氨基脲分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用

利健文 韋壽蓮 江杰濤

1(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 510520) 2(肇慶學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，肇慶 526061)

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氨基脲分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用

利健文1韋壽蓮*2江杰濤2

1(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 510520)2(肇慶學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，肇慶 526061)

以氨基脲(SEM)為模板分子，鄰苯二胺為功能單體，在0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.2)中，通過電聚合法制備分子印跡傳感器。采用循環(huán)伏安法(CV)、差分脈沖法(DPV)、電化學(xué)阻抗譜( EIS)和掃描電鏡表征了此分子印跡傳感器的識別性能和表面形貌。結(jié)果表明，此傳感器具有粗糙、多孔的形貌，對SEM具有良好的選擇性識別。在0.5 mol/L KCl-0.005 mol/L K3[Fe(CN)6]溶液中，采用DPV方法考察了功能單體與模板分子的摩爾比、模板洗脫劑、洗脫時間和溫育時間對傳感器響應(yīng)的影響。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件為: 功能單體與模板分子的摩爾比1∶2，洗脫液為0.2 mol/L NaOH，洗脫時間15 min，溫育時間12 min。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，傳感器的DPV峰電流差值與SEM的濃度在3.75～188 ng/L范圍呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1.5 ng/L (S/N=3)。將此傳感器應(yīng)用于市售新鮮蝦肌肉及受污染蝦肌肉中SEM含量測定，加標(biāo)回收率為80%～97%。

鄰苯二胺； 電聚合； 分子印跡電極； 蝦； 氨基脲

1 引 言

呋喃西林有抑菌或殺菌作用，能有效促進(jìn)動物生長，提高產(chǎn)量，因而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。呋喃西林的代謝產(chǎn)物氨基脲(SEM)能與動物體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合, 形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)合物，而在動物體內(nèi)殘留相當(dāng)長的時間[1]。研究表明，SEM能誘導(dǎo)基因突變，可導(dǎo)致多種組織器官的形態(tài)改變，具有潛在致癌性和增強(qiáng)組胺毒性[2,3]。目前, 檢測氨基脲的方法主要有高效液相色譜-熒光或質(zhì)譜檢測(HPLC-FID或MS)[4～7]、酶聯(lián)免疫分析法[8,9]、免疫色譜分析[10]等。其中HPLC-MS/MS法應(yīng)用廣泛，靈敏度和選擇性高，但因儀器昂貴、操作過程繁瑣，不利于實(shí)際檢測中的推廣應(yīng)用。

分子印跡電化學(xué)傳感器具有選擇性和靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已應(yīng)用于抗生素[11,12]、有機(jī)污染物[13]、農(nóng)藥殘留[14]、食品添加劑[15]、中藥[16,17]以及氨基酸[18,19]的檢測，其中電聚合法制備印跡聚合物膜因制備過程簡單易行、膜薄而均勻、響應(yīng)快、靈敏度高而被廣泛采用。常用于電聚合的功能單體為鄰苯二胺(o-PD)、鄰氨基苯酚、甲基丙烯酸、吡咯、溴酚藍(lán)等，所涉及的模板分子多為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如沙丁胺醇[20]、褪黑素[15]、金霉素[21]、苯巴比妥[22]、氫氯噻嗪[23]、多巴胺[24]等，模板分子易于去除。而電聚合法應(yīng)用于線型結(jié)構(gòu)的小分子的印跡和檢測的報道很少[25]。

本研究以SEM為模板分子，o-PD為功能單體，在銅電極表面以電聚合法制備SEM印跡電化學(xué)傳感器，建立了一種簡便、快速、靈敏的分析方法，用于檢測蝦中SEM殘留量。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CHI630D電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器有限公司); 銅圓盤電極(Φ2 mm);o-PD(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司); K3[Fe(CN)6] (分析純，上海化學(xué)試劑一廠); SEM標(biāo)準(zhǔn)品、呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)品(分析純, 德國Dr. Ehrenstorfer公司); 其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.2)，0.5 mol/L KCl-5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液; 0.01 mol/L SEM儲備液，低溫保存，其標(biāo)準(zhǔn)液通過逐級稀釋的方法配制。

2.2 電極的處理

將銅電極用0.05 μm Al2O3懸濁液打磨拋光，然后用無水乙醇超聲清洗3 min，再用水沖洗、晾干。

2.3 SEM印跡膜的制備

在10 mL 0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖液(pH 5.2)、0.5 mol/L KCl中加入0.0108 go-PD和0.0223 g SEM，超聲10 min，通氮?dú)? min，采用三電極系統(tǒng): 處理好的銅電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，室溫下在0.2～1.0 V的電位范圍，以100 mV/s循環(huán)掃描10圈，形成SEM印跡膜。將此電極置于0.2 mol/L NaOH中攪拌洗脫15 min，得到分子印跡電極(MIP)。非印跡電極(NIP)的制備除不加模板SEM外，其余步驟與MIP的制備方法相同。

2.4 電化學(xué)檢測

將MIP電極浸入不同濃度的SEM標(biāo)準(zhǔn)液中溫育12 min，取出用水沖洗、濾紙吸干。采用三電極系統(tǒng): MIP電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，室溫下以0.5 mol/L KCl-5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液為底液進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)或差分脈沖伏安(DPV)掃描。每次掃描后，將電極置于0.2 mol/L NaOH溶液中洗脫15 min進(jìn)行再生。

2.5 樣品制備

新鮮的南美對白蝦(平均重10 g，購自肇慶市農(nóng)貿(mào)市場)。將市售對白蝦放入含15 μg/L呋喃西林水中分別污染2、4、6和8 h后取肉, 勻漿。分別稱0.200 g勻漿蝦肉, 置于5 mL離心管，同時進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加水平分別為1.0，5.0和10.0 μg/kg SEM標(biāo)準(zhǔn)品。加入3 mL 50%甲醇(V/V)，渦旋2 min，4000 r/min離心5 min; 于沉淀中加入2 mL 0.2 mol/L HCl，渦旋1 min，置37℃恒溫箱中反應(yīng)16 h。 然后用1 mol/L NaOH調(diào)至pH中性，加入2 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩提取10 min，以10000 r/min離心10 min，收集乙酸乙酯層，用氮?dú)獯蹈蒣26]; 殘渣用2.0 mL 30%(V/V)甲醇溶解，再以2 mL正己烷萃取，靜置10 min分層; 收集下層清液進(jìn)行電化學(xué)檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 電聚合制備分子印跡膜

圖1 電聚合制備SEM分子印跡膜Fig.1 Cyclic voltammograms for electropolymerization of o-phenylenediamine (o-PD) in the presence of semicarbazide (SEM)掃描圈數(shù): 10; 掃描速度: 100 mV/s。Scan cycles: 10; scan rate: 100 mV/s.

由圖1可知，o-PD在銅電極表面的電聚合過程為不可逆的氧化過程，峰電壓(Ep)為0.47 V，峰電流(ip)為163.1 μA，且峰電流隨掃描圈數(shù)增加急劇減小，至第6圈后基本保持不變。原因是o-PD在電極表面形成非導(dǎo)電的聚合膜，使電子傳遞受到抑制。非印跡膜的CV曲線與SEM印跡膜的CV曲線無明顯差別，這是由于SEM在聚合過程中無電活性，不干擾o-PD的電聚合，SEM的結(jié)構(gòu)也未發(fā)生改變。

3.2 SEM 分子印跡膜的表征

3.2.2 交流阻抗表征 在交流阻抗譜中，高頻區(qū)半圓的直徑等于電子傳遞的阻抗Ret。由圖3可見，未洗脫模板的印跡電極的Ret(曲線d)遠(yuǎn)大于裸電極的Ret(曲線a)，說明印跡膜阻礙氧化還原探針在電極表面的電子轉(zhuǎn)移; 洗脫模板后，印跡電極的Ret減小(曲線b)，說明印跡電極表面出現(xiàn)印跡空穴，形成氧化還原探針傳輸?shù)耐ǖ? 而進(jìn)行溫育后的印跡電極的阻抗又急劇增大(曲線c)，說明印跡電極表面的傳輸通道被SEM封閉，這與循環(huán)伏安表征結(jié)果一致，進(jìn)一步證明制備的傳感器具有良好的印跡效應(yīng)。

圖2 不同電極在0.5 mol/L KCl +5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液中的循環(huán)伏安曲線Fig.2 Cyclic voltammograms of different electrodes in 0.5 mol/L KCl +5 mmol/L K3[Fe(CN)6] solution(a) 裸電極; (b) 洗脫模板后的印跡電極; (c) 印跡電極在1 μmol/L SEM溶液中溫育2 min; (d) 未洗脫模板的印跡電極。(a) bare electrode; (b) molecular imprinted polymer (MIP)-electrode after removal of template SEM; (c) MIP-electrode after incubated in 1 μmol/L SEM solution for 2 min; (d) MIP-electrode without removal of template SEM.

圖3 不同電極在0.5 mol/L KCl +5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液中的電化學(xué)阻抗圖Fig.3 Electrochemical impedance spectrogram of diffe-rent electrodes in 0.5 mol/L KCl +5 mmol/L K3[Fe(CN)6] solution(a) 裸電極; (b) 洗脫膜板后的印跡電極; (c) 印跡電極在1 μmol/L SEM溶液中溫育2 min; (d) 未洗脫模板的印跡電極。(a) Bare electrode; (b) MIP-electrode after removal of template; (c) MIP-electrode after incubated in 1 μmol/L SEM solution for 2 min; (d) MIP-electrode without removal of template.

圖4 不同電極在0.5 mol/L KCl +5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液中的差分脈沖響應(yīng)Fig.4 Differential pulse voltammetric responses of different electrodes in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6] solution(a) 裸電極; (b) 洗脫模板后的印跡電極; (c) 印跡電極在1 μmol/L SEM溶液中溫育2 min; (d) 未洗脫模板的印跡電極。(a) Bare electrode; (b) MIP-electrode after removal of template; (c) MIP-electrode incubated in 1 μmol/L SEM solution for 2 min; (d) MIP-electrode without removal of template.

3.2.3 差分脈沖伏安(DPV)表征 由圖4可見，未洗脫模板的印跡電極(曲線d)未觀察到DPV峰電流，洗脫模板后的印跡電極產(chǎn)生一個顯著的DPV還原峰(曲線b)，說明模板分子被有效去除; 而與SEM進(jìn)行溫育后的印跡電極的還原峰電流急劇減小(曲線c)，表明印跡電極對SEM分子具有良好的識別能力。

3.2.4 掃描電鏡表征 由圖5可見，未洗脫模板的印跡膜電極表面聚合物排列均勻、致密; 洗脫模板后的電極表面粗糙、多孔。掃描電鏡的結(jié)果與電化學(xué)表征結(jié)果一致。

圖5 未洗脫模板(A)和洗脫模板后(B)的印跡電極的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopic images of MIP-electrode before (A) and after (B) removal of template

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.3.1 模板分子和功能單體的配比 將SEM與功能單體摩爾比分別為1∶1，1∶2，1∶4的印跡電極在1 μmol/L SEM溶液中進(jìn)行電流-時間檢測，結(jié)果表明，兩者摩爾比為1∶2的印跡電極，具有較大的響應(yīng)電流、較短的響應(yīng)時間; 摩爾比為1∶4的印跡電極，響應(yīng)時間較長，可能是功能單體過多產(chǎn)生自聚導(dǎo)致印跡識別位點(diǎn)較少的緣故；摩爾比為1∶1的印跡電極，響應(yīng)時間較長且響應(yīng)電流較低，原因可能是功能單體量較少，形成的識別位點(diǎn)少，模板分子需要較長時間才能到達(dá)空穴內(nèi)部。因此，選擇SEM與功能單體摩爾比為1∶2的印跡電極進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 洗脫時間對印跡電極電流響應(yīng)的影響Fig.6 Effect of elution time on current responses of MIP-electrodes電位范圍: -0.2～0.6 V (potential range: -0.2～0.6 V); 脈沖幅度: 50 mV/s (pulse amplitude: 50 mV/s)；電位增量: 4 mV/s (potential increment: 4 mV/s)；脈沖寬度: 5 s (pulse width: 5 s)；脈沖間隔: 1 s (pulse interval: 1 s); (1) 0 min; (2) 3 min; (3) 6 min; (4) 9 min; (5) 12 min; (6) 18 min; (7) 15 min。

3.3.2 洗脫液和洗脫時間的選擇 考察20%, 50%和70%的乙醇溶液、50%甲醇-乙酸溶液(V/V)、70%甲醇-乙酸溶液(V/V)、NaOH、H2SO4和HCl溶液對模板分子的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)NaOH溶液洗脫效果較好。考察不同濃度 NaOH溶液對模板分子的洗脫效果發(fā)現(xiàn)，0.2 mol/L NaOH的洗脫效果最好。考察不同洗脫時間的影響，發(fā)現(xiàn)隨洗脫時間增加，印跡電極在K3[Fe(CN)6]溶液中的DPV還原峰電流不斷增大；15 min時，峰電流最大(圖6)，超過15 min，峰電流有所下降，可能是長時間洗脫導(dǎo)致印跡膜發(fā)生輕微溶脹使印跡位點(diǎn)被堵塞。因此，選擇洗脫時間為15 min。

3.3.3 溫育時間的選擇 印跡電極與分析物的溫育時間影響傳感器的靈敏度。將洗脫模板后的印跡電極浸泡在1×10-6mol/L SEM溶液中分別溫育不同時間，然后進(jìn)行DPV掃描。結(jié)果表明，峰電流隨著溫育時間增加而不斷下降，12 min后峰電流降至最低且保持穩(wěn)定。因此，選擇溫育時間為12 min。

3.4 分析方法的建立

3.4.1 線性方程與檢出限 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，印跡電極與不同濃度SEM溶液溫育12 min后，在5 mmoL/L K3[Fe(CN)6]溶液中進(jìn)行DPV掃描(圖7A)。結(jié)果表明，印跡電極在空白溶液中測得的峰電流與經(jīng)不同濃度SEM溶液溫育后所測得的峰電流的差值Δi(μA)與SEM濃度c(μg/L)在3.75×10-3～0.188 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖7B)，線性方程為Δi=115.39c+3.28 (R=0.995)，檢出限1.5×10-3μg/L (S/N=3)。實(shí)際樣品按照“2.5樣品制備”處理后，計算其檢出限為0.015 μg/kg，低于歐盟規(guī)定的可食用動物組織中SEM最低檢出限量水平 (1 μg/kg)[27]，因此本方法能滿足水產(chǎn)品中痕量SEM的檢測要求。

圖7 不同濃度氨基脲的差分脈沖曲線(A)和氨基脲濃度與峰電流差的關(guān)系(B)Fig.7 Differential pulse voltammetric (DPV) curves of different concenteations of SEM (A) and peak current difference vs SEM concentration (B) 實(shí)驗(yàn)條件與圖6相同 (Experimental conditions are same as Fig. 6 ); (A) 曲線1～8對應(yīng)的濃度(The concentration of curve 1～8): 0, 1.50, 3.75, 7.51, 37.5, 75.1, 188, 939 ng/L。

3.4.2 分子印跡電極的選擇性 以SEM結(jié)構(gòu)類似物(尿素、丙二酰胺和N,N-二甲基乙酰胺)和水產(chǎn)品中可能含有的違禁獸藥 (呋喃西林、氯霉素和己烯雌酚) 進(jìn)行選擇性實(shí)驗(yàn)。印跡電極分別經(jīng)二次蒸餾水和濃度均為188 ng/L SEM溶液、結(jié)構(gòu)類似物溶液和違禁獸藥溶液溫育，再于5 mmoL/L K3[Fe(CN)6]溶液進(jìn)行DPV測定。定義選擇因子K=Δiint/ΔiSEM，其中Δiint和ΔiSEM分別為干擾物和SEM產(chǎn)生的相對峰電流差值。由表1可知，尿素、丙二酰胺和N,N-二甲基乙酰胺的選擇因子分別為0.27, 0.20和0.15，表明印跡膜電極對SEM的結(jié)構(gòu)類似物有一定的選擇性，但這些類似物在水產(chǎn)品中通常極少存在。同時發(fā)現(xiàn)相同濃度的呋喃西林、氯霉素和己烯雌酚峰電流的變化值≤7.6%，不干擾SEM的檢測，說明本方法選擇性高。

表1 印跡電極的選擇性

Table 1 Selectivity of MIP-electrodes

分析物Analyte響應(yīng)電流Currentresponsei(μA)電流差值Δi(μA)選擇因子Selectionfactor(K)空白溶液Blank48.76--氨基脲SEM24.3924.37-尿素Urea42.186.580.27丙二酰胺Malonamide43.864.90.20N,N-二甲基乙酰胺N,N-Dimethylacetamide45.063.70.15呋喃西林Nitrofurazone46.362.40.098氯霉素Chloramphenicol47.061.70.070己烯雌酚Diethylstilbestrol47.461.30.053

3.4.3 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性 在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，采用同一傳感器以DPV方法測定188 ng/L SEM溶液，平行測定6次(每次測定后，以0.2 mol/L NaOH再生)，測得的峰電流的標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%；連續(xù)重復(fù)使用25次后，電流響應(yīng)為起始電流響應(yīng)值的90%，表明此傳感器具有良好的重現(xiàn)性。每天用此傳感器平行測188 ng/L SEM溶液3次，連續(xù)測定10天。結(jié)果表明，前5天電流的響應(yīng)值大于起始電流響應(yīng)值的93%以上，10天后降至82%，說明傳感器有較高的穩(wěn)定性。

3.5 樣品分析

將建立的方法應(yīng)用于測定市售活蝦及其分別受呋喃西林溶液污染2, 4, 6和8 h后SEM含量，結(jié)果見表2。市售活蝦中未檢出SEM，但其受呋喃西林溶液污染2, 4, 6和8 h后均檢出SEM，且含量隨污染時間增加而不斷增大，說明呋喃西林的代謝標(biāo)志物SEM在蝦肉內(nèi)蓄積嚴(yán)重，與越南黑虎蝦中呋喃唑酮的消除研究結(jié)果類似[28]。蝦樣品在3個不同水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)表明，SEM的平均回收率為80%～97%，RSD≤5%(n=3)，表明本方法準(zhǔn)確、可靠。

4 結(jié) 論

以鄰苯二胺為功能單體，在銅電極表面采用電聚合法制備了SEM分子印跡電化學(xué)傳感器。此傳感器對SEM的選擇性良好、響應(yīng)快、檢出限低、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，應(yīng)用于檢測市售活蝦及受呋喃西林污染的活蝦中SEM，結(jié)果令人滿意，可望應(yīng)用于監(jiān)測水產(chǎn)品、動物源食品中禁用的抗生素呋喃西林的含量。

表2 蝦中SEM的測定結(jié)果

Table 2 Analytical results of SEM in shrimp

污染時間Contaminationtime(h)測得值Found(μg/kg)加標(biāo)量Added(μg/kg)測得總量Totalfound(μg/kg)平均回收率Recovery(%)RSD(%,n=3)0ND*22.142.463.084.31.00.95954.25.04.6925.0109.7974.61.03.0904.95.06.5884.41011893.81.03.3904.65.06.6844.11011863.71.03.9904.05.07.7943.81011803.51.05.2903.15.08.9923.61013872.7*ND:未檢出(notdetected)。

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(Received 8 April 2015; accepted 6 November 2015)

Preparation and Application of Semicarbazide Electrochemical Sensor Based on Molecularly Imprinting Technique

LI Jian-Wen1，WEI Shou-Lian*2，Jiang Jie-Tao2

1(GuangdongFoodandDrugVocationalCollege,Guangzhou510620,China)2(FacultyofChemistryandChemicalEngineering,ZhaoqingUniversity,Zhaoqing526061,China)

A molecularly imprinted electrochemical sensor was prepared by electropolymerization using semicarbazide (SEM) as template molecule and o-phenylenediamine as functional monomer in 0.1 mol/L NaAc-HAc buffer solution (pH 5.2). The performance and surface feature of the proposed imprinted sensor was investigated using cyclic voltammetry (CV), differential pulse voltammetry (DPV), electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and scanning electron microscope. The sensor had a rough and porous surface morphology, and showed good recognition and selectivity to SEM. The sensor performance was optimized by using DPV method in 0.5 mol/L KCl solution with 5 mmol/L K3[Fe(CN)6] as the electron transport medium. The optimized conditions were that the molar ratio of functional monomer to template molecule was 1∶2, the elution liquid was 0.2 mol/L NaOH, and elution and incubation time was 15 and 12 min, respectively. The DPV peak current difference of the sensor had a linear relationship with the concentration of SEM in the range of 3.75～188 ng/L and the detection limit was 1.5 ng/L (S/N=3). The prepared imprinted sensor was used to detect SEM in commercially available fresh shrimp muscles as well as shrimp contaminated with drugs with satisfactory results, and the recoveries of SEM were in the range of 80%-97%.

o-Phenylenediamine; Electropolymerization; Molecular imprinted electrode; Shrimp; Semicarbazide

10.11895/j.issn.0253-3820.150180

2015-04-08收稿；2015-11-06接受

本文系廣東省教育廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No.2012kjcx0104), 肇慶市科技計劃項(xiàng)目(No.2013C019)資助

* E-mail: weishlmary@126.com