胃癌組織Oct4表達變化及意義

郝美玲，李春輝

(承德醫學院附屬醫院，河北承德067000)

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·臨床研究·

胃癌組織Oct4表達變化及意義

郝美玲，李春輝

(承德醫學院附屬醫院，河北承德067000)

目的 探討八聚體結合蛋白4(Oct4)在胃癌發生、發展中的作用及其機制。方法 選擇60例胃癌患者手術切除的癌組織及其相應癌旁正常組織，分別應用qRT-PCR技術、Western blotting技術檢測Oct4 mRNA和蛋白表達；分析胃癌組織Oct4表達與TGF-β信號通路中TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin效應因子及患者臨床病理參數的關系。結果 胃癌組織Oct4、Smad3 mRNA和蛋白的相對表達量明顯高于癌旁正常組織(P均<0.05)，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin mRNA和蛋白的相對表達量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.05)。胃癌組織Oct4表達與TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin蛋白表達呈負相關(r分別為-0.887、-0.912、-0.879，P均<0.01)，與Smad3蛋白表達呈正相關(r=0.779，P<0.01)。胃癌組織Oct4表達變化與患者性別、年齡無關(P均>0.05)，與腫瘤組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移和漿膜浸潤有關(P均<0.05)。結論 胃癌組織Oct4高表達可促進胃癌的發生、發展，其機制可能與Oct4參與調節TGF-β信號通路、誘導細胞發生上皮間質轉化有關。

胃癌；八聚體結合蛋白4；TGF-β信號通路；上皮間質轉化

八聚體結合蛋白4(Oct4)是由Pou5F1基因編碼產生、含POU結構域的轉錄因子家族成員，可與其他轉錄因子(如Sox、FoxD3等)結合，共同作用于許多下游靶基因的啟動子或增強子，正/負調控下游靶基因的表達。近年研究發現，Oct4過表達與乳腺癌、前列腺癌和結腸癌等發生、發展和轉移有關[1，2]。已有研究證實，TGF-β家族是體內誘導上皮間質轉化(EMT)的重要原因。TGF-β信號特異性結合TGF-β受體磷酸化Smad2/Smad3復合體，Smad2/Smad3復合體與輔因子Smad4結合進入核內與靶基因特異性結合，調控特定基因的轉錄[3]。TβRⅡ、Smad2、Smad3作為TGF-β通路信號轉導過程中至關重要的響應因子，三者表達異?？梢鹦盘杺鲗М惓＃T導EMT的發生，引起E-鈣黏著蛋白(E-Cadherin)表達異常[4]。有研究發現，Oct4能通過調節EMT和細胞骨架重組等過程，抑制乳腺癌的肺轉移。但其在胃癌中的作用鮮見報道。為此，本研究探討Oct4在胃癌發生、發展中的作用及其機制?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年6月～2015年6月我院收治的胃癌患者60例，均經術后組織病理檢查明確診斷，術前均未行放療、化療和免疫治療。其中，男37例、女23例，年齡39～87歲、中位年齡56歲；TNM分期(2009年國際抗癌聯盟分期標準)：Ⅰ、Ⅱ期34例，Ⅲ、Ⅳ期26例；組織分化程度：高中分化27例，低分化33例；伴淋巴結轉移31例，伴漿膜浸潤37例。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 Oct4、TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。取胃癌組織及相應癌旁正常組織，TRIzol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并將mRNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應體系20 μL：5x gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1 μL，加RNase Free dH2O至10 μL；Prime Script RT Enzyme MixI 1 μL，RT Prime Mix 1 μL，5x prime Script Buffer 2 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。隨后對cDNA進行實時定量PCR擴增。PCR擴增體系：SYBR PrimeMIX Ex Taq Ⅱ 10 μL，Forward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye(50x) 0.4 μL，DNA masterplate 2 μL，dH2O 6 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。得出溶解曲線和擴增曲線及Ct值；以GAPDH內參作為對照，采用相對定量的2-ΔΔCt法計算Oct4、TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin mRNA的相對表達量。

1.3 Oct4及TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取凍存胃癌組織及相應癌旁正常組織100 g，冰上裂解，PMSF充分勻漿，4 ℃ 5 500 r/min離心20 min，取上清。BCA法檢測蛋白濃度合格后，加入上樣緩沖液95 ℃水浴5 min；取30 mg蛋白進行SDS-PAGE電泳(12%分離膠+5%濃縮膠)，當蛋白跑至濃縮膠與分離膠交界時，將電壓由80 mV調至120 mV，當蛋白電泳跑至分離膠底部時，停止電泳；恒流130 mA轉膜2 h，取出PVDF膜；用5%封閉液封閉2 h；孵育Oct4、TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin和GAPDH一抗2 h，置入4 ℃冰箱過夜，次日取出后復溫2 h，TBST洗膜3次，每次15 min；孵育羊抗兔抗體2 h，TBST洗膜3次，每次5 min；ECL發光液顯影。采用Quantity One V462圖像分析軟件對蛋白電泳條帶的灰度值定量分析，計算蛋白的相對表達量。蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin內參灰度值。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織Oct4及TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin表達比較 胃癌組織及癌旁正常組織Oct4 mRNA相對表達量分別為4.54±0.79、1.00±0.00，Smad3 mRNA相對表達量分別為2.92±0.46、1.00±0.00，TβRⅡ mRNA相對表達量分別為0.56±0.06、1.00±0.00，Smad2 mRNA相對表達量分別為1.63±0.21、1.00±0.00，E-Cadherin mRNA相對表達量分別為0.94±0.10、1.00±0.00，胃癌組織Oct4、Smad3 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin mRNA相對表達量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.05)。胃癌組織及癌旁正常組織Oct4蛋白相對表量分別為4.54±0.54、1.73±0.22，Smad3蛋白相對表達量分別為2.92±0.39、2.58±0.31，TβRⅡ蛋白相對表達量分別為0.56±0.07、1.22±0.10，Smad2蛋白相對表達量分別為1.63±0.25、4.39±0.56，E-Cadherin蛋白相對表達量分別為0.94±0.11、1.97±0.18。胃癌組織Oct4、Smad3蛋白相對表達量明顯高于癌旁正常組織，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin蛋白相對表達量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.05)。

2.2 胃癌組織Oct4蛋白表達與TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin蛋白表達的關系 Pearson相關分析顯示，胃癌組織Oct4蛋白表達與TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin蛋白表達呈負相關(r分別為-0.887、-0.912、-0.879，P均<0.01)，與Smad3蛋白表達呈正相關(r=0.779，P<0.01)。

2.3 胃癌組織Oct4蛋白表達與患者臨床病理參數的關系 見表1。

表1 胃癌組織Oct4蛋白表達與患者臨床病理參數的關系±s)

3 討論

有研究在人胚胎干細胞培養條件下，在人毛囊組織中發現Oct4陽性的上皮干細胞和黑色素干細胞均能自我修復和分化成多種細胞。動物試驗發現，下調Oct4表達能促進鼠神經干細胞分化[5]，異位表達Oct4基因可阻止鼠上皮祖細胞的分化，并能引起上皮細胞的異常增殖[6]。有研究還發現，胃癌、神經膠質瘤、肝癌等多種腫瘤組織中均有Oct4表達，可維持腫瘤細胞的未分化性和自我更新潛能，參與腫瘤的形成與進展。Chang等[7]研究發現，將轉染Oct3/4的鼠膀胱癌細胞株(MBT-2/Oct3/4)或轉染LacZ的鼠膀胱癌細胞株(MBT-2/LacZ)注入大鼠尾靜脈制作肺轉移動物模型，肺質量、腫瘤數目和大小明顯增加，提示Oct3/4過表達能促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。因此認為，Oct4能參與成體干細胞和多種腫瘤細胞的自我更新過程，其過表達能促進腫瘤的侵襲和轉移。

TGF-β超家族主要由8種蛋白構成整個Smad家族，通過可逆磷酸化對多種信號傳導通路進行調節，共同擔負著細胞生長、分化、凋亡等過程[8]。TβRⅡ、Smad2和Smad3作為TGF-β信號通路中的響應元件，表達異常會引起此信號通路的轉導異常[9]。

EMT是上皮細胞向間充質細胞轉化的過程，上皮細胞在該過程中失去細胞極性及與基底膜的連接等上皮表型，獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質能力等間充質表型，與腫瘤的發生、發展有關[10～12]。EMT的主要特征為細胞黏附分子(如E-Cadherin)表達減少、細胞角蛋白細胞骨架轉化為Vimentin為主的細胞骨架及形態上具有間充質細胞特征等，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的重要生物學過程。腫瘤細胞發展到一定程度即可向周圍組織浸潤和轉移，當發生EMT時，其侵襲和遷移能力更強[13]。體外實驗證實，發生EMT的腫瘤細胞較正常細胞能更快地穿過Matrige(類似體內的基底膜)[14]。細胞劃痕試驗證實，發生EMT的腫瘤細胞能更快地使劃痕愈合。研究證實，不同Smad蛋白在TGF-β誘導EMT過程中作用不同[15]。在原代培養的肝臟上皮細胞中，敲除Smad3基因能阻止EMT的發生，而敲除Smad2基因即使無TGF-β信號刺激，肝細胞也會自發出現EMT，表明smad3對EMT起促進作用，而Smad2起抑制作用[16]。

細胞發生EMT的重要標志是E-Cadherin表達減少或丟失[17]。E-Cadherin屬于Ⅰ型鈣黏著蛋白，其胞外結構域在相鄰細胞之間以同親性方式相互結合；胞內分別與α-聯蛋白、β-聯蛋白以及肌動蛋白形成復合物實現細胞的黏附[18]。E-Cadherin的減少使細胞黏著力下降，甚至極性消失，表現出許多非上皮細胞的特性。因此認為，E-Cadherin基因突變或消失是腫瘤進展和轉移過程中的關鍵分子事件。

本研究結果顯示，胃癌組織Oct4、Smad3 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin mRNA相對表達量明顯低于癌旁正常組織。胃癌組織Oct4、Smad3蛋白相對表達量明顯高于癌旁正常組織，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin蛋白相對表達量明顯低于癌旁正常組織；相關分析顯示，Oct4蛋白表達與TβRⅡ、Smad2蛋白表達呈負相關，與Smad3蛋白表達呈正相關；提示Oct4與TGF-β信號通路密切相關。本研究還發現，Oct4蛋白表達與腫瘤組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移及漿膜浸潤有關；表明Oct4可能參與胃癌的浸潤和轉移。

綜上所述，胃癌組織Oct4高表達與胃癌的發生、發展有關，其機制可能與Oct4參與調節TGF-β信號通路、誘導細胞發生EMT有關。

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河北省醫學科學研究重點課題計劃(ZL20140103)。

李春輝(E-mail： chli612@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.014

R735.2

B

1002-266X(2016)40-0045-03

2016-01-12)