芽胞桿菌來源沙奎那維的檢測與分析

朱育菁，劉 波，鄭梅霞,陳 崢

(福建省農業科學院農業生物資源研究所, 福建 福州 350003)

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芽胞桿菌來源沙奎那維的檢測與分析

朱育菁，劉 波*，鄭梅霞,陳 崢

(福建省農業科學院農業生物資源研究所, 福建 福州 350003)

對阿氏芽胞桿菌BacillusaryabhattaiFJAT-14220發酵液中沙奎那維成分進行分析與檢測。采用高效液相四級桿飛行時間質譜(liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry)分析阿氏芽胞桿菌FJAT-14220發酵液中胞外代謝物的成分。為獲得代謝物的信息，首先采用MassHunter軟件對原始數據進行分子特征提取，再通過Metlin數據庫檢索比對。在阿氏芽胞桿菌FJAT-14220發酵液中檢測到883種代謝物，通過Metlin譜庫搜索獲得初步鑒定的有148種。其中，發現了具有生物活性的物質沙奎那維Saquinavir，其匹配得分達到93.08，占發酵液總代謝物相對含量的1.73%，保留時間為2.719 1 min，精確質量數為670.383 7。沙奎那維的發現為阿氏芽胞桿菌來源的多醚類抗生素的開發與利用提供理論依據。

液相四級桿飛行時間質譜；阿氏芽胞桿菌；胞外代謝物；沙奎那維

沙奎那維(Saquinavir)，CAS:127779-20-8。化學名稱：N1-[(1S,2R)-3-[(3S,4aS,8aS)-3-[(叔丁基氨基)甲酰]八氫-2(1H)-異喹啉基]-2-羥基-1-芐基丙基]-2-[(2-喹啉甲酰)氨基]-丁二酰胺；中文名稱：沙奎那韋；沙喹那韋；沙奎那維；雙喹納韋；賽科納瓦D9；是1995年美國食品藥品監督管理局(FDA)正式批準的第一個治療艾滋病的蛋白酶抑制劑。沙奎那維具有高效、高選擇性的特點，在急性感染的淋巴樣肝細胞中對HIV-1、HIV-2及對齊多夫定產生耐藥性的HIV-1的強大的抗病毒活性[1-2]，并與其他抗逆轉錄病毒藥物如利托那韋[3]有協同作用[4]，與中草藥也存在相互作用[5]，而且能抑制惡性瘧原蟲的生長[6]。之前，沙奎那維都是采用化學合成的方式生產，未見該化合物產生于微生物的報道。

阿氏芽胞桿菌Bacillusaryabhattai在自然界中分布廣泛，有報道Shivaji等[7]從高層空氣中，Wen等[8]從深海水中，Lee等[9]從土壤中分離到阿氏芽胞桿菌。阿氏芽胞桿菌也能產生多種多樣的生物活性物質，能降解碳水化合物和木質纖維素[8]；促進意大利蒼耳的生長[9]；且其能產胞外L-左旋天冬酰胺酶[10]，具有抗腫瘤作用[11]。

本研究利用液相色譜-四級桿飛行時間質譜(liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry，LC-QTOF-MS)技術在阿氏芽胞桿菌發酵液中發現了活性成分沙奎那維，即首次在芽胞桿菌中發現沙奎那維。這為沙奎那維的來源提供新途徑，并為進一步探索阿氏芽胞桿菌的生理生化特征提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：阿氏芽胞桿菌 FJAT-14220，現保存在福建省農業科學院農業生物資源研究所，引進自德國菌種保存中心(DSMZ)。

培養基：以NA培養基為活化培養基；以購自美國BD公司的TSB培養基為種子培養基和發酵培養。

試劑：色譜純methanol(乙醇)、色譜純acetonitrile(乙腈)均購自美國JT Baker公司，色譜純ammonium acetate(乙酸銨)購自上海安譜科學儀器有限公司。

儀器：美國安捷倫科技公司的液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用儀Agilent 1260/6520；瑞士梅特勒·托利多儀器有限公司的電子天平METTLER TOLEDO AL104；上海智城分析儀器有限公司的恒溫培養震蕩器智城ZHWY-2102C；德國賽托利斯公司的pH計Sartorius PB-10。

1.2 試驗方法

發酵液制備：采用平板劃線法活化阿氏芽胞桿菌FJAT-14220菌株，培養條件為：培養基為TSB培養基；轉速為170 r·min-1；溫度為30℃；培養時間為48 h。

樣品制備方法參照文獻[12]：用甲醇提取阿氏芽胞桿菌發酵液中的活性物質。

色譜質譜條件：Zorbax SB-Aq C18 2.1×100 mm，色譜柱1.8 μm；柱溫30℃；進樣量2 μL；乙酸銨水溶液 A=10 mmol·L-1，流動相B=甲醇；梯度程序0 min B= 5%、8 min B= 5%、38 min B= 95%、45 min B= 95%、47 min B= 5%、55 min B= 5%；流速0.3 mL·min-1；MS運行條件：離子模式為負離子模式；干燥氣N2的溫度350℃；干燥氣流速5 L·min-1；Nebulizer 30 psig；Skimmer 65.0 V；Fragmentor 100 V；Capillary voltage 3 500 V；Mass range 100～3 000 m·z-1。

2 結果與分析

2.1 阿氏芽胞桿菌FJAT-14220發酵液物質成分分離

阿氏芽胞桿菌FJAT-14220發酵液LC-MS總離子流圖如圖1所示，發酵液中共有883種物質，其中經數據庫初步鑒定的有148種，匹配得分高于80的13種物質詳見表1。含量大于1%的有3種：(1)N,N-二乙基甘氨酸(N,N-Diethylglycine)，相對含量為1.03%；(2)4-羥脯氨酸(4-Oxoproline)，相對含量為1.11%；(3)沙奎那維(Saquinavir)，相對含量為1.73%。

序號化合物名稱分子式匹配得分分子量質荷比保留時間/min相對含量/%CAS號KEGG號16?hydroxycaproicacidC6H12O399071320785131071220668045-C061032N，N?DiethylglycineC6H13NO298921310944130087214177103-C166473GangliosideGD2(d18：1/14：0)C75H131N3O349818161786071616851324205050--4Oleicacid(d2)C18H32D2O2972728426782832606456347069--5SaquinavirC38H50N6O593086703837669376727191173127779?20?8C072436ThreonolactoneC4H6O4873511802671170194144204621730?93?8-74?OxoprolineC5H7NO38716129042312803513205111-C0187782，4?dihydroxy?butanoicacidC4H8O48599120042211903513204009--9HedamycinC41H50N2O118570746338274533093336403111048?97?8C1575910ArbekacinC22H44N6O10856755231025513032018905451025?85?5-11N?dodecanoyl?L?Homoserinelactone?3?hydrazone?biotinC26H43N5O5S84265372984536291127215007--12CypendazoleC16H19N5O38179329149332814251494900828559?00?4C18917132alpha?Fluoro?17beta?hydroxyandrost?4?en?3?oneC19H27FO2815230619893411675404596004-C15276

2.2 阿氏芽胞桿菌FJAT-14220發酵液中沙奎那維成分分析

阿氏芽胞桿菌FJAT-14220發酵液中沙奎那維的色譜圖見圖2、3，可知沙奎那維物質的保留時間為2.719 1 min，該物質峰的相對豐度為1.107×105。沙奎那維的同位素峰圖(圖4)和質譜圖(圖5)提供了沙奎那維的同位素峰的相對強度及間距。根據在負離子模式(本試驗采用的電離方法)下能產生不同的分子離子(如[M+X]-、[M-H]-等，X為溶劑或緩沖劑陰離子)，判斷669.376 7峰為[M-H]-準分子離子峰，測得精確即分子質量為670.383 7，而實際精確分子質量為670.384 3，質量偏差為-0.895×10-6。綜合分子式、同位素峰和匹配值(Metlin庫)，將該成分基本確定為沙奎那維。

3 討論與結論

阿氏芽胞桿菌發酵液中的活性物質通過LC-QTOF-MS技術進行分析，其中相對含量大于1%的化合物，可分為兩類：(1)氨基酸：4-羥脯氨酸；N,N-二乙基甘氨酸；(2)蛋白酶抑制劑：沙奎那維。

沙奎那維是一種特異性的人類免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶抑制劑，這使對艾滋病的治療有突破性進展，因為沙奎那維能防止病毒母體蛋白分裂成新的HIV感染細胞和病毒復制的功能蛋白[13]。可通過納米技術[14]、輔料聚氧乙烯蓖麻油[15]等增強沙奎那維的細胞吸收、運輸和口服吸收。沙奎那維主要還是通過化學合成，如趙秀雅[16]先合成2個重要中間體N-(2-喹啉基羰基)-L-天冬酰胺、氯醇，再合成中間體(2S,3S)-N-(N-2′-喹啉甲酰基-(S)-天冬酰胺)-4-苯基-3-氨基-1-氯-2-丁醇，最后與DHIQ耦合制備沙奎那韋； 李榮梅[17]以中間體氯醇、喹啉甲酸、天冬酰胺和DHIQ合成了HIV蛋白酶抑制劑沙奎那韋；閆建輝等[18]采用平行-連續發合成沙奎那維。

目前抗HIV治療費用居高不下的主要原因是由于沙奎那維的藥物合成工藝難度大[18]。而本課題組首次從芽胞桿菌的發酵液中發現了沙奎那維，說明阿氏芽胞桿菌能夠產生活性次生代謝物，這將為多醚類抗生素(阿氏芽胞桿菌來源)的開發與利用提供理論依據，值得進一步開發應用。

[1]ANADOL E, KAISER R, VERHEYEN J, et al. Transmission of human immunodeficiency virus I drug resistance-a case report. What are the clinical implications?[J]. European Journal of Medical Research. 2010, 15(5):225-230.

[2]PRIBIS J P, AL-ABED Y, YANG H, et al. The HIV protease inhibitor saquinavir inhibits HMGB1 driven inflammation by targeting the interaction of cathepsin V with TLR4/MyD88[J]. Molecular Medicine, 2015, 21:749-757.

[3]BOFFITO M, JACKSON A, POZNIAK A, et al. Effect of a modified saquinavir/ritonavir dosing regimen with lower dose lead-in phase on QTc interval, pharmacokinetics, antiviral activity and safety in treatment-na ve HIV-1-infected patients[J]. Drugs in R & D, 2015, 15(1):141-153.

[4]包雅琳. 沙奎那韋的臨床藥理學和藥物效應[J]. 國際藥學研究雜志, 1999, 26(1):17-20.

[5]余細勇. 中草藥與西藥相互作用的機制探討[C]//第三屆世界中西醫結合大會論文集.廣州: 中國中西醫結合學會, 2007.

[6]MARTIN R E, BUTTERWORTH A S, GARDINER D L, et al. Saquinavir inhibits the malaria parasite's chloroquine resistance transporter[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2012, 56(5):2283-2289.

[7]SHIVAGI S, CHATURVEDI P, BEGUM Z, et al.Janibacterhoyleisp. nov.,Bacillusisronensissp. nov. andBacillusaryabhattaisp. nov., isolated from cryotubes used for collecting air from the upper atmosphere[J]. International Jouranal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59(12):2977-2986.

[8]WEN J, REN C, HUANG N, et al. Draft genome of bagasse-degrading bacteriaBacillusaryabhattaiGZ03 from deep sea water[J]. Marine Genomics, 2015, 19:13-14.

[9]LEE S, KA J O, SONG H G. Growth promotion ofXanthiumitalicumby application of rhizobacterial isolates ofBacillusaryabhattaiin microcosm soil[J]. Journal of Microbiology, 2012, 50(1):45-49.

[10]SINGH Y, SRIVASTAV SK. Statistical and evolutionary optimization for enhanced production of an antileukemic enzyme, L-asparaginase, in a protease-deficientBacillusaryabhattaiITBHU02 isolated from the soil contaminated with hospital waste[J]. Indian Journal of Experimental Biology, 2013, 51(4):322-335.

[11]SJINGH Y, GUNDAMPATI R K, Jagannadham M V, et al. Extracellular L-asparaginase from a protease-deficientBacillusaryabhattaiITBHU02: purification, biochemical characterization, and evaluation of antineoplastic activity in vitro[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 171(7):1759-1774.

[12]朱育菁, 劉波, 鄭梅霞, 等. 芽胞桿菌來源尼日利亞菌素的檢測與分析[J]. 福建農業學報, 2015, 30(10):948-953.

[13]劉曉. 天然HIV蛋白酶抑制劑的分離與苯并呋喃類化合物的合成及活性研究[D]. 北京: 協和醫學院, 2011.

[14]HE Y, XIA D N, LI Q X, et al. Enhancement of cellular uptake, transport and oral absorption of protease inhibitor saquinavir by nanocrystal formulation[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2015, 36(9):1151-1160.

[15]TOMARU A, TAKEDA-MORISHITA M, MAEDA K, et al. Effects of Cremophor EL on the absorption of orally administered saquinavir and fexofenadine in healthy subjects[J]. Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 2015, 30(3):221-226.

[16]趙秀雅. HIV蛋白酶抑制劑沙奎那韋的合成與分析[D]. 上海: 華東理工大學, 2006.

[17]李榮梅. HIV蛋白酶抑制劑沙奎那韋的合成與結構分析[D]. 上海: 華東理工大學, 2006.

[18]閆建輝, 姚國偉, 楊麗娜, 等. 平行-連續法合成沙奎那韋[J]. 精細化工, 2007, 24(1):76-79, 90.

(責任編輯：林海清)

Formation and Determination of Saquinavir from Liquid Fermentation ofBacillusaryabhattaiFJAT-14220

ZHU Yu-jing, LIU Bo*, ZHENG Mei-xia, CHEN Zheng

(AriculturalBio-resourcesResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou，Fujian350003，China)

Extracellular metabolites ofBacillusaryabhattaiFJAT-14220 during fermentation were analyzed with liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Saquinavir in the fermentation broth was targeted for the study. Molecular feature extraction and database retrieval were applied to access the information on the metabolites ofB.aryabhattai. A total of 883 compounds were detected with 148 of them identified. The matching score of saquinavir was 93.08 with a relative concentration of 1.73%. Its retention time was 2.7191 min; and, accurate mass, 670.3837. The results could be the foundation for future development and utilization of saquinavir byB.aryabhattaifermentation.

liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry;Bacillusaryabhattai; extracellular metabolites; saquinavir

2015-11-11初稿；2016-04-29修改稿

朱育菁(1972-)，女，博士，研究員，主要從事農業生物藥物與生物防治的研究(E-mail: zyjingfz@163.com)

*通訊作者：劉波(1957-)，男，博士，研究員，主要從事微生物生物技術及農業生物藥物研究(E-mail：fzliubo@163.com)

公益性行業(農業)科研專項 (201303094)；福建省農業科學院杰出青年人才基金項目(2014JQ-2)；福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項(2015R1018-11)

Q 939.9

A

1008-0384(2016)09-981-05

朱育菁，劉波，鄭梅霞,等.芽胞桿菌來源沙奎那維的檢測與分析[J].福建農業學報，2016，31(9)：981-985.

ZHU Y-J，LIU B，ZHENG M-X，et al.Formation and Determination of Saquinavir from Liquid Fermentation ofBacillusaryabhattaiFJAT-14220[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(9)：981-985.