雞胸肉冷藏過程中腐敗菌分析及其品質變化研究

梁慧，于立梅，陳秀蘭，趙宇鵬，曾曉房，卜堅珍

1(仲愷農業工程學院 輕工食品學院,廣東 廣州，510225) 2(廣州市畜牧科學研究所,廣東 廣州，510095) 3(廣東第二師范學院，廣東 廣州，510303)

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雞胸肉冷藏過程中腐敗菌分析及其品質變化研究

梁慧3，于立梅1*，陳秀蘭2，趙宇鵬1，曾曉房1，卜堅珍1

1(仲愷農業工程學院 輕工食品學院,廣東 廣州，510225) 2(廣州市畜牧科學研究所,廣東 廣州，510095) 3(廣東第二師范學院，廣東 廣州，510303)

為了探討冷鮮雞肉的主要腐敗菌及其冷藏過程中菌相的變化，以雞胸肉為原料， 采用傳統微生物培養方法和16S rDNA測序相結合方法對冷鮮雞肉腐敗菌進行了分離鑒定。研究腐敗菌在冷藏過程中動態變化及冷藏對雞肉品質的影響。結果表明：乳酸菌、葡萄球菌、腸桿菌、假單胞菌是冷鮮雞雞胸肉中的主要腐敗菌。初始菌相構成中，乳酸菌和葡萄球菌所占比例最大，為35%，腸道桿菌占29%，假單胞菌占最少，僅為1%。冷藏末期，冷鮮雞中主要腐敗菌菌相構成發生了顯著變化。葡萄球菌生長較慢占1%，假單胞菌占2%，乳酸菌占18%，腸道桿菌占79%。隨著冷藏時間的延長各類腐敗菌均呈現增長趨勢，但增長速率不同。葡萄球菌初期增長較快，末期較慢，腸桿菌及乳酸菌反之，并逐漸成為優勢菌群，假單胞菌則一直保持較慢的增長速度。質構和感官評價表明：隨著冷藏時間的遞增，冷鮮雞胸肉彈性下降，黏度增加，9天后雞肉開始腐敗變味，感官品質明顯變差。

雞胸肉； 腐敗菌；分離； 消長

雞肉中富含很多人體所需的蛋白質，且相對其他品種的肉，其脂肪和膽固醇含量低，目前是我國主要肉類品種之一，備受消費者喜歡。我國主要存在種類是以艾維茵為代表的快大型白羽肉雞和以我國地方品種為代表的優質黃羽肉雞。三黃雞的商品經濟價值位于家禽養殖之首。 惠陽胡須雞有1 700年的養殖歷史，早在1983年，龍門雞、龍崗雞、惠陽雞就被歸為一類，命名為三黃胡須雞，此雞外貌特征比較明顯，通常胸比其他雞種寬、雞腳相對短些，毛、腳、嘴都是黃色、下頜還有一撮胡須， “三黃一胡”特征是三黃胡須雞獨有的特色。作為中國優良地方肉用雞種，此雞主要表現為肉質細嫩、皮薄、肌間脂肪適量，肉味鮮美等[1-2]。廣東省三大出口名產雞為肇慶市封開縣的杏花雞、惠陽胡須雞和清遠市的麻雞。2014年廣東省農業廳已牽頭擬訂了《廣東省推行家禽“集中屠宰、冷鏈配送、冰鮮上市”工作實施方案》，冷鮮禽肉的安全成為人們最關心的話題。冷鮮雞是指在獸醫檢驗檢疫安全的基礎上，將屠宰后的雞胴體溫度迅速冷卻至0～4 ℃，并在整個食品供應鏈始終保持0～4℃范圍內的生鮮雞肉[3]。冷鮮雞肉在低溫貯藏條件下，有部分致腐微生物存在并生長繁殖，其代謝過程產生的某些物質會引起腐敗變質，因此微生物的數量與冷鮮雞肉的品質密切相關。本文以雞胸肉為研究對象，采用傳統微生物培養方法和16S rDNA測序相結合方法對冷鮮雞肉腐敗菌進行分離鑒定。研究雞肉冷藏過程中腐敗菌的消長規律及雞肉感官品質變化，將有利于收集冷鮮雞肉中微生物的信息，以便對產品的質量進行控制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試雞肉品種為純種三黃胡須雞，冷鮮胡須雞取自廣州市畜牧研究所養殖基地，并由廣州市畜牧所加工廠定點屠宰。取4 ℃下貯運40 min的新鮮雞胸肉，沖洗表面血污，將其切分成約25 g的塊狀，置于4 ℃下進行24 h排酸后備用。各類腐敗菌(葡萄球菌、腸道菌、乳酸菌、假單胞菌)的選擇培養基購于北京奧博星公司。DNA 快速抽提試劑盒、瓊脂糖、PCR擴增的全套試劑及合成的擴增引物，由上海美吉生物醫藥科技有限公司提供; 1%鹽酸二甲基對本二胺、1% α-萘酚-乙醇溶液、革蘭氏染色試劑盒、氫氧化鉀、磷酸氫二鉀購于廣州碩瑪儀器科技有限公司。

1.2 儀器

DU-730型紫外可見分光光度計，日本島津分析儀器廠；高壓滅菌鍋BXM-30R，上海博訊實業有限公司；電熱恒溫培養箱，上海索譜儀器有限公司；旋轉蒸發器RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺SW-CJ-1F，蘇州凈化設備有限公司；PCR儀TL988-IV，西安天隆科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 腐敗菌的分離純化

剪刀消毒后，無菌環境下剪25 g雞胸肉放入無菌培養皿，剪碎后置于三角瓶中，倒入225 mL無菌生理鹽水，把三角瓶振蕩后放在搖床中振蕩10 min后取出。取2 mL上清液于試管中，再加入18 mL無菌生理鹽水，按照預試驗選擇3個合適稀釋度菌液1 mL加入無菌培養皿中，每個樣品平行3次，加入平板計數瓊脂培養基，待凝結后于30 ℃下倒置培養48 h；然后挑取典型生長菌落在營養瓊脂平板上進行劃線培養2～3次，得到純化的單菌落，用于菌種的初步鑒定[4-5]。其中，腸道菌計數瓊脂培養基和葡萄球菌計數瓊脂培養基均于37 ℃培養48 h，乳酸菌選擇性培養基、假單胞菌選擇性培養基和熱死環絲菌選擇性培養基分別在30 ℃培養48 h，25 ℃培養48 h， 23 ℃培養48 h。

1.3.2 腐敗菌的初步鑒定

腐敗菌的初步鑒定根據《常見細菌系統鑒定手冊》和Brown推薦的肉制品中微生物鑒定圖譜，對分離純化的7株菌進行菌落和個體形態、染色反應及酶反應(接觸酶、氧化酶)、葡萄糖發酵、精氨酸雙水解酶和V-P等生理生化指標的檢測[6-7]。

1.3.3 腐敗菌的16S rDNA測序

挑取重新培養18～24 h的單菌落至液體培養基中過夜培養，采用細菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒直接提取 DNA，提取的 DNA 作為該菌株的擴增模板，于-20 ℃保存待下一步實驗。16S rDNA 的 PCR擴增以提取的 DNA 作為模板,采用通用引物 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)來擴增目的片段的基因[8-9]，測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.3.4 雞肉冷藏過程中腐敗菌菌數的測定[10]

取排酸后的雞胸肉，按紋理關系切割，尺寸為5 mm×4 mm×1 mm。將雞胸肉裝入保鮮袋里放入冷藏箱(冰箱)中4 ℃冷藏，樣品取樣時間分為0，3，6，9 d，按GB/T4789.2—2010《食品微生物學檢驗菌落總數測定》對冷鮮肉雞肉進行菌落總數、腸道菌群、乳酸菌群、葡萄球菌群、假單胞菌群測定，測定數據制作各類微生物生長曲線。

1.3.5 雞肉在冷藏過程中感官評價

由經過培訓的感官人員10人組成感官評價小組，總分為10分，評價的指標分別為冷鮮雞肉的色澤、黏度、 彈性、氣味以及肉湯，將各個指標得分加權后相加所得到的總分即為最終得分。

表1 雞肉在貯藏期間感官評定指標標準

1.3.6 冷鮮雞肉質構測定

采用美國 Brookfield 公司的CT3質構儀測定冷鮮雞胸肉，在進行測試時，初步選用雞胸肉，按紋理關系切割為尺寸50 mm×40 mm×10 mm。將雞胸肉裝入保鮮袋里放入冷藏箱中4 ℃冷藏，在室內(室溫15 ℃，相對濕度 38%)條件下進行測試。采用圓柱型探頭，探頭的直徑為12.7 mm、預壓力為0.07 N、可恢復時間為6 s、速度為4 mm/s、壓縮形變量為5 mm。

1.3.7 數據分析

每個試驗均重復3次。結果表示為平均值±標準偏差， 應用SPSS11.5軟件(SPSS Inc.， Chicago， IL， USA)進行方差和差異顯著性分析，P<0.05表示顯著，P<0.01表示極顯著。

2 結果與分析

2.1 菌種的個體形態、菌落形態及生理生化鑒定

通過傳統微生物分離方法，從不同培養基上分離各類菌，在顯微鏡下觀察前，單菌落要經革蘭氏染色，記錄顯微鏡觀察其形態結構及其在固體培養基上的菌落特征，菌落的特征見表1。由表1可以看出，7株菌落中3株為革蘭氏陰性菌，4株革蘭氏陽性菌。顏色由奶白、淺土黃、乳白3種顏色組成，分為半透明和不透明，呈現三角形，圓形，桿狀、乳頭狀。根據表2的結果，結合Brown推薦的肉品中微生物鑒定圖譜以及《常見細菌系統鑒定手冊》，通過各菌株在顯微鏡下的菌體形態、革蘭氏染色情況，結合各菌的菌落特征及生理生化特征，葡萄球菌為圓形、球狀、白色革蘭氏陽性菌，腸道桿菌為桿狀、淺黃色革蘭氏陰性菌，乳酸菌為圓形、透明或半透明、桿狀革蘭氏陽性菌，假單胞菌為圓形、半透明、桿狀革蘭氏陰性菌，初步鑒定結果為：1為假單胞菌2、4為乳酸菌3、6為桿菌5、7為球菌。

表1 菌落特征及菌株形態

表2 生理生化試驗結果

注:F代表發酵型；O代表氧化型；NT表示未檢測。

2.2 16S rDNA測序結果

對冷鮮雞中分離純化的7株菌進行16SrDNA測序，根據PCR擴增的DNA序列對比結果表明，1為假單胞菌P.Fluorescens，2、4為乳酸菌，3為腸道桿菌、5、7為葡萄球菌，6為克氏庫克菌。與傳統理化鑒定結果有較多共同菌，綜合判斷結果為，冷鮮雞中主要腐敗菌為葡萄球菌、腸桿菌、乳酸菌及假單胞菌。

表3 各樣品測序的種屬關系

2.3 冷鮮雞冷藏過程中腐敗菌菌相構成變化

對冷鮮雞冷藏初期的菌相構成進行分析，并繪制各類主要腐敗菌比例圖，圖1中的數值指的是各種腐敗菌占所檢腐敗菌總數的比例。由圖1中可以看出，初始菌相構成中，乳酸菌和葡萄球菌所占比例最大，為35%，其次為腸道桿菌，占了主要腐敗菌總數的29%，假單胞菌占最少，僅為1% 。說明早期菌相構成中，主要為乳酸菌、葡萄球菌及腸道桿菌，假單胞菌較少。假單胞是嚴格好氧菌，冷鮮肉用保鮮膜包裝，不利于氧氣的流通，初期不同菌相微生物之間也會因拮抗和共生有影響。葡萄球菌在自然界中分布很廣，是常見的腐敗菌，該菌主要起源于禽類本身[11]。

圖1 冷鮮雞冷藏初期菌相構成變化Fig.1 Construction of bacterial flora for initial period

圖2 冷鮮雞冷藏末期菌相構成變化Fig.2 Construction of bacterial flora for final period

圖2顯示，在冷藏末期(9d)，冷鮮雞中主要腐敗菌菌相構成發生了顯著變化，葡萄球菌受低溫影響，生長較慢占1%，假單胞菌占2%，乳酸菌從初期到末期雖然有減少，但速度較慢，末期占18%，桿菌從初期的29%，快速增長到占總數的79%，從數據上看，貯藏末期腸桿菌占絕對優勢。在冷藏溫度和高濕度下有利于其生長。雞肉因為大量桿菌在表面生長繁殖，會產生黏液。同時桿菌也能分解雞中的某些脂肪而加速脂肪的氧化作用，引起肉類酸敗[12]。乳酸菌末期占18%，成為腐敗的優勢菌。葡萄球菌較早期比例降低很多，可能是乳酸菌在生長繁殖的過程中產生酸，導致各菌株生長區域pH值降低，形成反饋抑制。假單胞菌比例基本不變說明對環境不敏感。

2.4 冷鮮雞冷藏過程中的菌相消長變化

圖3為冷藏過程中腐敗菌的動態變化。圖3顯示，在貯藏過程中，各類主要腐敗菌均呈增長趨勢，初期1～3 d葡萄球菌群數、腸道桿菌數、乳酸菌數遠遠高于假單胞菌，中期時乳酸菌占主要優勢，末期時腸桿菌和乳酸菌顯著高于其他2種，其中6～9 d范圍內葡萄菌屬反而稍微下降，這可能是菌種之間的協同和拮抗作用。從繁殖速率來看，葡萄球菌增長速度由快變慢，腸桿菌和假單胞菌則由慢變快，乳酸菌則是由慢變快再變慢。冷鮮肉新鮮度指標細菌總數臨界值為106CFU/g，此線為為警戒線，超過達到107CFU/g 時冷鮮肉會出現腐敗狀況，細菌總數達到108CFU/g時，由于微生物的大量繁殖，雞肉表面會形成粘液，這個形態的冷鮮肉已經不適合食用。腸桿菌與乳酸菌在冷藏過程的第9天，數量值接近菌落總數的臨界值。

圖3 冷鮮雞冷藏過程中的菌相消長變化Fig.3 The bacteria growth change of chicken during the process of cold storage

2.5 冷鮮雞冷藏過程中質構變化

由圖4可知，雞胸肉硬度隨著時間的增大表現出下降的趨勢，1～3 d變化趨勢下降趨勢較明顯，雞胸硬度由6.13 N至4.89 N，下降了1.24 N，雞胸由第3～5 d顯示出上升的趨勢，可能是由于雞屠宰后肉樣持水力下降，內部結構組織被破壞，彈性下降出現緊實感，使底部效應加強致使硬度值變大。可恢復形變隨著時間的增長同樣表現出下降的趨勢，說明肉樣恢復自身形變的程度逐步下降，恢復自身結構的能力降低。雞胸彈性在1～5 d內變化不明顯，波動性下降又回升，第5～7 d以后逐步升高，上升趨勢可能是由于肉樣變質，表面粘性增大，探頭返回時回拉扯肉樣上升，使測得的數據偏離真實彈性值。雞胸的膠黏性隨著時間的增大均逐步下降，說明組成樣品結構的內部鍵力逐漸減小，產生不可恢復形變所需要的功也逐漸減小。感官評價表明：冷鮮雞肉在冷藏過程中彈性、黏性、味道有較大變化，結合菌落總數分析，貯藏初期，腐敗菌總數較少，雞肉雖然彈性較低，但色澤、氣味較好，貯藏中期，微生物總數增加，對雞肉氣味及色澤產生一定影響，貯藏末期，微生物總數較多，腸桿菌占據總菌數一半以上，導致雞肉出現異味，色澤變暗，肉湯較差。

表4 冷鮮雞冷藏過程中新鮮度指標的變化

3 結論

傳統生理生化試驗鑒定冷鮮雞中腐敗微生物結果表明，冷鮮雞中腐敗微生物有腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌及假單胞菌， 16S rDNA檢測結果表明，冷鮮雞中腐敗微生物含有腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌、節桿菌、克氏庫克菌及假單胞菌等，兩者相對比有較多相符合。

應用選擇性培養基對冷鮮雞中腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌及假單胞菌生長特性研究表明，初始菌相構成中，乳酸菌和葡萄球菌所占比例最大，為35%，其次為腸道桿菌，占了主要腐敗菌總數的29%，假單胞菌占最少，僅為1% 。冷藏末期，也就是冷鮮雞微生物指標超過國家標準的第9天，冷鮮雞中主要腐敗菌菌相構成發生了顯著變化，葡萄球菌受低溫影響，生長較慢占1%，假單胞菌因初期含量較低占2%，乳酸菌雖有增長，但速度較慢，占18%，腸道桿菌快速增長，占79%，為絕對優勢。因此，冷鮮雞主要腐敗菌中腸桿菌和乳酸菌占大多數，為優勢菌群，葡萄球菌及假單胞菌較少。隨著冷藏時間的增加，雞肉彈性下降，粘度增加，9天雞肉開始腐敗變味，感官品質明顯變差。

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Analysis on spoilage strains in chicken breast and quality change during its cold storage

LIANG Hui1, YU Li-mei1*, CHEN Xiu-lan2, ZHAO Yu-peng1, ZENG Xiao-fang1, WU Jie3

1(College of Light Industry and Food Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China) 2(Guangzhou science institute of animal husbandry，Guangzhou 510095, China) 3(National Engineering Research Center of Corn Deep Processing,Changchun 130033, China)

In order to investigate the spoilage bacteria in chill fresh chicken and its quality change during the process of cold storage, the chicken breast was chosen as raw material, and the microorganisms in chicken breast were separated and identified by the traditional microbial cultivation combined with 16S rDNA sequencing method. The changes of these microorganisms and sensory evaluation also were studied during the process of cold storage. The results showed that Lactic acid bacteria,Staphylococcusaureus,E.coli, andPseudomonaswere major spoilage bacteria in chicken breast. Lactic acid bacteria andStaphylococcusaureusaccounted for the largest proportion of 35%,Enterobacteriaceaefor 29%,Pseudomonasaccountsfor only 1% in initial bacteria phase. The constitution of major spoilage bacteria changed dramatically at the end of cold storage. TheStaphylococcusgrew more slowly, and accounted for 1%,Pseudomonasaccounted for 2%, lactic acid bacteria accounted for 18%, intestinal bacteria accounted for 79%. The change of each kind of spoilage bacteria during the process of storage showed a growing trend with the extension of storage time. But the growth rate was different. TheStaphylococcus,Enterobacteriaceaeand lactic acid bacteria had the same number in early storage, andPseudomonasnumber was less. LateStaphylococcusgrew fast at first and then slow, on the contrary, intestinal bacteria and lactic acid bacteria grew fast at late stage and became the predominant bacterium group.Pseudomonasalways kept slow growth rate. Combined with the texture and the sensory evaluation, as the cold storage time increasing, chicken elasticity decreased, viscosity increased, the sour chicken began to be spoilage, sensory quality obviously changed.

chicken breast；spoilage bacterial；separate；change

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610030

碩士研究生(于立梅副教授為通訊作者，E-mail：biyingwang2003@163.com)。

廣州市科信局(2014Y2-00187)；國家級大學生創新項目(201411347020)

以：2015-10-19，改回日期：2016-03-28