急性出血壞死性胰腺炎大鼠血清二胺氧化酶水平變化及意義

蘭濤,崔乃強(qiáng)

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,天津300193;2滄州市人民醫(yī)院;3天津市南開醫(yī)院)

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急性出血壞死性胰腺炎大鼠血清二胺氧化酶水平變化及意義

蘭濤1,2,崔乃強(qiáng)3

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,天津300193;2滄州市人民醫(yī)院;3天津市南開醫(yī)院)

目的 觀察急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)大鼠血清二胺氧化酶(DAO)水平變化，并探討其意義。方法 選取60只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組和AHNP組各30只。AHNP 組膽胰管逆行注射3.5%牛磺膽酸鈉建立 AHNP 動(dòng)物模型，假手術(shù)組以同樣方法注射生理鹽水。各組大鼠分別于造模后6、12、24 h取腹主動(dòng)脈血，用ELISA法檢測(cè)血清DAO，取末端回腸組織行病理學(xué)觀察和回腸黏膜損傷Chiu′s評(píng)分。結(jié)果 假手術(shù)組造模后各時(shí)點(diǎn)血清DAO差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AHNP組造模后隨時(shí)間延長血清DAO水平逐漸升高，均較同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組高，P均<0.05。肉眼及光鏡下觀察假手術(shù)組末端回腸組織無明顯異常，AHNP組造模后腸黏膜損傷程度進(jìn)行性加重。假手術(shù)組造模后各時(shí)點(diǎn)腸黏膜 Chiu′s評(píng)分均為0分；AHNP組造模后6、12、24 h腸黏膜Chiu′s評(píng)分分別為(2.20±0.43)、(3.14±0.36)、(4.19±0.52)分，P均<0.05。AHNP組造模后 6、12、24 h血清DAO與回腸黏膜Chiu′s評(píng)分均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.639、0.929、0.726，P均<0.05。結(jié)論 AHNP大鼠血清DAO水平升高，外周血清DAO水平變化可間接反映腸黏膜損傷程度。

急性出血壞死性胰腺炎；腸黏膜屏障；二胺氧化酶；Chiu′s評(píng)分

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種臨床上常見的急腹癥，發(fā)病急驟，進(jìn)展迅速，病死率高。SAP可早期導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，導(dǎo)致腸黏膜損傷和腸屏障功能障礙,繼發(fā)感染和多器官功能障礙(MODS)[1，2]，但其具體機(jī)制不明。急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)是SAP的一種常見類型。2015年5～8月，我們觀察了AHNP大鼠血清二胺氧化酶(DAO)水平變化及腸黏膜損傷情況，并分析二者的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(250±50)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。牛磺膽酸鈉為美國Sigma公司產(chǎn)品；大鼠血清DAO檢測(cè)ELISA試劑盒為美國UCL公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)為美國Beckman 公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物分組及AHNP模型建立 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組和AHNP組，每組30只。AHNP組采用逆行膽胰管注射法制備AHNP模型[3]。大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后固定于手術(shù)臺(tái)，備皮，做長約2 cm 腹部正中切口入腹。找到十二指腸乳頭并穿刺乳頭對(duì)側(cè)十二指腸腸壁，用24 號(hào)靜脈留置針逆行插入膽胰管0.5 cm；向膽胰管內(nèi)注入3.5%牛磺膽酸鈉1 mL/kg，速度為0.15 mL/min。假手術(shù)組以同樣方法給予生理鹽水注射。縫扎十二指腸穿刺口，關(guān)腹，將動(dòng)物置于清潔、通風(fēng)的動(dòng)物室內(nèi)觀察。

1.3 血清DAO檢測(cè)方法 造模后6、12、24 h取兩組大鼠腹主動(dòng)脈血，3 000 r/min離心10 min分離血清,用ELISA法檢測(cè)血清DAO，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 腸黏膜病理觀察方法 造模后6、12、24 h各處死10只大鼠，取末端回腸組織。常規(guī)固定、包埋、連續(xù)切片，HE染色。肉眼及光學(xué)顯微鏡下觀察小腸組織病理學(xué)變化，光鏡觀察黏膜損傷程度并行Chiu′s評(píng)分。腸黏膜正常評(píng)0分；絨毛頂端上皮下間隙增寬伴毛細(xì)血管充血評(píng)1分；上皮下間隙進(jìn)一步增寬伴隨上皮層與固有膜分離評(píng)2分；大片上皮層從絨毛兩邊分離并有少量絨毛脫落評(píng)3分；大片絨毛脫落后固有膜裸露評(píng)4分；固有膜被消化、分解、缺血改變和潰瘍形成評(píng)5分。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠血清DAO比較 假手術(shù)組造模后各時(shí)點(diǎn)血清DAO差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AHNP組造模后6、12、24 h血清DAO水平逐漸升高，P均<0.05；AHNP組血清DAO水平均較同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組高，P均<0.05。見表1。

表1 兩組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清 DAO 比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與同組造模后6 h比較，#P<0.05；與同組造模后12 h比較，△P<0.05。

2.2 兩組末端回腸組織病理學(xué)變化比較 肉眼觀察假手術(shù)組末端回腸組織肉眼觀察無明顯異常。AHNP組造模后6 h末端回腸組織充血水腫，可見散在點(diǎn)狀出血；造模后12 h末端回腸組織充血水腫明顯加重，伴片狀出血及散在黑褐色壞死；造模后24 h末端回腸組織充血水腫進(jìn)一步加重，大片出血及壞死，并有散在皂化斑。光鏡下觀察假手術(shù)組腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)完整，上皮呈高柱狀，間質(zhì)無水腫、無中性粒細(xì)胞浸潤。AHNP組造模后6、12、24 h各回腸黏膜損傷程度進(jìn)行性加重，可見回腸間質(zhì)水腫、散在出血，腸絨毛增粗，高度變短，黏膜厚度變薄，黏膜腺體減少排列稀疏，血管、淋巴管擴(kuò)張，大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤。假手術(shù)組造模后各時(shí)點(diǎn)腸黏膜Chiu′s評(píng)分均為0分。AHNP組造模后6、12、24 h腸黏膜Chiu′s評(píng)分分別為(2.20±0.43)、(3.14±0.36)、(4.19±0.52)分，P均<0.05。

2.3 AHNP組各時(shí)間血清DAO與回腸黏膜Chiu′s評(píng)分的關(guān)系 AHNP 組造模后6、12、24 h血清DAO水平與回腸黏膜 Chiu′s評(píng)分均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.639、0.929、0.726，P均<0.05。

3 討論

SAP是臨床常見的急腹癥之一，它不僅引起胰腺本身及胰周的炎性腫脹、滲出和壞死，而且常導(dǎo)致全身重要臟器功能的損害[4]，是一種發(fā)病急、進(jìn)展快、并發(fā)癥多、病死率高的嚴(yán)重疾病[5]。SAP時(shí)常并發(fā)MODS，成為SAP的主要死亡原因[6]。AHNP是SAP的一種常見類型。AHNP大鼠腸黏膜血流量減少，腸上皮細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞間緊密連接損傷，腸黏膜通透性增加，腸屏障功能障礙，細(xì)菌易位，出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥和多器官功能損傷，進(jìn)一步加重腸道屏障功能障礙，最后出現(xiàn)腸功能衰竭[7]。

DAO是存在于哺乳動(dòng)物小腸的黏膜或纖毛上皮細(xì)胞中，由脫氨酶激活具有催化二胺氧化功能的細(xì)胞內(nèi)酶[9]。其在肝臟內(nèi)進(jìn)行代謝，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，影響傳導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，對(duì)腸黏膜具有保護(hù)作用。正常情況下，由于腸黏膜屏障的存在，腸黏膜組織細(xì)胞中的大分子物質(zhì)不能進(jìn)入外周血循環(huán)，外周血中DAO水平很低。小腸黏膜屏障功能衰竭時(shí)或腸黏膜細(xì)胞壞死時(shí)，腸黏膜屏障功能受損，小腸黏膜組織內(nèi)DAO水平降低，血清和腸腔內(nèi)DAO水平升高[10～14]。本研究使用3.5%牛磺膽酸鈉溶液逆行注射大鼠胰膽管制備大鼠AHNP模型，觀察AHNP發(fā)生后隨著病程進(jìn)展外周血DAO及末端回腸病理學(xué)表現(xiàn)的變化，研究AHNP患者發(fā)生腸黏膜屏障功能障礙的機(jī)制。結(jié)果顯示，AHNP大鼠造模后6 h即出現(xiàn)腸壁充血、水腫及腸黏膜萎縮等損傷性改變，此時(shí)血清DAO水平亦明顯升高，推測(cè)腸黏膜受損后DAO即從細(xì)胞內(nèi)釋放入血，導(dǎo)致上述表現(xiàn)；造模后12、24 h腸黏膜損傷進(jìn)一步加重，血清DAO進(jìn)一步升高，腸壁出現(xiàn)部分壞死，黏膜萎縮、小腸絨毛變短，術(shù)后24 h血清DAO達(dá)到高峰。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，評(píng)估腸黏膜損傷的Chiu′s評(píng)分逐漸升高，提示AHNP大鼠腸黏膜損傷程度和血清DAO水平變化是同步的。本研究結(jié)果顯示，AHNP組造模后6、12、24 h大鼠血清DAO與回腸黏膜Chiu′s評(píng)分均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.639、0.929、0.726，亦支持上述觀點(diǎn)。

綜上所述，AHNP大鼠血清DAO水平升高，且與大鼠回腸黏膜損傷程度呈正相關(guān)；血清DAO檢測(cè)具有方法簡便、快捷、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且為無創(chuàng)檢查。因此，血清DAO可作為生物學(xué)標(biāo)志用來反映AHNP大鼠腸屏障功能損傷狀況。

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