HPLC測定十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸含量

武琳，楊光，杜菁，劉瑩

北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，北京 100079

HPLC測定十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸含量

武琳，楊光，杜菁，劉瑩

北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，北京 100079

目的建立十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸的含量測定方法。方法采用高效液相色譜法測定十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸的含量，采用Zorbax SB C18色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-2.5%醋酸（65∶35)，流速為0.8 mL/min，檢測波長為254 nm。結果甘草酸在0.180 3～3.605 4 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r＝1），十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸平均回收率分別為99.85%（n＝6）、100.70%（n＝6）、100.81%（n＝6）。結論本試驗所建立的方法專屬性強、簡便，可用于含甘草成分的產品中甘草酸的檢測。

十全大補丸；補中益氣丸；銀翹解毒片；甘草酸；高效液相色譜法

十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片為北京同仁堂科技發展股份有限公司出口至歐洲某國家產品，處方中均含有甘草成分。進口方衛生署要求含甘草成分的產品應做甘草酸檢測，并規定甘草酸每日服用量不應超過100 mg。本試驗采用HPLC對十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸進行含量測定，對十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片的質量標準進行提高完善，從而有效控制制劑質量，保證出口產品質量，保證臨床療效及用藥安全。

1　儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）；METTLER TOLEDO AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司），KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率40 kHz）。

甘草酸銨對照品（供含量測定用，批號110731-200614），中國食品藥品檢定研究院；十全大補丸（批號8030953、0030631、4035575）、補中益氣丸（批號0081764、8081758、0081768）、銀翹解毒片（批號0121031、0121030、0121032），北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠；配制溶液所用試劑均為分析純，HPLC用試劑為高效液相級，水為超純水。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱為Zorbax SB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-2.5%醋酸（65∶35），流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，理論塔板數按甘草酸峰計算應不低于2000。

2.2對照品溶液的制備

取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得（甘草酸質量＝甘草酸銨質量/1.0207）[1]。

2.3供試品溶液的制備

分別取十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片適量，研細，分別取約3、0.5、0.6 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定質量，分別超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40、50、40 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，離心，分別取上清液，即得。

2.4陰性對照溶液的制備

按十全大補丸、補中益氣丸和銀翹解毒片處方中藥味比例，分別自配不含甘草的其他藥材，按其制備工藝制成陰性制劑，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5空白干擾試驗

精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10 μL，在上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結果甘草酸可與其他成分基線分離，陰性對照溶液在與甘草酸對照品相同保留時間處未顯色譜峰，故認為空白無干擾。色譜圖見圖1。

2.6線性關系考察

分別精密吸取0.184 mg/mL甘草酸銨對照品溶液（折合甘草酸濃度為0.180 3 mg/mL）1、4、7、10、13、16、20 μL，注入液相色譜儀，測得峰面積，以對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y＝942.3X－4.955（r＝1），結果表明，甘草酸在0.180 3～3.605 4 μg范圍內，進樣量與峰面積呈良好的線性關系，可用外標一點法計算。

2.7精密度試驗

分別取十全大補丸、補中益氣丸和銀翹解毒片同一供試品溶液，分別連續進樣6次，計算得甘草酸峰面積的RSD分別為0.69%、1.03%和0.46%，表明儀器精密度良好。

2.8穩定性試驗

分別精密吸取十全大補丸、補中益氣丸和銀翹解毒片同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定。結果十全大補丸中甘草酸平均含量為0.75 mg/g，RSD＝1.48%；補中益氣丸中甘草酸平均含量為3.35 mg/g，RSD＝0.72%；銀翹解毒片中甘草酸平均含量為3.20 mg/g，RSD＝1.20%。表明供試品溶液在24 h內穩定。

圖1　十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸HPLC圖

2.9重復性試驗

分別精密稱取十全大補丸同一批號（8030953）樣品6份、補中益氣丸同一批號（0081764）樣品6份、銀翹解毒片同一批號（0121031）樣品6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。結果十全大補丸中甘草酸平均含量為0.74 mg/g，RSD＝1.01%；補中益氣丸中甘草酸平均含量為3.34 mg/g，RSD＝0.98%；銀翹解毒片中甘草酸平均含量為3.17 mg/g，RSD＝0.56%。表明本方法重復性良好。

2.10加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的十全大補丸同一批號供試品（批號8030983，甘草酸含量為0.74 mg/g）約1.5 g，精密加入0.020 6 mg/mL甘草酸銨對照品溶液50 mL；精密稱取已知含量的補中益氣丸同一批號供試品（批號0081764，甘草酸含量為3.34 mg/g）約0.25 g，精密加入0.018 4 mg/mL甘草酸銨對照品溶液50 mL；精密稱取已知含量的銀翹解毒片同一批號供試品（批號0121031，甘草酸含量為3.17 mg/g）約0.3 g，精密加入0.019 2 mg/mL甘草酸銨對照品溶液50 mL。按“2.3”項下方法分別制備供試品溶液，并按上述色譜條件測定甘草酸含量。結果十全大補丸平均回收率為99.85%（n＝6），RSD＝2.49%；補中益氣丸平均回收率為100.70%（n＝6），RSD＝1.72%；銀翹解毒片平均回收率為100.81%（n＝6），RSD＝1.19%。結果見表1～表3。

表1　十全大補丸中甘草酸加樣回收率試驗

表2　補中益氣丸中甘草酸加樣回收率試驗

表3　銀翹解毒片中甘草酸加樣回收率試驗

2.11樣品含量測定

分別取十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片各3批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，每批測定3次，用外標一點法計算，結果見表4～表6。

表4　十全大補丸樣品中甘草酸含量測定結果（n＝3）

表5　補中益氣丸樣品中甘草酸含量測定結果（n＝3）

表6　銀翹解毒片樣品中甘草酸含量測定結果（n＝3）

3　討論

甘草中甘草酸的測定方法較多[2-3]，經過比較，選擇HPLC對甘草酸進行測定。本試驗參考2005年版《中國華人民共和國藥典》（一部）甘草項下收載方法[4]，同時對流動相系統進行了摸索，對乙腈-醋酸系統及甲醇-醋酸系統分別考察，發現甲醇-醋酸系統更有利于甘草酸與其他成分的分離。

十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片供試品溶液制備中，比較了超聲提取和回流提取不同的提取方式，結果超聲提取效果較好。根據甘草酸的性質，比較了70%乙醇、50%乙醇、甲醇超聲提取對甘草酸提取率的影響，結果表明70%乙醇超聲提取所得甘草酸的提取率最高。比較了超聲提取30、40、50、60 min對甘草酸提取率的影響，結果表明十全大補丸和銀翹解毒片提取40 min已基本提取完全，補中益氣丸提取50 min已基本提取完全，故確定十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片提取時間分別為40、50、40 min。比較了以70%乙醇為提取溶劑、用量為25、50、75 mL對甘草提取率的影響，結果表明，溶劑用量為50 mL時已經提取完全。

取甘草酸銨對照品，加70%乙醇溶解，注入液相色譜儀，用二極管陣列檢測器進行紫外全波長掃描（200～400 nm）。結果表明，甘草酸在254 nm附近有最大吸收峰，且樣品空白無干擾，故選擇254 nm作為檢測波長。

按進口方衛生署要求，含甘草成分的產品甘草酸每日服用量不應超過100 mg，按日服劑量折算每1 g供試品中含甘草酸的限量。十全大補丸和補中益氣丸每1 g含炙甘草以甘草酸計不得多于5.5 mg，銀翹解毒片每1 g含甘草以甘草酸計不得多于15 mg。十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片經多批次檢測所含甘草酸均未超出規定的日服用限量。

本試驗建立的十全大補丸、補中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸含量測定方法準確、靈敏、快速、專屬性強，所建立的甘草酸含量測定方法中供試品溶液制備方法操作簡便，色譜條件相同，便于今后的生產檢驗，提高工作效率，降低檢驗成本。該方法可有效控制本品質量，提高該品種的可控性，保證產品療效，提高藥品的安全性。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社,2010：80.

[2] 王玉巧,王健斌,趙一玫,等.復方止咳顆粒中甘草酸含量測定方法學研究[J].中國藥事,2001,25(2)：169-170.

[3] 吳迪,李艷,曾憲儀,等.高效液相色譜法測定安嗽膠囊中甘草酸的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,22(1)：94-96.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：化學工業出版社,2005：59.

Content Determination of Glycyrrhizic Acid in Shiquan Dabu Pills, Buzhong Yiqi Pills,Yinqiao Jiedu Tablets by HPLC

WU Lin, YANG Guang, DU Jing, LIU Ying
(Beijing Tongrentang Technologies Co. Ltd. Pharmaceutical Factory, Beijing 100079, China)

Objective To establish content determination method of glycyrrhizic acid in Shiquan Ddabu Pills, Buzhong Yiqi Pills and Yinqiao Jiedu Tablets. Methods HPLC method was used to determine the content of glycyrrhizic acid in the three preparations. Zorbax SB C18column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) was used; Methanol-2.5% Acetic acid (65∶35) was set as the mobile phase at flow rate of 0.8 mL/min; the detection wavelength was 254 nm. Results The linear range of glycyrrhizic acid was in the range of 0.180 3–3.605 4 μg (r=1). The average recovery was 99.85% (n=6) in Shiquan Dabu Pills, 100.70% (n=6) in Buzhong Yiqi Pills, and 100.81% (n=6) in Yinqiao Jiedu Tablets. Conclusion The method is specific, simple and can be used to determine glycyrrhizic acid in the products containting glycyrrhizae.

Shiquan Dabu Pills; Buzhong Yiqi Pills; Yinqiao Jiedu Tablets; glycyrrhizic acid; HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.024

R284.1

A

1005-5304(2016)12-0099-04

（2015-10-09）

（2015-10-30；編輯：陳靜）