結核分枝桿菌耐多藥基因檢測臨床應用研究

高 漫，李 蒙，焦向陽

(陜西省結核病防治院，陜西西安 710100)

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·臨床研究·

結核分枝桿菌耐多藥基因檢測臨床應用研究

高 漫，李 蒙，焦向陽

(陜西省結核病防治院，陜西西安 710100)

目的 評價耐多藥基因檢測利福平、異煙肼藥物敏感性的可行性。方法 收集該院2014年6～12月94例結核病患者標本采用耐多藥基因檢測儀檢測利福平、異煙肼藥物敏感性并與BACTEC MGIT 960培養儀檢測結果進行比較分析。結果 2種方法同時檢測利福平、異煙肼藥物敏感性符合率為91.5%(86/94)，符合率較高。結論 耐多藥基因檢測結核分枝桿菌藥物敏感性靈敏度高，特異性強，對結核病患者的早期及菌陰患者的及時、有效治療具有重要意義。

分枝桿菌,結核； 微生物敏感性試驗； 基因,MDR； 實驗室技術和方法

結核病是一種由結核分枝桿菌感染引起的嚴重危害人類健康的主要傳染病，可累及全身各個臟器[1]。通過影像學檢查與實驗室涂片檢查可快速診斷典型結核病，但對不典型病例影像學無法與其他疾病區分、涂片陰性的病例就依賴于各臟器受結核分枝桿菌感染后產生的痰液、胸腹腔積液、腦脊液、灌洗液、膿液等標本的結核分枝桿菌培養結果，這些標本成為檢測結核分枝桿菌的主要對象，培養陽性就可診斷為結核病，結核分枝桿菌培養被視為診斷結核病的“金標準”[2]。但由于結核分枝桿菌生長周期長，就是用目前較先進的BACTEC MGIT 960培養儀進行培養，結核分枝桿菌培養陽性也需平均12 d時間[3]，進一步藥敏試驗還需平均9 d時間[4]。臨床醫生對該類病例只能通過經驗用藥，等待結核分枝桿菌藥敏試驗結果再調整用藥，對患者的治療具有一定影響。所以，一種快速、簡便的藥敏檢測方法對于患者的早期及時治療極為重要。耐多藥基因檢測操作簡單、快速，可以在3 h內得出利福平、異煙肼的耐藥結果[5]。本研究對耐多藥基因檢測方法進行了臨床應用研究，旨在評價其臨床應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2014年6～12月住院結核病患者痰液、胸腹腔積液、腦脊液、灌洗液、膿液等經培養為結核分枝桿菌陽性標本94例作為研究組，以H37Rv(野生型)為陰性對照(對照組)，同時進行耐多藥基因檢測并與BACTEC MGIT 960培養儀檢測結果進行比較分析。

1.2 儀器與試劑 耐多藥基因檢測儀由上海宏石醫療科技有限公司生產，試劑由廈門至善生物科技有限公司生產；BACTEC MGIT 960培養儀及試劑由美國BD公司生產。

1.3 耐多藥基因檢測方法 采用熒光PCR溶解曲線法。該法是在PCR體系中加入兩端分別標記有熒光基團與淬滅基團的探針，在PCR過程中擴增出與探針序列互補的單鏈寡核苷酸序列，在擴增完成后增加溶解曲線分析過程，同時實時監測熒光值變化，通過計算熒光值與溫度的負導數獲得探針與該序列雜交產物的溶解曲線并得出熔點(Tm值)，從而推測得到該序列突變信息。如靶序列與探針完全匹配則探針與該序列雜交的熔點最高；如探針與序列不完全匹配如序列發生點突變、插入或缺失則探針與該序列雜交的熔點低于探針與完全匹配序列雜交的熔點。熔點降低程度與點突變類型、插入或缺失堿基數量及突變位點位置有關。耐多藥基因檢測及BACTEC MGIT 960培養儀檢測均嚴格按照標準操作規程進行。

1.4 統計學處理 計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 對照組檢測結果 陰性對照H37Rv(野生型)經耐多藥基因檢測與BACTEC MGIT 960培養儀檢測異煙肼、利福平藥物敏感性均為異煙肼、利福平敏感。

2.2 研究組檢測結果 94例標本中耐多藥基因檢測利福平陰性率為80.9%(76/94)，陽性率為19.1%(18/94)；BACTEC MGIT 960培養儀檢測利福平陰性率為84.0%(79/94)，陽性率為16.0%(15/94)。94例標本中耐多藥基因檢測異煙肼陰性率為83.0%(78/94)，陽性率為17.0%(16/94)；BACTEC MGIT 960培養儀檢測異煙肼陰性率為76.6%(72/94)，陽性率為23.4%(22/94)。見表1。

表1 研究組檢測結果(n=94)

2.3 2種方法符合率 對照組耐多藥基因檢測與BACTEC MGIT 960培養儀特異性與靈敏度相當，研究組94例標本中耐多藥基因與BACTEC MGIT 960培養儀同時檢測利福平、異煙肼結果相符86例，符合率為91.5%(86/94)，結果不符8例，不符率為8.5%(8/94)。

3 討 論

利福平、異煙肼是抗結核的主要一線藥，敏感與否直接影響結核病患者療效。用BACTEC MGIT 960培養儀檢測結核分枝桿菌藥物敏感性前提是結核分枝桿菌培養陽性才能進行藥敏試驗，藥敏試驗還需平均9 d才能出結果，總共需23 d左右[6]，若患者送標本之前經抗結核治療，體內結核分枝桿菌已死亡則BACTEC MGIT 960培養儀檢測結果為陰性，不能進行藥敏試驗[7]。耐多藥基因檢測快速、簡單，從分子生物學方面進行檢測，對培養陽性或核酸提取陽性(對有生命力或無生命力的結核分枝桿菌核酸檢測均為陽性)標本均可進行耐多藥基因檢測，僅需3 h即可檢測出藥物敏感性結果。

本研究結果顯示，耐多藥基因檢測與BACTEC MGIT 960培養儀檢測具有較好的一致性，符合率為91.5%(86/94)，在檢測時間方面具有很大優勢，僅需3 h即可檢測出利福平、異煙肼藥物敏感性結果，對結核病早期、菌陰結核病有效藥物的選擇具有重要意義。

作為一種實驗方法，耐多藥基因檢測也有其局限性：(1)該實驗只篩選核酸序列而不是氨基酸序列，因此，有可能不引起氨基酸改變的突變也會被判為突變；(2)耐藥菌占總菌含量的40%以下可能會造成假陰性結果；(3)該產品從方法學上不能區分具體突變位點，因此，報告為突變的結果并不絕對表示耐藥。但耐多藥基因檢測陽性率與BACTEC MGIT 960培養儀檢測結果相當，價格相當，檢測所需時間僅為3 h，臨床可根據患者病情需要選擇檢測方法。

[1]袁偉，秦川.結核病動物模型研究進展[J].中國比較醫學雜志，2010，20(9)：55-59.

[2]沈玉禎.結核病實驗室診斷技術[J].齊齊哈爾醫學院學報，2013，34(4)：563-565.

[3]梁亞萍，高漫.BACTEC MGIT 960用于結核分枝桿菌快速培養的初步評價[J].中國預防醫學雜志，2011，12(6)：521-522.

[4]周昌明，羅丹，廖光付.結核分枝桿菌檢測概述(綜述)[J].中國城鄉企業衛生，2009(4)：89-91.

[5]馬艷艷，李輝，趙東陽，等.熒光PCR熔解曲線法檢測結核分枝桿菌耐利福平突變研究[J].口岸衛生控制，2011，16(5)：21-24.

[6]馬艷艷，李輝，錢成，等.結核桿菌基因型耐藥檢測研究[J].河南預防醫學雜志，2010，21(5)：321-324.

[7]趙立平，于霞，姜廣路，等.對BACTECTM MGIT960培養報告結果為陰性的培養管中顆粒性物質的研究[J].中國防癆雜志，2013，35(1)：27-31.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.041

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1673-4130(2016)02-0241-02

2015-07-02)