實時熒光定量PCR在疑似肺外結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值

張 瑞

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西延安 716000)

?

·臨床研究·

實時熒光定量PCR在疑似肺外結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值

張 瑞

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西延安 716000)

目的 探討實時熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測在疑似肺外結(jié)核診斷中的價值。方法 將懷疑有結(jié)核分枝桿菌感染的患者101例分為關(guān)節(jié)炎組(17例)、胸腹膜炎組(32例)、淺表淋巴結(jié)核組(20例)、腎結(jié)核組(13例)、其他結(jié)核組(19例)，分別取關(guān)節(jié)腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液、尿液等標(biāo)本采用實時FQ-PCR進行結(jié)核分枝桿菌DNA(TB-DNA)檢測，同時進行抗酸桿菌涂片檢測，對檢測結(jié)果進行比較和統(tǒng)計分析。結(jié)果 101例疑似肺外結(jié)核患者關(guān)節(jié)穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液、尿液、腦脊液等TB-DNA檢測陽性率分別為41.18%、37.50%、50.00%、46.15%、35.87%；抗酸桿菌涂片檢測陽性率分別為11.76%、9.38%、10.00%、7.69%、5.26%。抗酸桿菌涂片檢測陰性標(biāo)本采用實時FQ-PCR檢測陽性率為35.87%，抗酸桿菌涂片檢測陽性標(biāo)本采用實時FQ-PCR檢測全部為陽性。結(jié)論 實時FQ-PCRR在疑似肺外結(jié)核診斷中具有重要價值。

聚合酶鏈反應(yīng)； 熒光光度測定法； 肺外結(jié)核； 診斷價值

我國人口眾多，肺結(jié)核患者人數(shù)巨大[1]。與此同時肺外結(jié)核發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎、結(jié)核性關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)核、腎結(jié)核患者數(shù)量增多。肺外結(jié)核由于較為隱匿而較難發(fā)現(xiàn)，因此，臨床診斷難度較大，一直以來均是困擾臨床醫(yī)生的問題，傳統(tǒng)方法檢出率低，檢測周期過長導(dǎo)致臨床漏診時有發(fā)生，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2]。近年來隨著實時熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)的應(yīng)用，肺外結(jié)核檢出率較以前有了較大提高[3]。本研究對住院的101例肺外結(jié)核患者TB-DNA檢驗結(jié)果和抗酸桿菌涂片檢測結(jié)果進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012～2014在本院住院的疑似肺外結(jié)核患者101例，其中男67例，女34例；年齡11～84歲，中位年數(shù)49歲。分為關(guān)節(jié)炎組(17例)、胸腹膜炎組(32例)、淺表淋巴結(jié)核組(20例)、腎結(jié)核組(13例)、其他結(jié)核組(19例)。

1.2 標(biāo)本來源 臨床醫(yī)生在無菌條件下分別抽取關(guān)節(jié)腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液及留取中段尿液5 mL并將標(biāo)本置于無菌瓶中立即送檢。

1.3 試劑 抗酸桿菌涂片檢測染色液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供，結(jié)核分枝桿菌DNA檢測試劑、質(zhì)控品、標(biāo)液均為中山大學(xué)達安基因公司提供。

1.4 檢測方法 對采集的標(biāo)本分別采用實時FQ-PCR檢測TB-DNA和抗酸桿菌涂片檢測抗酸桿菌。

1.4.1 實時FQ-PCR 分別取無菌留取的穿刺液和尿液各1 mL，加入1.5 mL離心管中12 000 r/min離心5 min，留取沉淀，加入1 mL無菌生理鹽水洗滌2次，離心留取沉淀并加入50 μL DNA提取液充分混勻，在100 ℃恒溫干浴10 min后冷卻并12 000 r/min離心5 min待用。陰、陽性質(zhì)控品按操作規(guī)程進行處理。將處理過的標(biāo)本，標(biāo)準(zhǔn)品，陰、陽性質(zhì)控品分別吸取上清液腦脊液、2 μL加入反應(yīng)管中，瞬時離心5 s，按預(yù)設(shè)程序進行擴增和分析。

1.4.2 抗酸桿菌涂片 分別取無菌留取的穿刺液和尿液各1 mL，3 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉渣涂片，固定，抗酸染色，鏡檢。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPASS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者抗酸桿菌涂片和實時FQ-PCR檢測結(jié)果比較 各組抗酸桿菌涂片檢測陽性率均明顯低于實時FQ-PCR，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 各組患者抗酸桿菌涂片和實時FQ-PCR檢測結(jié)果比較

*：P<0.05，與同組抗酸桿菌涂片比較。

表2 抗酸桿菌涂片與實時FQ-PCR陽性率比較

*：P<0.01，與抗酸桿菌涂片比較。

2.2 2種方法檢測陽性率評價 抗酸桿菌涂片檢測陽性標(biāo)本采用實時FQ-PCR檢測全部為陽性，而抗酸桿菌涂片檢測陰性的92例標(biāo)本采用實時FQ-PCR檢測陽性33例，陽性率為35.87%。

3 討 論

隨著社會的發(fā)展，人們的生活方式發(fā)生了多樣化改變，作息時間不規(guī)律，環(huán)境污染等外加因素的存在導(dǎo)致肺結(jié)核感染的發(fā)生過來越多。與此同時肺外結(jié)核發(fā)生率也呈逐年上升趨勢，由于肺外結(jié)核較為隱匿而難發(fā)現(xiàn)，一直以來均是困擾臨床醫(yī)生的問題，傳統(tǒng)檢測方法雖然簡便、快速、價廉，但靈敏度低，特異性差，且不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌感染，尤其是不能檢出L型和顆粒型結(jié)核分枝桿菌[4-5]。培養(yǎng)法是診斷結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，精確可靠，特異性高。但其所需時間達4～8周，嚴(yán)重影響了結(jié)核病的早期診斷和及時治療。近年來隨著實時FQ-PCR技術(shù)的發(fā)展和在臨床的廣泛應(yīng)用，肺外結(jié)核檢測陽性率明顯提高[6]。實時FQ-PCR由于是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上加了熒光標(biāo)記的探針，將核酸擴增、雜交及光譜技術(shù)結(jié)合在一起，實現(xiàn)了對目的基因的準(zhǔn)確定量。該法特異性也較傳統(tǒng)檢測方法高，已得到臨床的一致認(rèn)可[7-9]。

本研究通過對101例疑似肺外結(jié)核患者關(guān)節(jié)腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液及尿液等標(biāo)本進行TB-DNA檢測結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)炎組、胸腹膜炎組、淺表淋巴結(jié)核組、腎結(jié)核組、其他結(jié)核組TB-DNA陽性率分別為41.18%、37.50%、50.00%、46.15%、36.84%；而抗酸桿菌涂片檢測陽性率分別為11.76%、9.38%、10.00%、7.69%、5.26%；實時FQ-PCR檢測陽性率明顯高于抗酸桿菌涂片，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。抗酸桿菌涂片檢測101例標(biāo)本陽性率為8.91%，而實時FQ-PCR檢測TB-DNA陽性率達41.58%。二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

本研究對抗酸桿菌涂片檢測陰性的標(biāo)本采用實時FQ-PCR檢測TB-DNA陽性率為35.87%，由此發(fā)現(xiàn)，抗酸桿菌涂片檢測的漏檢率較高，對患者臨床診斷影響很大，而抗酸桿菌涂片檢測陽性標(biāo)本采用實時FQ-PCR檢測均為陽性。

本研究結(jié)果表明，采用實時FQ-PCR檢測患者關(guān)節(jié)腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液及尿液診斷肺外結(jié)核具有靈敏度高、特異性強等特點，可作為臨床診斷肺外結(jié)核可靠的實驗方法，可廣泛應(yīng)用于臨床檢測。

[1]中華醫(yī)學(xué)會.臨床診治指南：結(jié)核病分冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：64-86.

[2]李艷，鄺浩斌，劉寶瑛，等.糖尿病合并結(jié)核感染診斷中結(jié)核分枝桿菌檢測方法的比較[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2010，10(1)：76-78.

[3]石榴，黃文杰.結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)新進展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2008，29(11)：1770-1771.

[4]Shankar P，Manjunath N，Mohan KK，et al.Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction[J].Lancet，1991，237(8732)：5-7.

[5]張紅，鄭秀云，姜行云.痰結(jié)核菌兩種不同檢測方法分析[J].中國誤診學(xué)雜志，2010，10(15)：3557.

[6]柳紅梅.一種新型結(jié)核桿菌感染快速檢測方法的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20(3)：572-573.

[7]李秀武，劉建強，鄭榮坤，等.FQ-PCR技術(shù)在肺外結(jié)核中的診斷價值[J].中國防癆雜志，2010，32(12)：818-821.

[8]張為民，龔文波.熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌DNA與涂片抗酸染色結(jié)果的比較[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(23)：4272-4274.

[9]張建武，魏存樂，吉煥英，等.結(jié)核PCR定量測定在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用[J].北方醫(yī)學(xué)，2013，10(10)：58-60.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.040

A

1673-4130(2016)02-0239-03

2014-11-17)