灰樹花胞外多糖的分離純化及免疫調節作用

韓麗榮，程 代，孟 夢，王莉蕊，王春玲

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

灰樹花胞外多糖的分離純化及免疫調節作用

韓麗榮，程 代，孟 夢，王莉蕊，王春玲

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

通過對灰樹花（Grifola frondosa）深層發酵的胞外多糖（EXGFP）進行分離純化，研究其性質和免疫活性.灰樹花胞外粗多糖經醇沉、酶-sevag脫蛋白和Sephadex G-100色譜柱分離得到純化組分EXGFP-A.通過Sepharose 4B凝膠柱法和HPLC法鑒定EXGFP-A的純度，結果表明EXGFP-A是均一多糖組分，純度為92.68%，.理化性質實驗結果表明，EXGFP-A是一種非淀粉類、不含糖醛酸及多酚類物質，含有α -D-葡萄糖苷鍵和吡喃糖環的中性多糖.MTT實驗表明，當 EXGFP-A質量濃度為 80，μg/mL、作用 48，h時，小鼠巨噬細胞 RAW264.7細胞增殖指數達到最大值，為137.5%，.吞噬活性實驗結果證實EXGFP-A能夠提高RAW264.7細胞對中性紅的吞噬能力，掃描電子顯微鏡結果發現RAW264.7細胞經過EXGFP-A處理后，細胞表現出了明顯的活化特征.

灰樹花；胞外多糖；分離純化；小鼠巨噬細胞RAW264.7；免疫活性

灰樹花（Grifola frondosa）是一種珍貴的藥食兩用型真菌［1］，具有多種生物活性，如抗病毒［2］、免疫調節［3］、抗輻射［4］、抗腫瘤［5］、抗氧化［6］、調節血糖［7］及降血脂作用，從而具有良好的應用前景.已有研究證實了灰樹花多糖的抗腫瘤活性［8］，因此，對于其結構分析以及其他活性的研究成為了當前的研究熱點.隨著對灰樹花深入的研究，其化學成分也逐漸被分離出來，主要有多糖、蛋白質、肽類和脂類等，其中主要的活性成分為灰樹花多糖［9］.

近年來，灰樹花作為一種珍貴真菌被開發研究，大量的研究已經證實了其具有多種生物活性.國內外對于灰樹花的研究主要集中在灰樹花子實體多糖的功能學評價［10］.楊陽等［11］通過小鼠脾淋巴細胞轉化增殖實驗，證實了灰樹花多糖組分的免疫活性.王寶琴等［12］研究結果證明，高純度堿提灰樹花 β-葡聚糖能顯著提高小鼠的細胞吞噬功能及特異性免疫和非特異性免疫功能.但有關灰樹花的發酵培養、多糖結構和體外免疫活性的研究相對較少.

本實驗通過對灰樹花進行深層發酵培養，所得發酵液經提取得到灰樹花胞外粗多糖，分離純化后得到均一的多糖組分，采用紅外光譜分析等方法對其進行基本的結構分析，利用 MTT實驗、中性紅實驗以及掃描電鏡對其進行體外免疫活性的研究.以上研究將會為灰樹花胞外多糖的開發利用提供一定的理論依據.

1　材料與方法

1.1實驗材料

灰樹花（Grifola frondosa）由天津科技大學菌種保藏中心提供，編號為39025.

RAW264.7細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所.

1.2灰樹花胞外多糖的提取及分離純化

對灰樹花進行深層發酵培養，所得發酵液通過醇沉法得到胞外粗多糖（EXGFP）.經過除蛋白、脫色、超濾分級和 Sephadex G-100色譜柱（26，mm× 800，mm）分離，最終得到灰樹花胞外多糖 EXGFPA.具體操作如下：

醇沉法：將灰樹花發酵液減壓濃縮后，加入 95%，的乙醇，使乙醇終體積分數為 75%，，4，℃過夜提取后，離心收集沉淀，經無水乙醇、丙酮、乙醚等依次洗滌，冷凍干燥得到灰樹花胞外粗多糖.

除蛋白：采用酶-sevag法，向5%，的EXGFP溶液中添加3%，的木瓜蛋白酶，調節pH為6～7，60，℃酶解2，h后，加入sevag溶液，混勻后靜置，取上層的多糖溶液層.向上層溶液中重復添加 sevag溶液，直至將蛋白完全除去.

脫色、超濾分級及分離：選擇 AB-8大孔吸附樹脂進行脫色，將得到的多糖溶液以體積分數 5%，緩慢沿壁加入裝好的柱子中，并保持適當的流量，直到流出的溶液為無色溶液為止.將脫色處理后的多糖溶液經過0.45，μm的濾膜進行預處理后超濾分離.冷凍干燥后，采用 Sephadex G-100色譜柱（26，mm× 800，mm）分離，最終得到灰樹花胞外多糖EXGFP-A.

1.3EXGFP-A純度鑒定

采用 Sepharose 4B凝膠柱法和 HPLC法，對EXGFP-A進行純度鑒定.將5，mg/mL的EXGFP-A溶液上樣至 Sephadex G-75的色譜柱（16，mm× 600，mm）中，洗脫液為三蒸水，流量為0.2，mL/min，每10，min收集1管.采用苯酚-硫酸法測定各管多糖含量，以洗脫管數為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制EXGFP-A的洗脫曲線.

采用 0.22，μm 的微孔濾膜對 10，mg/mL的EXGFP-A 溶液進行過濾后，備用.液相色譜條件：島津 CT0-20A高效液相色譜儀，Shodex OHPak SB-804HQ（8.0，mm×300，mm）凝膠色譜柱；流動相為超純水，流量為 0.8，mL/min；示差檢測器檢測，色譜柱和檢測器溫度為 30，℃.相對分子質量校正曲線所用標準品為Dextran系列，標準曲線y=-0.039，89x3+ 1.174x2-12.06x+47.704，R2=0.999.

1.4EXGFP-A理化性質測定

1.4.1顯色實驗

淀粉檢測：將EXGFP-A精確配制成1%，的多糖溶液，取1，mL加入2%，的碘-碘化鉀溶液3，mL，混勻后靜置，觀察有無顏色變化.

多酚類物質檢測：將 EXGFP-A精確配制成5，mg/mL 的多糖溶液，加入 1%，的 FeCl3溶液 1～2滴，搖勻后靜置，觀察有無顏色變化.

糖醛酸檢測：將 EXGFP-A 精確配制成0.1，mg/mL 的多糖溶液，取 1，mL加入 6，mL濃H2SO4溶液，85，℃水浴 20，min，室溫靜置，加入0.15%，的咔唑乙醇溶液200，μL，85，℃水浴20，min，室溫靜置，觀察有無紫紅色絡合物產生.

1.4.2EXGFP-A的紫外掃描

將 EXGFP-A準確配制成 1，mg/mL 的多糖溶液，以蒸餾水為空白參照，分別進行紫外全波長掃描，掃描范圍是190～400，nm.

1.4.3EXGFP-A的紅外光譜

1，mg EXGFP-A樣品以KBr壓片，在室溫條件下測定多糖樣品的紅外光譜［13］.

1.5EXGFP-A免疫活性實驗

1.5.1EXGFP-A對RAW264.7細胞增殖活性的影響

采用MTT法［14］測定EXGFP-A作用RAW264.7細胞一定時間后，使用酶標儀測定 570，nm處各孔的吸光度.細胞增殖率=A加藥/A對照×100%，.

1.5.2EXGFP-A對RAW264.7細胞吞噬活性的影響

本實驗采用中性紅吞噬法測定 EXGFP-A處理RAW264.7細胞一定時間后，使用酶標儀測定540，nm處的吸光度.

1.5.3EXGFP-A對RAW264.7細胞形態的影響

取處于對數生長期的RAW264.7細胞進行計數，調整細胞懸液密度為5×104，mL-1，以每孔2，mL加入放有蓋玻片的6孔細胞培養板中，37，℃、5%， CO2培養4～6，h使細胞充分貼壁.棄去培養液，加入質量濃度分別為0、40、80、160，μg/mL的EXGFP-A，37，℃、5%， CO2細胞培養箱中繼續培養48，h.

細胞培養結束后，用 PBS緩沖液洗去殘留培養液，然后以 2.5%，戊二醛溶液固定細胞 2，h，以不同體積分數（10%，、30%，、50%，、70%，、90%，、100%，）的乙醇依次對細胞進行脫水處理，取出蓋玻片，剪成適量大小粘于樣品臺，待噴金后進行電鏡掃描，觀察經EXGFP-A作用前后RAW264.7細胞的形態變化.

2　結果與討論

2.1灰樹花多糖的分離純化

經減壓濃縮、乙醇醇沉、脫脂、酶-sevag法除蛋白、AB-8大孔吸附樹脂脫色、超濾除雜、Sephadex G-100色譜柱分離以及冷凍干燥，最終得到灰樹花多糖EXGFP-A，得率為2.84，g/L.

2.2EXGFP-A的純度鑒定

EXGFP-A的純度鑒定結果如圖1所示.

圖1　EXGFP-A葡聚糖凝膠 G-75洗脫曲線和高效液相色譜圖Fig.1 Sephadex G-75 flew curve and HPLC of EXGFP-A

從Sephadex G-75洗脫曲線可以看出，EXGFP-A的洗脫峰為單一對稱峰型，說明EXGFP-A是宏觀均一的多糖組分.高效液相色譜圖中出現較單一對稱主峰，表明該組分是均一多糖，經測定純度為92.68%，，相對分子質量為1.355×106.

2.3EXGFP-A的理化性質測定

EXGFP-A顯色實驗結果見表1.EXGFP-A為白色粉末狀，溶于水但不溶于有機試劑，是一種非淀粉類、不含多酚類物質及糖醛酸的中性多糖.

表1　EXGFP-A顯色實驗Tab.1 Color experiments of EXGFP-A

紫外全波長掃描顯示（圖 2），EXGFP-A在260，nm和 280，nm處無明顯吸收峰，說明 EXGFP-A組分中基本不含核酸以及蛋白質，而在 196，nm處有多糖的特征吸收峰，說明 EXGFP-A組分是多糖類物質.

圖2　EXGFP-A紫外掃描圖譜Fig.2 UV scanning of EXGFP-A

EXGFP-A的紅外光譜分析結果如圖3所示.在3，600～3，200，cm-1處是 O—H伸縮振動；2，934，cm-1為C—H伸縮振動；1，652，cm-1、1，400～1，200，cm-1是C—H的變角振動，以上特征吸收峰證明 EXGFP-A是糖類物質.在 1，700～1，775，cm-1處無明顯吸收峰，表明樣品中不含羧基，即 EXGFP-A是中性多糖. 1，870～1，540，cm-1處是 C=O伸縮振動.1，069，cm-1處的吸收峰表明EXGFP-A中存在3-6-內醚橋，即樣品中含有3-6-內醚-半乳糖，而852，cm-1處的吸收峰表明 EXGFP-A的單糖組成為α -D-葡萄吡喃糖，即EXGFP-A屬于吡喃型多糖.此外，807，cm-1處的特征峰則說明在多糖分子中存在甘露糖苷鍵，619，cm-1處的吸收峰表明多糖中含有葡萄糖殘基.

圖3　EXGFP-A紅外分析圖譜Fig.3 FT-IR spectroscopic analysis of EXGFP-A

2.4EXGFP-A的免疫活性研究

2.4.1EXGFP-A對RAW264.7細胞增殖活性的影響

巨噬細胞作為一種重要的免疫細胞廣泛分布于機體中，通過呈遞抗原、吞噬侵入體內的有害物質、分泌細胞因子等途徑發揮防御和調節功能，參與機體的特異性、非特異性免疫反應［15］，在宿主防御方面扮演著重要作用.當處于休眠狀態的巨噬細胞受到一些免疫增強劑激活后，會表現出更強的殺菌、增殖、吞噬及胞飲能力［16］.

本實驗采用噻唑藍比色法，即 MTT法測定EXGFP-A對 RAW264.7細胞增殖活性的影響，以脂多糖（LPS）處理組作為陽性對照，*和**分別表示與空白組相比P＜0.05和P＜0.01，結果如圖4所示.

圖4　EXGFP-A作用質量濃度和作用時間對RAW264.7細胞增殖活性的影響Fig.4 Effects of EXGFP-A concentration and culturing time on cell proliferation of RAW264.7 cells

不同質量濃度的EXGFP-A與細胞共同培養后，細胞的增殖能力均有所增加.在共同培養 48，h后，EXGFP-A作用質量濃度為80，μg/mL時，RAW264.7細胞的增殖指數最大，為 137.5%，.當以 80，μg/mL EXGFP-A在不同培養時間作用于 RAW264.7細胞后，結果如圖4（b）所示.當EXGFP-A作用時間達到48，h時，增殖效果達到最大.

以上結果表明，EXGFP-A能夠增強 RAW264.7細胞的增殖活性.EXGFP-A作用于RAW264.7細胞的最佳質量濃度為80，μg/mL，最佳作用時間為48，h.

2.4.2EXGFP-A對RAW264.7細胞吞噬活性的影響

吞噬作用是巨噬細胞對入侵病原微生物的直接反應，是免疫系統維持自身內環境穩定的重要手段，是非特異性免疫的關鍵環節，也是機體產生免疫應答的基礎和免疫功能活化的指標.

通過中性紅吞噬實驗測定 EXGFP-A作用后RAW264.7細胞的吞噬能力，以脂多糖（LPS）處理組作為陽性對照，*和**分別表示與空白組相比 P＜0.05和P＜0.01，結果如圖5所示.當EXGFP-A作用質量濃度為 80，μg/mL時，RAW264.7細胞吞噬活性最高.中性紅吞噬實驗初步說明EXGFP-A能夠刺激RAW264.7細胞使其處于活化狀態，能通過提高巨噬細胞的吞噬能力來發揮多糖的免疫活性，執行各種免疫防御功能.

圖5　EXGFP-A作用質量濃度對RAW264.7細胞吞噬活性的影響Fig.5　Effects of EXGFP-A concentration on the pinocytic activity of RAW264.7 cells

2.4.3細胞形態學觀察

RAW264.7細胞經EXGFP-A處理后，利用掃描電子顯微鏡觀察 EXGFP-A作用前后所引起的細胞外觀形態變化，結果如圖 6所示.當用 80，μg/mL EXGFP-A分別作用于細胞24，h、48，h和72，h后，與對照組細胞相比，經藥物作用后的細胞體積明顯增大，表面凸起明顯，貼壁面積明顯增大，褶皺增加，并有部分偽足出現.以上結果表明，當用 80，μg/mLEXGFP-A作用于細胞 48，h時，細胞活化特征最為明顯.

圖6　EXGFP-A作用RAW264.7細胞的掃描電鏡圖Fig.6 SEM images of RAW264.7 cells treated with EXGFP-A

3　結 論

灰樹花胞外多糖 EXGFP-A是一種主要含有葡萄糖的吡喃型中性多糖，并對 RAW264.7的細胞增殖和吞噬活性具有明顯的促進作用.EXGFP-A能夠促進細胞的形態變化，使細胞呈現出激活狀態，說明EXGFP-A可以激活RAW264.7細胞，增強機體的免疫活性，證實了灰樹花胞外多糖EXGFP-A具有體外免疫活性.但是，多糖所引起的免疫效應可歸因于細胞內多條信號轉導通路的相互作用，因此，可從分子、受體水平通過免疫印跡等方法深入研究多糖激活細胞的作用機制，為灰樹花胞外多糖的開發利用提供理論依據.

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責任編輯：郎婧

The Isolation，Purification and Immunomodulatory Activity of Extracellular Polysaccharide from Grifola frondosa

HAN Lirong，CHENG Dai，MENG Meng，WANG Lirui，WANG Chunling
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

An extracellular polysaccharide（EXGFP）was obtained by submerged culture of Grifola frondosa，and its property and immunomodulatory activity were investigated.The final purified fraction，EXGFP-A，was obtained by using alcohol for precipitation，enzymes-sevag for deproteinization and Sephadex G-100，gel column for further isolation and purification.The purity of EXGFP-A was tested with Sepharose 4B gel column and HPLC.The results show that EXGFP-A is a homogeneous polysaccharide，and its purity is about 92.68%，.Tests of its physicochemical properties indicate that EXGFP-A is a non-starch neutral polysaccharide，excludes uronic acid and polyphenols，and contains α-D-glucoside bond and pyranose ring.The result of MTT assay shows that the cell proliferation index reached a maximum of 137.5%， when EXGFP-A was at a concentration of 80，μg/mL and the treatment time was 48，h.The neutral red phagocytosis experiment indicates that the phagocytic activity of RAW264.7，cells was significantly enhanced by EXGFP-A.According to scanning electron microscope，the activation of RAW264.7，cells could also be promoted by adding EXGFP-A.

Grifola frondosa；extracellular polysaccharide；purification；mouse macrophage RAW264.7；immunomodulatory activity

R979.5

A

1672-6510（2016）04-0025-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150117

2015-09-08；

2015-12-03

國家科技支撐計劃資助項目（2012BAD33B04）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃資助項目（13JCZDJC29800）

韓麗榮（1990—），女，內蒙古人，碩士研究生；通信作者：王春玲，教授，wangchunling@tust.edu.cn.