分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)聚乳酸支架的制備與性能研究*

薄冬營(yíng)，郭振招，李 紅，李啟艷，周長(zhǎng)忍，趙要武

(1. 暨南大學(xué) 理工學(xué)院材料科學(xué)與工程系， 廣州 510632；2. 云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院牙周種植科, 昆明 650032；3. 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 口腔系， 廣州 510632)

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分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)聚乳酸支架的制備與性能研究*

薄冬營(yíng)1，郭振招1，李 紅1，李啟艷2，周長(zhǎng)忍1，趙要武3

(1. 暨南大學(xué) 理工學(xué)院材料科學(xué)與工程系， 廣州 510632；2. 云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院牙周種植科, 昆明 650032；3. 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 口腔系， 廣州 510632)

以左旋聚乳酸為原料，1,4-二氧六環(huán)/水為溶劑，采用熱致相分離法制備了具有分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)的組織工程支架。研究了溶劑配比、粗化時(shí)間對(duì)支架結(jié)構(gòu)和性能的影響。溶劑比為87/13(1,4-二氧六環(huán)/水)，PLLA濃度5%，粗化1 h時(shí)，制備出大孔孔徑達(dá)300 μm，小孔嵌在大孔孔壁上且孔徑在10 μm以下的高連通分級(jí)多孔支架。粗化時(shí)間的延長(zhǎng)使大孔孔徑有所增大。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明分級(jí)多孔支架有助于細(xì)胞長(zhǎng)入支架內(nèi)部，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

左旋聚乳酸；熱致相分離；分級(jí)；支架

0 引 言

組織工程是當(dāng)今組織再生、修復(fù)和重建領(lǐng)域的重要技術(shù)和手段[1]。作為細(xì)胞載體，組織工程支架需要有一定的機(jī)械強(qiáng)度和高連通的多孔結(jié)構(gòu)，以便支撐細(xì)胞的粘附增殖以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的傳遞[2]。組織工程支架的制備方法較多，如熱致相分離法，粒子瀝濾法，氣體發(fā)泡法，快速成型法等，均可制備出孔徑在100～500 μm的多孔支架；但往往存在支架結(jié)構(gòu)單一、孔的連通性不高，細(xì)胞難以長(zhǎng)入(ingrowth)支架內(nèi)部及物質(zhì)傳遞不充分的問題[3-4]。熱致相分離法可以制備不同形貌的支架材料，如納米纖維結(jié)構(gòu)、雙連通結(jié)構(gòu)及多孔蜂窩狀等，且孔徑大小可調(diào)、連通性好，可從不用角度滿足組織修復(fù)的需要[5-7]。從支架材料的設(shè)計(jì)上，大孔(約300 μm)利于細(xì)胞長(zhǎng)入支架內(nèi)部增殖；小孔易于細(xì)胞的粘附和組織的代謝[8]。本研究采用熱致相分離法制備了具有分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)的聚乳酸(PLLA)組織工程支架，研究了制備工藝對(duì)支架材料微觀結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能以及細(xì)胞粘附增殖的影響。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料及試劑

聚乳酸(PLLA)，Mw= 1.0×105(濟(jì)南岱罡生物科技有限公司)；1，4-二氧六環(huán)(A.R級(jí)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，去離子水，CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所，上海)。

1.2 支架的制備

按5%(w/v)將PLLA顆粒溶于不同溶劑中，溶劑配比為90/10，87/13，83/17(1，4-二氧六環(huán)/水，v/v)，恒溫?cái)嚢? h至均相透明溶液。然后加入一定比例的去離子水，繼續(xù)恒溫?cái)嚢? h，加熱溫度保持在濁點(diǎn)以上至少5 ℃。分別緩慢降溫至凝膠點(diǎn)溫度90/10(2 ℃)，87/13(25 ℃)，83/17(55 ℃)保持1，10，30 min，1 h，1.5，2 h進(jìn)行粗化。隨后將澄清溶液移至特制的聚四氟乙烯模具中，迅速轉(zhuǎn)移至液氮-196 ℃中冷凍1 h。最后將冷凍樣品進(jìn)行冷凍干燥24 h。具體工藝路徑如圖1所示。

圖1 PLLA支架的制備工藝流程圖

1.3 樣品的表征

支架的孔隙率測(cè)定采用體積法，按照下面的公式計(jì)算孔隙率

式中ν1為酒精溶液的初始體積，ν2為置入材料24 h后的酒精溶液體積，r,h為圓柱材料的半徑和高。將試樣材料切成直徑為?8.5 mm×(10±2 mm)的圓柱形，至少3個(gè)平行樣品被測(cè)量。

支架的形貌采用掃面電鏡(TM3030，日立高新技術(shù)公司)進(jìn)行觀察。孔徑分布根據(jù)斷面的SEM圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Nano Measurer軟件進(jìn)行斷面孔直徑測(cè)量和統(tǒng)計(jì)之后進(jìn)行非線性擬合，每組樣品至少3個(gè)平行樣品不同位置的斷面SEM圖被統(tǒng)計(jì)，每個(gè)樣品至少300個(gè)孔。

材料的壓縮性能采用萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)(AG-1，日本津島公司)在室溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。樣品切割成?8.5 mm×5 mm的圓柱，每組至少3個(gè)平行樣品。壓縮速率5 mm/min至試樣高度的80%，壓縮強(qiáng)度取應(yīng)力-應(yīng)變曲線的80%處的強(qiáng)度。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將支架切割成?15 mm×(1 mm±0.5 mm)規(guī)格，60Co滅菌后置于24孔板內(nèi)。細(xì)胞采用MC3T3-E1前成骨細(xì)胞，細(xì)胞接種密度1×106個(gè)/mL，分別培養(yǎng)至1，3和5 d時(shí)，進(jìn)行CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度，每組3個(gè)平行樣。復(fù)合培養(yǎng)3 d后樣品經(jīng)固定，梯度脫水干燥后，SEM觀察形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 支架材料的顯微結(jié)構(gòu)

圖2是采用不同溶劑比制備的PLLA多孔支架的SEM圖；圖3是對(duì)應(yīng)的孔徑分布圖。不同的溶劑比對(duì)支架的形貌結(jié)構(gòu)有十分顯著的影響。90/10支架形成了類纖維狀結(jié)構(gòu)，孔的大小在10 μm以下(如圖3(a))；在溶劑比為87/13時(shí)，形成了顯著的分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)，小孔在10 μm以下，大孔孔徑則高達(dá)300 μm，連通性好。小孔在大孔的孔壁上形成。隨著水比例的進(jìn)一步增大(83/17)，形成了規(guī)整的微米級(jí)孔結(jié)構(gòu)，孔徑為20～30 μm，孔壁多為片層狀。

圖2 不同溶劑比的PLLA支架形貌圖，1,4-二氧六環(huán)/水(v/v)

圖3 不同溶劑比的PLLA支架孔徑分布曲線，1,4-二氧六環(huán)/水(v/v)

Fig 3 Pores distribution of PLLA scaffolds according to the ratio of 1, 4-dioxane/water (v/v)

在稀溶液中，高分子鏈?zhǔn)腔ハ喾蛛x的，非溶劑(水)比例的增大相對(duì)增大了聚合物的濃度，孤立的高分子鏈相互靠近，互相穿插交疊，高分子鏈的互相纏繞產(chǎn)生了富聚合物相和富溶劑相。冷凍干燥過程中，溶劑相揮發(fā)形成多孔結(jié)構(gòu)。因此,孔的形態(tài)大小與相分離過程密切相關(guān)。在溶劑比較高的狀態(tài)下，相分離區(qū)域較小，親溶劑的高分子鏈易形成圖2(a)的類似纖維的結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[9]。隨著溶劑中水比例的提高，相分離驅(qū)動(dòng)力大，相分離過程進(jìn)行的范圍寬，易形成范圍較大的富溶劑區(qū)域。在冷凍干燥后形成大孔結(jié)構(gòu)(如圖2(b)所示)。在降溫過程中富溶劑相中的溶劑還會(huì)經(jīng)歷二次相分離，生成了大孔孔壁上的微孔結(jié)構(gòu)，最后形成了大孔嵌套小孔的分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)[10]。隨著溶劑中水比例的進(jìn)一步提高，相分離驅(qū)動(dòng)力又減小，富溶劑相中的高分子聚集，形成以圖2(c)所示的多孔結(jié)構(gòu)。

按照這種方法制備的支架材料的孔隙率接近90%(表1)，隨著溶劑比的降低，孔隙率略有下降。

表1 PLLA支架的孔隙率

2.2 粗化時(shí)間對(duì)支架微觀形貌的影響

粗化時(shí)間是調(diào)節(jié)支架微觀形貌的工藝因素重要依據(jù)。圖4是在不同粗化時(shí)間下制備的分級(jí)多孔支架的SEM圖。可以看出，隨著粗化時(shí)間的增加，PLLA支架材料的大孔孔徑在一定程度上有所增加。在粗化時(shí)間為30 min時(shí)，材料的孔徑為150 μm；粗化時(shí)間為1 h時(shí)，孔徑可達(dá)300 μm(圖2(b))。這是因?yàn)殡S著粗化過程的延長(zhǎng)，高聚物富相的高分子鏈能夠充分地相互結(jié)合成核長(zhǎng)大，從而增大了相分離的驅(qū)動(dòng)作用，同時(shí)在攪拌過程中形成的高分子貧相小液滴，在粗化過程中為了減小表面張力而聚集，也為形成大孔提供了條件。但是從圖5可以看出，當(dāng)粗化時(shí)間達(dá)到一定值(>1 h)，支架的孔徑幾乎上沒有什么變化。

圖4 不同粗化時(shí)間的PLLA支架形貌圖 ，1,4-二氧六環(huán)/水：87/13(v/v)

Fig 4 SEM images of PLLA scaffolds prepared from 1,4-dioxane/water (87/13) (v/v) system with different coarsening time

圖5 不同粗化時(shí)間的PLLA支架孔徑分布曲線，1,4-二氧六環(huán)/水：87/13(v/v)

Fig 5 Pore size distribution of PLLA scaffolds prepared from 1,4-dioxane/water (87/13) (v/v) system with different coarsening time

2.3 支架材料的力學(xué)性能

圖6不同溶劑比的PLLA支架的力學(xué)性能。

圖6 不同溶劑比的PLLA支架的力學(xué)性能,粗化時(shí)間：1 h

Fig 6 Compressive strength of PLLA scaffolds prepared from 1, 4-dioxane/water system, coarsening time: 1 h

如圖6所示，支架材料的壓縮強(qiáng)度隨溶劑配比降低和濃度增大而增大,這是因?yàn)椴牧峡紫堵孰S溶劑配比的增大而減小(表1所示)。需要注意的是，當(dāng)溶劑比為87/13，雖然材料的大孔孔徑很大，但是機(jī)械強(qiáng)度和模量并沒有顯著下降，故具有分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)沒有導(dǎo)致支架力學(xué)性能的下降。

2.4 支架材料的體外細(xì)胞培養(yǎng)

不同支架的細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)的CCK-8的檢測(cè)結(jié)果見表2和圖8。

表2 PLLA支架的細(xì)胞粘附率,粗化時(shí)間：1 h

Table 2 Adhesion rate of PLLA scaffolds, Coarsening time:1 h

1,4-二氧六環(huán)/水:(v/v)粗化時(shí)間粘附率/%90∶101h85.287∶131h71.083∶171h90.987∶131min83.287∶1310min79.487∶1330min76.2

具有單一孔徑形貌的支架(溶劑比為90/10、83/17)的細(xì)胞粘附率要大于具有分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)的支架(溶劑比為87/13)；但是分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)的支架上細(xì)胞增殖明顯高于另外兩組。這是因?yàn)殡p孔支架的大孔孔徑較大，在細(xì)胞植入時(shí)，會(huì)有部分細(xì)胞直接滲透，穿過支架，而未被粘附。材料的孔徑以及孔隙率和細(xì)胞的粘附有一定的關(guān)系，支架的微孔使表面的粗糙度增大，利于細(xì)胞粘附，大孔則利于細(xì)胞長(zhǎng)入支架，從而實(shí)現(xiàn)組織的三維空間重建和再生修復(fù)。

圖7為細(xì)胞與支架體外共培養(yǎng)3 d的SEM圖。可明顯看出細(xì)胞粘附在支架的微孔上，并且伸入大孔內(nèi)部生長(zhǎng)，說明細(xì)胞可穿入支架材料內(nèi)部增殖生長(zhǎng)。

圖8為PLLA支架MC3T3-E1細(xì)胞體外培養(yǎng)的CCK-8實(shí)驗(yàn)，粗化時(shí)間為1 h。

圖7 體外培養(yǎng)3 d的MC3T3-E1形貌圖,粗化時(shí)間：1 h

Fig 7 SEM images of MC3T3-E1 in vitro co-culture with the scaffolds for 3 days: 1,4-dixoane/water: 87/13 (v/v), Coarsening time:1 h

圖8 PLLA支架MC3T3-E1細(xì)胞體外培養(yǎng)的CCK-8實(shí)驗(yàn)，粗化時(shí)間：1 h

Fig 8 CCK-8 assay of cell viability from MC3T3-E1 cultured on PLLA scaffolds, Coarsening time:1 h

3 結(jié) 論

用熱致相分離法制備了分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)的PLLA支架，大孔孔徑可達(dá)300 μm，連通性強(qiáng)；小孔10 μm以下，鑲嵌于大孔孔壁。研究表明，分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)的形成與體系的二次相分離過程相關(guān)。這種分級(jí)多孔PLLA支架具有良好的力學(xué)性能，細(xì)胞能夠長(zhǎng)入支架內(nèi)部，利于組織的再生和修復(fù)。

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Fabrication of PLLA scaffolds with hierarchical porous structure

BO Dongying1, GUO Zhenzhao1, LI Hong1, LI Qiyan2, ZHOU Changren1, ZHAO Yaowu3

(1. Department of Materials Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China;2. Department of Periodontology and Implant Dentistry, The First People’s Hospital of Yunnan Province/Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology, Kunming 650032, China;3. Department of Stomatology of Medical College, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

PLLA scaffolds with hierarchical porous structure were fabricated via a thermal induced phase separation in a 1,4-dioxane/water system. The effects of coarsening and the ratio of solvent/non-solvent on scaffold structure and properties were studied. Results indicated that the ratio of solvent/non-solvent affected the morphology of scaffolds. The scaffolds with interconnected and hierarchical porous structure presented macropores up to 300 μm and micropores below 10 μm embeded in the wall of macropores, when the ratio of 87/13 (1,4-dioxane/water) was applied via coarsening for 1h. The macropore size increased with the extension of the coarsening time. Cell culture results showed that the hierarchical scaffolds were beneficial to the cell’s ingrowth and cell proliferation.

PLLA; TIPS;hierarchical; scaffold

1001-9731(2016)04-04210-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31571008，81171459，81160134)；廣東省醫(yī)學(xué)基金資助項(xiàng)目(A2013334)

2015-10-15

2015-12-10 通訊作者：李 紅，E-mail: tlihong@jnu.edu.cn

薄冬營(yíng) (1990-)，女，河南鶴壁人，碩士，師承李紅教授，從事生物醫(yī)用材料研究。

R318.08

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.04.043