東祁連山高寒草地幾種禾本科牧草根際促生菌研究

李建宏，李雪萍，馬文文，姚拓*，孫建軍，蔣永梅，張建貴，師尚禮

(1.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070；2.草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.臨洮縣農業技術推廣中心，甘肅 臨洮 730500)

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東祁連山高寒草地幾種禾本科牧草根際促生菌研究

李建宏1,2，李雪萍1,2，馬文文1,2，姚拓1,2*，孫建軍3，蔣永梅1,2，張建貴1,2，師尚禮1,2

(1.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070；2.草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.臨洮縣農業技術推廣中心，甘肅 臨洮 730500)

本研究以東祁連山高寒草地常見的7種禾本科牧草為材料，通過分離培養的方法研究了其根際細菌的數量和分布，重點研究了其有固氮作用的細菌數量和分布。結果發現，7種植物根際均存在大量的細菌，總數在2.50×106～17.07×106cfu/g，不同植物根際細菌的數量和分布不同，以高原早熟禾根際細菌數量最多，冰草和賴草根際細菌最少，其余禾草居中；根際固氮菌的數量和分布也因牧草種類不同而不同。7種供試植物根際分離到固氮菌201株。且細菌和PGPR菌株的數量均呈現“根系表面(RP)>根際土壤(RS)>根內(HP)”的分布趨勢，表現出強烈的根際效應。

禾草；PGPR；聯合固氮菌

禾本科牧草是最重要的飼草飼料作物，不論是分布范圍、面積，還是經濟價值、生態意義，均顯示出其他科植物無法比擬的優點。但該科植物對氮需求量較大，氮供應量直接影響其生存狀況與功能發揮。為了滿足禾本科植物生存、生產所需要的氮素營養，化肥一直被認為是實現這一目的的主要途徑，然而在經濟落后且土地貧瘠的西北地區，在草地上大量使用高成本化肥在某種程度上說是一種“奢望”。而且隨著化肥使用量的增加，土壤和植物中的NO2-積累，大量磷素被固定，導致了肥效下降，肥料利用率降低，環境污染加重，人、畜及食品安全難以保障，土壤結構及微生物多樣性的破壞等一系列問題。因此，研究開發對環境友好的新型肥料來替代化肥就是一項十分迫切的任務。

研究表明，植物根際生存著許多對植物生長有益的細菌，它們生活在土壤或定植于植物根表、根內，在其生長代謝過程中能產生許多促進植物生長的物質。這類細菌被稱為植物生長促進菌(plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR)。這類菌一般指具有固氮、解磷、產生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中一種能力的細菌、藍細菌等[1-2]。PGPR是寶貴的生物資源，其發現及分離培養、篩選將為禾本科植物固氮、溶磷、產生植物激素、分泌抗生素的研究及生物菌肥的開發起到巨大的作用。PGPR菌株不僅可以促進植物生長、提高作物產量和質量，還可以改善土壤結構，提高土壤有機質含量，改良鹽堿地。如榮良燕等[3]的研究結果顯示PGPR菌可以提高岷山紅三葉(Trifoliumpratense)的干草產量以及干草中的粗蛋白含量，降低纖維含量，從而提高其產量和質量；劉方春等[4]的研究則證實了PGPR生物肥的施用提高了甜櫻桃(Prunusavium)根際土壤中養分離子的有效性和養分保持能力，促進了表層土壤中根系的生長。因此，PGPR資源的開發利用已成為人們關注的焦點[5]。

祁連山位于我國青海省東北部與甘肅省西部邊境，是我國主要山脈之一。1988年經國務院批準建立 “祁連山國家級自然保護區”(2015年1月獲批國家環保科普基地)。祁連山具有涵養水源、調節氣候、保護綠洲、防治荒漠、固持土壤、保護物種和儲存基因等重要的生態功能，是國際生物多樣性保護的重點區域，也是國家生態安全格局“北方防沙帶”中重要的一環，我國草地學家對其資源的開發利用、防止退化及提高草地生產力等方面進行了廣泛的研究，取得了多項重要理論和實踐成果，并已廣泛應用于生產[6]。但對于微生物資源研究較少，尤其是對禾本科牧草聯合固氮菌資源狀況很少見諸報道。因此，研究和開發該地區促生菌(PGPR)資源，進而開發出適宜于該地區的微生物肥料制品，對于解決該地區天然草地肥料的供給，實現農牧業可持續發展具有重大意義。

為了探索和發掘新的生物資源，本研究從東祁連山高寒草地主要禾本科牧草根際分離篩選促生菌，并對其特性進行研究和評價，為進一步開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于甘肅省武威市天祝藏族自治縣抓喜秀龍溝甘肅農業大學高山草原試驗站(坐標為N 37°11′-37°13′，E 102°29′-102°33′)，海拔為2960～2990 m，氣候寒冷潮濕，年均溫-0.1 ℃，>0 ℃年積溫1380 ℃，水熱同期，年平均降水量416 mm，多為地形雨，集中于7-9月，年蒸發量1592 mm。年日照時數2600 h；無絕對無霜期，僅分冷、熱兩季。植被以早熟禾(Poaspp.)、嵩草(Kobresiabellardii)、苔草(Carexspp.)、針茅(Stipacapillata)、金露梅(Potentillafruticosa)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、棘豆(Oxytropisspp.)、委陵菜(Potentillachinensis)、甘肅馬先蒿(Pediculariskansuensis)等為主。土壤以亞高山黑鈣土、亞高山草甸土為主，有機質含量10%～16%，水分含量40%～80%，全磷含量0.056%～0.071%，全氮含量0.5%～0.8%，pH為7.0～8.2[7]。

1.2 樣品采集與處理

于2015年7月在研究區采集當地較常見的高原早熟禾(Poaalpigena)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、醉馬草(Achnatheruminebrians)、賴草(Leymussecalinus)、冰草(Agropyroncristatum)、紫花針茅(Stipapurpurea)和糙毛鵝觀草(Roegneriahirsuta)7種禾本科植物根際樣品(包括植物根系和土壤)，將取得樣品裝入無菌聚乙烯袋中，低溫運輸至實驗室立即進行PGPR 菌株分離。

分離時為了方便研究細菌在植物根際的分布，將根際分為根際土壤(soil adhering to roots, RS)、根系表面(rhizoplan or surface of roots,RP)與根內(histoplan or interior of roots，HP)3個區域[8]。

1.3 不同植物根際細菌的數量與分布測定

植物根際細菌的數量測定與分離用涂布平板法，培養基選用NA 培養基[9]。稱取樣品1 g，放入裝有9 mL 0.85%無菌生理鹽水中，800 r/min震蕩2 min，靜置20 min后取上清液，然后依次稀釋至10-3、10-4、10-5，充分混勻后吸取50 μL接種于NA平板固體培養基上，每個區域的每個梯度稀釋液各重復 3 次，用無菌涂布器涂抹均勻，28～30 ℃的培養箱中培養3 d后計數，計算細菌的數量。計算公式如下：

細菌數量(cfu/g)=(菌落平均數×稀釋倍數)/干土

NA培養基配方為：蛋白胨 5.0 g，牛肉膏 3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 18.0 g，總體積 1000 mL，pH 7.0～7.2。

1.4 聯合固氮菌的分離與純化

在NFM培養基[9]表面運用涂布平板法分離純化不同植物不同部位的聯合固氮菌。分別取已制備的3個區域的10-3、10-4、10-5稀釋液50 μL接種于NFM 固體培養基上。每個區域的每個梯度稀釋液各重復 3 次，用無菌涂布器均勻涂抹到培養基表面，28 ℃的培養箱中培養3 d后計數，計算固氮菌的數量，計算公式與1.3相同。

NFM培養基配方為：蘋果酸 5.0 g，KOH 4.5 g，K2HPO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，生物素 10 μg，0.5%溴麝香草酚藍5 mL，瓊脂 2%，總體積 1000 mL，pH 7.0。

1.5 數據分析

用 Microsoft Excel 2007錄入數據，用Word 2007進行表格制作。采用DPS 7.65統計分析軟件分別對不同植物不同部位總細菌和PGPR的數量進行顯著性分析，選用 Duncan法進行多重比較，并就總細菌數量和功能菌(固氮菌或溶磷菌)數量進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同植物根際細菌的數量及分布

采用NA平板計數法測定了7種供試植物根部3個區域細菌的數量及分布，如表1所示，不同植物根際細菌總數和分布不同，同一植物根部不同部位細菌數量也不同，除賴草和冰草之間差異不顯著外，其余植物根際細菌分布數量差異顯著(P<0.05)，高原早熟禾根際細菌分布數量最多，糙毛鵝觀草根際細菌分布數量次之，垂穗披堿草根際細菌分布數量僅次于糙毛鵝觀草，醉馬草、冰草和賴草根際細菌分布數量較少。除醉馬草外，各植物根際3個分布區域細菌的數量都呈現出“根系表面>根際土壤>根內”的分布趨勢。

2.2 不同植物根際固氮菌的數量及分布

采用NFM選擇性培養基從7種供試植物根際分離到生長速度快、菌落較大的菌株，進一步純化得到聯合固氮菌201株(表2)，其中，分離自醉馬草根際的菌株最多，分離自高原早熟禾根際的菌株次之，垂穗披堿草根際分離到的菌株僅次于高原早熟禾，賴草根際分離到的菌株居中，糙毛鵝觀草根際分離的菌株較少，冰草根際分離到的菌株最少。

2.3 根際總微生物數量和PGPR數量相關性分析

如表5所示，根系表面和根際土壤所含的細菌數量和土壤細菌總數呈極顯著相關，而根內細菌數量和土壤細菌總數呈顯著相關或不相關。對于固氮菌而言，細菌總數與根際土壤、根系表面和根內固氮菌的含量都呈極顯著相關或顯著相關，這預示著無論在根際土壤還是根系表面和根內，都有相當數量的固氮細菌存在。

3 討論

3.1 不同植物根際PGPR菌株分布規律不同

從7種植物根際分離的細菌、固氮菌的數量和種類有很大差異。這與植物種類本身及其生存的環境(如各植物所處區域土壤肥力、水熱狀況)有關[10-11]，還與不同的植物根系向土壤中分泌的不同物質有一定關系[12]，此外也與采集樣品的時間、保存樣品的時間及方式和所用選擇性培養基的種類等有關[12-16]。土壤細菌所需營養主要來源于植物殘體，不同的植物必然導致細菌在各植物根際分布的不均一性[13]。我們認為每種牧草根系與其周圍的固氮微生物是一個統一的生態環境。

表1 不同禾草根際土壤細菌數量及分布Table1 Thenumberanddistributionofbacteriasinrhizospheresoilofdifferentsampleplantscfu/g植物Plants細菌數量Thenumberofbacterias(×106)總數Total根際土壤RS根系表面RP根內HP高原早熟禾P.alpigena17.07a5.679.451.95垂穗披堿草E.nutans10.68c4.555.900.23醉馬草A.inebrians4.10d2.551.470.08賴草L.secalinus2.50f0.791.590.12冰草A.cristatum2.53f0.801.520.21紫花針茅S.purpurea3.31e1.411.890.01糙毛鵝觀草R.hirsuta13.91b4.708.810.40 注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05);RS:根際土壤;RP:根系表面;HP:根內。下同。 Note:DifferentlowercaselettersinthesamecolumnmeansignificantdifferencesatP<0.05level.RS:Soiladheringtoroots;RP:Rhizoplanorsurfaceofroots;HP:Histoplanorinteriorofroots.Thesamebe-low.

表2 不同禾草根際固氮菌株數量及分布Table2 Thenumberanddistributionofnitrogenfixingbacteriainrhizosphereofplants株Strains植物Plants總數Total菌株分布Distribution根際土壤RS根系表面RP根內HP高原早熟禾P.alpigena37a15166垂穗披堿草E.nutans34ab11176醉馬草A.inebrians39a16194賴草L.secalinus27c9135冰草A.cristatum14e572紫花針茅S.purpurea30bc12144糙毛鵝觀草R.hirsuta20d6113表3 根際總微生物數量和PGPR數量相關性分析Table3 CorrelationanalysisofrhizospheretotalmicroorganismquantityandPGPRnumber項目ItemRS(B)RP(B)HP(B)T(NFB)RS(NFB)RP(NFB)HP(NFB)Total(B)0.97**0.99**0.78*0.250.170.220.43RS(B)0.93**0.680.400.310.410.50RP(B)0.73*0.130.040.110.36HP(B)0.310.350.160.46T(NFB)0.96**0.98**0.78*RS(NFB)0.90**0.63RP(NFB)0.73* *P<0.05;**P<0.01;T:總數Total;B:細菌Bacteria;NFB:固氮菌Nitrogenfixingbacteria.

分離自7種不同植物的總微生物和固氮微生物的數量在植物根際的分布均表現出根系表面(RP)數量最多，根際土壤(RS)僅次于根系表面，根內(HP)的最少，即“根系表面>根際土壤>根內”的分布趨勢，這與姚拓等[13-15]、張英[12]的結果大體一致。產生這種結果的原因一方面可能與菌株本身的屬性有關，菌株越接近根表，越容易獲取植物分泌的某些物質，使得聚集在根表的微生物越多[17];另一方面由于在土壤表層和植物根系表層土壤細菌分布密集，積累的枯枝落葉和根系分泌物也多，可為細菌生長提供豐富的營養[18]；也可能與土壤溫度、土壤濕度、土壤中的氧氣分布、牧草種類以及C/N有關[19]。

3.2 PGPR菌株分布數量與根際總細菌數量的相關性問題

本研究相關性分析結果顯示根表面和根表土所含的細菌數量和土壤細菌總數呈極顯著相關，而根內細菌數量和土壤細菌總數呈顯著相關或不相關，這一結果預示著植物根際土壤中細菌的主要分布是根表面和根表土壤，也印證了本研究得出的土壤微生物數量“根系表面(RP)>根際土壤(RS)>根內(HP)”的分布規律。

4 小結

不同禾草根際的細菌數量不同，高原早熟禾根際細菌分布數量最多，糙毛鵝觀草根際細菌分布數量次之，垂穗披堿草根際細菌分布數量僅次于糙毛鵝觀草，醉馬草根際細菌分布數量較少，冰草和賴草根際細菌分布數量最少。

7種供試禾草根際共分離到固氮菌201株。細菌和固氮菌株的數量分布呈現“根系表面(RP)>根際土壤(RS)>根內(HP)”的分布趨勢，表現出強烈的根際效應。

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The study of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) from several Poaceous species in the East Chi-lien Mountains of China

LI Jian-Hong1,2, LI Xue-Ping1,2, MA Wen-Wen1,2, YAO Tuo1,2*, SUN Jian-Jun3, JIANG Yong-Mei1,2, ZHANG Jian-Gui1,2, SHI Shang-Li1,2

1.CollegeofPrataculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,Lanzhou730070,China; 3.LintaoCountyAgriculturalTechnologyPromotionCenter,Lintao730500,China

This research studied the quantity and distribution of bacteria in the rhizosphere of seven Poaceous species from the east Chi-lien Mountains. The research employed a cultivation method, and mainly studied nitrogen fixing bacteria. It was found that there were large numbers of bacteria in rhizospheres of all 7 plant species studied. The total number of rhizosphere bacteria counted ranged from 2.5×106cfu/g to 17.07×106cfu/g, withAgropyroncristatumandLeymussecalinushaving the lowest rhizosphere nitrogen-fixing bacterial populations andPoaalpigenahaving the highest, with the other 4 species intermediate. A total of 201 nitrogen-fixing strains were isolated from the 7 grass species studied. The quantity of bacteria and PGPR present a distribution trend: “root system surface (RP)>root surface soil (RS)>histoplan or interior of roots (HP)”.

grasses; plant growth promoting rhizobacteria (PGPR); Nitrogen fixing bacteria

10.11686/cyxb2016090

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-04；改回日期：2016-06-06

國家自然科學基金項目(31360584)和農業部國家牧草產業技術體系(CARS-35)項目資助。

李建宏(1986-)，男，甘肅臨潭人，在讀博士。E-mail:lijianhong123@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail:yaotuo@gsau.edu.cn

李建宏，李雪萍，馬文文，姚拓，孫建軍，蔣永梅，張建貴，師尚禮. 東祁連山高寒草地幾種禾本科牧草根際促生菌研究. 草業學報, 2016, 25(11): 173-177.

LI Jian-Hong, LI Xue-Ping, MA Wen-Wen, YAO Tuo, SUN Jian-Jun, JIANG Yong-Mei, ZHANG Jian-Gui, SHI Shang-Li. The study of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) from several Poaceous species in the East Chi-lien Mountains of China. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 173-177.