸羥化酶（屬于α-KG和Fe2+依賴型羥化酶家族）合成羥脯氨酸時，發現菌體可利用自身生成的α-KG合成羥脯氨酸.

α-KG 和 Fe2+依賴型羥化酶家族含 His1，XAsp/Glu-Xn-His2基序，該基序中的 His、Asp/Glu及His絡合Fe2+后形成活性中心.本文所利用的IDO亦含 His1，X-Asp-Xn-His2基序，實驗結果表明適量增加Fe2+添加量可有效提高4-HIL產量.

研究［4］表明維生素 C對 IDO活性亦有一定影響，但通過研究發現添加不同量的維生素 C并未對4-HIL產量產生影響.

本文結果表明，來源于 B.，thuringiensis TCCC 11826的 ido能夠在 L-Ile生產菌株 C.，glutamicum YILW中成功表達出有活性的IDO并利用其生成的L-Ile催化生成 4-HIL，實現 4-HIL的生物合成.α-KG和Fe2+添加量均影響 4-HIL的合成，在α-KG和Fe2+添加量分別為40，mmol/L和4，mmol/L條件下，4-HIL產量達（35.7±1.0）mmol/L.本研究可為 4-HIL及其他氨基酸衍生物的生物制造提供理論依據.

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責任編輯：郎婧

Synthesis of 4-hydroxyisoleucine with Corynebacterium glutamicum via Biotransformation

WEN Bing，ZHANG Chenglin，MA Jie，CHEN Pengjie，XIE Xixian，XU Qingyang，CHEN Ning
（National and Local United Engineering Laboratory of Metabolic Control Fermentation Technology，Tianjin Engineering Laboratory of Efficient and Green Amino Acid Manufacture，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

4-hydroxyisoleucine（4-HIL）possesses glucose-dependent insulinotropic activities.L-isoleucine dioxygenase encoded gene ido from Bacillus thuringiensis TCCC11826 was cloned and expressed in L-isoleucine produced strain Corynebacterium glutamicum YILW to synthesize 4-hydroxyisoleucine via biotransformation.The effect of α-ketoglutarate（α-KG）and Fe2+on 4-HIL synthesis was also studied.C.glutamicum YILW-IDO expressed active IDO was constructed，which could directly convert its endogenous L-isoleucine and α-ketoglutarate in the medium into 4-HIL.Moreover，4-HIL synthesis could be affected by α-KG and Fe2+.After 50，h fermentation，（35.7±1.0）mmol/L 4-HIL was produced by adding 40，mmol/L α-KG and 4，mmol/L Fe2+.This research can lay a theoretical foundation for the microbial manufacture technology of 4-HIL and amino acid derivatives.

4-hydroxyisoleucine；L-isoleucine dioxygenase；Corynebacterium glutamicum；biotransformation

Q815

A

1672-6510（2016）04-0009-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20150182

2015-10-27；

2016-02-26

國家自然科學基金資助項目（31300069）；天津市大學生創新創業訓練計劃資助項目（201510057063）

溫 冰（1977—），女，天津人，博士研究生，副研究員；通信作者：陳 寧，教授，ningch@tust.edu.cn.

數字出版日期：2016-05-19；數字出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20160519.1030.006.html.