PKCα 抑制劑Calphostin C抑制TNF-α 誘導的骨髓間充質干細胞遷移

宋鐵峰，王 楠，王會琴，袁 穎，黃麗文，莊春雨，張同存

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

PKCα 抑制劑Calphostin C抑制TNF-α 誘導的骨髓間充質干細胞遷移

宋鐵峰，王 楠，王會琴，袁 穎，黃麗文，莊春雨，張同存

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α ）可以誘導間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的遷移，但其促進遷移機制尚不清楚.研究使用Calphostin C抑制劑來抑制PKCα 的活性，從而研究TNF-α 誘導MSCs遷移的作用是否通過激活PKCα 來完成.利用50，ng/mL的TNF-α 處理MSCs，劃痕實驗和Transwell實驗表明TNF-α 可以誘導MSCs的遷移.加入PKCα 的抑制劑Calphostin C后，可以抑制TNF-α 對MSCs遷移或侵襲的誘導，并降低遷移標志基因MYL9（Myosin light chain 9，MYL9）、CYR61（Cysteine rich 61，CYR61）的表達.以上結果表明，PKCα抑制劑Calphostin C可以抑制TNF-α 誘導的MSCs遷移.

MSCs；遷移；TNF-α；PKCα

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化能力的干細胞［1-3］.間充質干細胞不僅具有多向分化潛能，還能靶向遷移到損傷部位、慢性炎癥部位及腫瘤部位，對于這些部位起到一定程度的修復作用［4］.對于間充質干細胞遷移機制的研究，有助于理解間充質干細胞“歸巢”的分子機制，為自體修復和細胞治療提供理論依據.間充質干細胞的體內歸巢和體外遷移也像細胞的其他生理活動一樣由不同因素誘導引發涉及不同的信號通路［5-7］.雖然多種誘導因子和信號通路被發現參與間充質干細胞的遷移過程，但是其具體的遷移機制依然不明確.

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），能引起腫瘤出現壞死，而對正常組織細胞無毒性，故稱之為腫瘤壞死因子.腫瘤壞死因子有 3種亞型：TNF-α、TNF-β和 TNF-γ.TNF-α主要由單核細胞分泌，但在其他細胞中也有分泌，包括間充質干細胞［8-9］.作為炎癥因子，TNF-α可以促進間充質干細胞的遷移，TNF-α 在MSCs遷移和黏附中均占有重要的作用.

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是1977年在鼠腦的胞質成分中發現的一種蛋白激酶，屬于多功能絲氨酸和蘇氨酸激酶，是 G蛋白偶聯受體信號轉導系統中的效應物.絲氨酸/蘇氨酸激酶，PKC家族有3個亞家族：經典型 PKCS（α、β和 γ同種型）、新型PKCS（δ、θ、η、ε同種型）以及非典型PKCS（ζ和ι亞型）［10-11］.當被激活時，PKC磷酸化并轉運到細胞膜，可調節信號轉導途徑［12］，參與多種細胞遷移和侵襲過程.有文獻［13］報道，在肝癌細胞中 PKCα的表達誘導細胞的遷移和侵襲.有研究［14］顯示，TNF-α 通過PKC信號通路誘導肺腺癌細胞遷移.

研究發現，TNF-α可促進MSCs遷移，但TNF-α影響MSCs遷移的機制目前仍不清楚.因此，在本研究中，首先用TNF-α誘導MSCs遷移，再采用PKCα的特異性抑制劑Calphostin C，進一步研究PKCα 在TNF-α 促進MSCs遷移這一過程中的作用.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

健康SD（sprague dawley，SD）大鼠，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號為SCXK-（軍）2012-0004，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準.

1.1.2主要試劑

DMEM/LG培養基，Gibco公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；重組大鼠TNF-α，Peprotech公司；Calphostin C、MYL9抗體、CYR61抗體、β-actin抗體，Santa Cruz公司；DAPI、dNTP，北京索萊寶科技有限公司；IRDye?800，CW山羊抗鼠抗體、IRDye?680 山羊抗兔抗體，LI-COR公司；M-MLV逆轉錄酶、Trizol裂解液，上海英俊生物技術有限公司；隨機引物 B0043，上海生工生物工程有限公司；Bestar?SybGreen qPCR Mastermix，DBI?Bioscience公司.

1.2方法

1.2.1骨髓間充質干細胞的提取及體外擴增培養

SD大鼠間充質干細胞的提取采用全骨髓貼壁法.選健康80～90，g的 SD大鼠，雄性，頸椎脫臼法處死.剪刀剪去皮毛，無菌條件下取股骨和脛骨，剔除骨表面肌肉.吸取含15%，胎牛血清的DMEM/LG放入已滅菌玻璃離心管中.剪開股骨、脛骨關節兩端，用 5，mL一次性注射器吸取培養基沖洗骨髓腔.將帶有骨髓懸浮物的培養液用移液器吹散后，轉移到培養皿中，置于37，℃、5%， CO2培養箱中進行原代細胞培養.本研究所用的是第 3～7代的骨髓間充質干細胞.

1.2.2細胞加藥處理

將MSCs以1×105，mL-1的密度接種于6孔板，分為4組：對照組，2%，血清DMEM/LG處理細胞；TNF-α 組，加 TNF-α（終質量濃度 50，ng/mL）于 2%，血清的 DMEM/LG中，處理細胞 24，h；Calphostin C組，用含Calphostin C（終濃度0.1，μmol/L）的2%，血清的DMEM/LG處理細胞24，h；Calphostin C+TNF-α組，先用含Calphostin C（終濃度0.1，μmol/L）的2%，血清的DMEM/LG處理細胞1，h，再加入終質量濃度為50，ng/mL的 TNF-α處理細胞 24，h.加藥處理 24，h后，收集上述細胞進行后續實驗.

1.2.3細胞劃痕實驗

將MSCs以1×105，mL-1的密度接種于6孔板，12～16，h后用 10，μL槍頭在細胞間按“十”字型劃出痕跡，同時加藥處理，24，h后在倒置顯微鏡下進行觀察拍照，觀察細胞的彌合修復能力.

1.2.4Transwell實驗

在 24孔板中加入 500，μL 10%，血清 DMEM/ LG（含所加的藥 TNF-α），然后在小孔內放入小室，使小室下膜與培養基完全契合.在小室的上室中加入 5×104個細胞，放入培養箱培養.16，h后將Transwell的小室取出，用棉簽輕輕擦去上室的細胞，PBS洗2次，每次5，min.4%，多聚甲醛室溫固定下室細胞20，min，PBS洗2次，每次5，min.無水甲醇浸泡下室膜20，min，PBS洗2次，每次5，min.用DAPI染細胞核，室溫放置 15，min，PBS洗 2次，每次5，min.共聚焦顯微鏡下照相.

1.2.5RNA的提取

用 0.5，mL Trizol裂解液在冰上裂解細胞15，min，重復吹懸使細胞充分裂解，加入0.1，mL的氯仿，劇烈振蕩 15，s，靜置 5，min，4，℃、12，000，r/min離心 10，min.取上層水相到另一 EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻，-20，℃放置 30，min.12，000，r/min離心 10，min，棄掉上清液，加入 75%，乙醇 1，mL，洗滌RNA，離心棄掉上清液，室溫晾干 RNA.加入 20，μL DEPC水溶解RNA，放于-80，℃保存.

1.2.6RNA逆轉錄及實時熒光定量 PCR（Real-time PCR）

將提取的RNA用M-MLV逆轉錄方法進行逆轉錄.RNA 2，μg、隨機引物（B0043）5，μL，70，℃水浴5，min；迅速冰浴；10，mol/L dNTPs 5，μL、5×buffer 5，μL、RNAse inhibitor 0.625，μL、M-MLVRT 1，μL混勻，37，℃反應1，h；70，℃保持10，min終止反應.

用Bestar?SybGreen qPCR Mastermix進行Realtime PCR.擴增程序：95，℃ 2，min；95，℃ 10，s，60，℃30，s，72，℃ 30，s，40個循環.融解曲線：95，℃ 1，min，55，℃ 1，min，95，℃ 10，s.目的基因引物：GAPDH上游5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，GAPDH下游5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′；CYR61上游5′-GAAGAAATACCGGCCCAAAT-3′，CYR61下游5′-CAGACTGTAGAGGCGAAACGAC-3′；MYL9上游5′-ATGAGGAGGTGGACGAGATGT-3′，MYL9下游5′-CGTGCTTGAGGATGCGAG-3′.

1.2.7免疫印跡實驗（Western blot）

收集各組細胞，PBS洗1次，SDS細胞裂解液冰上裂解細胞，100，℃變性10，min，12%， SDS-PAGE電泳，電轉法將蛋白轉至 NC膜.5%，的脫脂奶粉室溫封閉1，h后，分別用β-actin抗體（1∶500）、CYR61抗體（1∶500）、MYL9抗體（1∶500）4，℃孵育過夜，PBS洗3次，每次10，min；IRDye?800，CW 山羊抗鼠抗體（1∶5，000）、IRDye?680 山羊抗兔抗體（1∶5，000）室溫孵育 2，h后，PBS洗 3次，每次 10，min，Odyssey成像系統進行掃膜成像.

1.2.8統計學分析

所有實驗數據均用SPSS 13.0統計軟件計算，實驗數據均以“平均值±標準差”表示.用t檢驗顯著性，*表示統計學上有顯著性差異（P＜0.05）.

2　結果與分析

2.1劃痕檢測加入 Calphostin C后對 TNF-α 誘導MSCs遷移作用的影響

利用劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，結果如圖 1所示.加入TNF-α 的MSCs細胞的愈合程度大于沒有處理的MSCs細胞的愈合程度，證明 TNF-α 可以促進MSCs細胞的遷移.而加入Calphostin C+TNF-α 組的 MSCs細胞愈合程度小于加入 TNF-α 組的MSCs細胞愈合程度，證明 PKCα 的活性被抑制后，TNF-α 促進MSCs細胞的遷移作用也被抑制.

圖1　Calphostin C抑制 TNF-α 誘導的 MSCs細胞遷移能力Fig.1　Calphostin C inhibits MSC migration induced by TNF-α

2.2Transwell檢測加入Calphostin C后對TNF-α促侵襲作用的影響

利用 Transwell實驗檢測了細胞的侵襲能力，結果如圖2所示.

圖2　Calphostin C抑制TNF-α 誘導的MSCs細胞侵襲能力Fig.2　Calphostin C inhibits MSC invasion induced by TNF-α

加入TNF-α的MSCs細胞的侵襲能力大于沒有處理的 MSCs細胞的侵襲能力，證明 TNF-α可以促進MSCs細胞的侵襲.而加入Calphostin C+TNF-α組的 MSCs細胞侵襲能力小于加入 TNF-α 組的MSCs細胞侵襲能力，證明 PKCα的活性被抑制后，TNF-α促進MSCs細胞的侵襲作用也被抑制.

2.3檢測遷移marker的表達變化

細胞外基質蛋白 CYR61、細胞骨架蛋白 MYL9與細胞遷移有直接的關系［15-16］.利用 Real-time PCR的方法檢測遷移maker MYL9、CYR61，mRNA水平的變化，結果如圖3所示.TNF-α可以促進MYL9、CYR61，mRNA 表達的升高，而加入 Calphostin C抑制 PKCα 的活性后，TNF-α 的這種上調遷移 marker表達的能力被抑制.

圖3　Calphostin C抑制 TNF-α 誘導的 MSCs細胞遷移maker mRNA表達水平Fig.3 Calphostin C inhibits the mRNA levels of migration markers induced by TNF-α in MSCs cells

利用Western blot檢測這兩種基因蛋白水平的變化，如圖4所示.結果與mRNA水平的變化一致，進一步證明了TNF-α 促進MSCs細胞的遷移能力是通過激活PKCα.

圖4　Calphostin C抑制 TNF-α誘導的 MSCs細胞遷移maker蛋白表達水平Fig.4 Calphostin C inhibits the protein expression of migration markers induced by TNF-α in MSCs cells

3　討 論

腫瘤壞死因子 TNF-α 分泌前體是跨膜蛋白，然后經過 TNF-α 轉化酶的剪切修飾轉變為可溶性狀態.每一種可溶性的亞型均有生理活性，TNF-α 的主要生理作用都是通過TNFR1，將信號傳達到細胞內，啟動一系列的生理反應.作為炎癥因子，TNF-α 促進間充質干細胞的遷移已有相關研究.有研究［5］顯示，TNF-α 可以增強間充質干細胞的遷移能力，增加ERK的磷酸化和p38蛋白的磷酸化；加入 p38的抑制劑 SB203580后，細胞間黏附分子 1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表達升高，抑制了TNF-α 引起的間充質干細胞的遷移.在 Ponte等［17］的研究中，發現 TNF-α 可以大大增強趨化因子RANTES（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted facyor，RANTES）和SDF-1（stromal-cell derived factor-1，SDF-1）誘導 MSCs遷移的能力.PKCα 是信號傳導PKC的大家族成員之一，在肝癌細胞中，PKCα 激活AKT/MAPK信號通路，誘導細胞的增殖、遷移和侵襲［13］.研究［14］顯示，在人的肺腺癌細胞中，TNF-α 誘導的 CLDN1（claudin-1，CLDN1）表達及細胞遷移通過 PKC信號通路.同時有文獻報道，MSCs的遷移與PKC信號通路相關，Lin等［18］發現白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）通過 PKC信號通路激活肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK），從而誘導MSCs遷移.Tang等［19］發現乙酰膽堿通過PKC信號通路誘導MSCs遷移.

本文發現TNF-α 可以促進MSCs細胞遷移和侵襲，并且通過加入PKCα 特異性抑制劑Calphostin C證實 TNF-α 誘導 MSCs細胞遷移通過 PKCα 通路.接下來可以通過RNA干擾技術敲低PKCα ，進一步驗證結論作出補充.雖然多種誘導因子和信號通路被發現參與間充質干細胞的遷移過程，但是其具體的遷移機制依然不明確.在 TNF-α 誘導的MSCs遷移過程中是否還存在其他分子參與其中，激活PKCα 從而促進TNF-α 誘導MSCs遷移是不是唯一的途徑，這些問題還有待于進一步研究.

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責任編輯：郎婧

Inhibiting the Migration of Mesenchymal Stem Cells Induced by TNF-α with PKCα Inhibitor Calphostin C

SONG Tiefeng，WANG Nan，WANG Huiqin，YUAN Ying，HUANG Liwen，ZHUANG Chunyu，ZHANG Tongcun
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Inflammatory cytokine TNF-α can induce the migration of MSCs，but the mechanism of migration remains unclear.This study used PKCα inhibitor Calphostin C to inhibit PKCα activity，in order to know whether the migration of MSCs induced by TNF-α was accomplished by activating PKCα.MSCs were treated with 50，ng/mL of TNF-α.Wound heal assay and Transwell assay confirmed that TNF-α could induce the migration of MSCs.PKCα inhibitor Calphostin C inhibited TNF-α-induced MSC migration or invasion and reduced the expression of migration marker genes MYL9，and CYR61.In conclusion，PKCα inhibitor Calphostin C can inhibit the migration of MSCs induced by TNF-α.

MSCs；migration ability；TNF-α；PKCα

Q28

A

1672-6510（2016）04-0015-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150148

2015-10-08；

2015-12-08

國家自然科學基金資助項目（31171303）

宋鐵峰（1990—），女，黑龍江人，碩士研究生；通信作者：張同存，教授，tony@tust.edu.cn.