銀杏酚C15∶1與鯡魚精DNA相互作用的光譜研究

楊小明,劉盼君,李月英,方洋洋,史亞祥

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013;2.江蘇大學醫學院,江蘇鎮江 212013;3.江蘇大學化學化工學院,江蘇鎮江 212013;4.鎮江市中醫院,江蘇鎮江 212003)

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銀杏酚C15∶1與鯡魚精DNA相互作用的光譜研究

楊小明,劉盼君,李月英,方洋洋,史亞祥

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013;2.江蘇大學醫學院,江蘇鎮江 212013;3.江蘇大學化學化工學院,江蘇鎮江 212013;4.鎮江市中醫院,江蘇鎮江 212003)

目的:研究銀杏酚C15∶1與DNA的相互作用情況。方法:吖啶橙(AO)為熒光探針,在293 K和310 K pH7.4的Tris-HCl緩沖液中,采用熒光光譜法、粘度法和熱溶解實驗研究銀杏酚C15∶1和鯡魚精DNA的相互作用方式。結果:銀杏酚C15∶1與AO-DNA之間的猝滅方式為靜態猝滅,根據熱力學參數確定作用力類型是以氫鍵作用為主,判斷銀杏酚C15∶1與AO-DNA之間的作用方式主要是嵌插作用。結論:粘度法及熱變性實驗結果進一步證明銀杏酚C15∶1與AO-DNA之間的主要作用方式是嵌插模式。

銀杏酚C15∶1,鯡魚精DNA,熒光光譜法

DNA是重要的生物大分子,是體內抗腫瘤藥物作用的主要靶點。小分子藥物可以通過改變DNA的結構從而影響其復制、合成等性質,達到抗腫瘤的目的。因此研究小分子藥物與DNA的相互作用可為抗腫瘤藥物的初步篩選提供有用信息,并有助于從分子水平上了解抗腫瘤藥物的作用機制[1]。

銀杏酚屬于烷基酚類化合物,主要存在于銀杏(Ginkgo biloba L.)的葉、果和外種皮中[2]。在體內、體外均顯示出良好的抗腫瘤活性[3-4],可以通過誘導腫瘤細胞凋亡而起到抗腫瘤效果[5]。銀杏酚C15∶1作為銀杏酚同系物中含量最大的一個單體,對人肝癌細胞有較好的抑制效果[5],因此被選為研究銀杏酚與DNA相互作用的模型。目前,國內外對于銀杏中烷基酚類化合物的研究仍主要集中于銀杏酸,對銀杏酚涉及較少,已有的銀杏酚與蛋白質相互作用的研究報道也是本課題組的前期工作[6],尚未見有關銀杏酚與DNA作用的研究。由于DNA的天然熒光很弱,因此必須借助熒光探針來研究其與藥物小分子的相互作用。吖啶橙即為一種靈敏度很好的DNA探針[7]。本實驗以吖啶橙為熒光探針,應用熒光光譜法以及粘度實驗和熔解實驗分析研究在pH7.4的Tris-HCl緩沖介質中銀杏酚C15∶1與DNA的相互作用,并對其作用機理進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏酚C15∶1(Ginkgol)HPLC純度>98%,實驗室自制;鯡魚精DNA(fsDNA)、吖啶橙(AO)購自Sigma-Aldrich公司;實驗用水 哇哈哈純凈水;其他試劑 均為國產分析純。

Cary Eclipse熒光分光光度計 美國瓦里安公司;烏氏粘度計 上海申誼玻璃制品有限公司;SYP-II B玻璃恒溫水浴槽 上?；ゼ褍x器設備有限公司;pHS-3C型酸度計 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 分別配制濃度為1.5×10-4mol/L的銀杏酚C15∶1甲醇溶液,2.45×10-4mol/L的AO溶液,2.5 mol/L的NaCl溶液和0.05 mol/L pH7.4的Tris-HCl緩沖液。

fsDNA溶液的配制:稱取一定量fsDNA,用二次蒸餾水溶解并用容量瓶定容至100 mL。取該溶液3 mL,測其波長在260 nm處的紫外吸光度,通過ε260=6600/mol·cm計算出DNA儲備液的濃度為0.91×10-4mol/L。同時根據A260/A280>1.8,表明DNA中基本不含蛋白質,符合測定要求。fsDNA儲備液在4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 AO與DNA的結合 在pH7.4的Tris-HCl緩沖液中,分別測定DNA、AO及AO與DNA混合物的熒光光譜。激發波長為495 nm,發射光譜的掃描范圍為500～650 nm,激發和發射狹縫皆為5 nm。

通過熒光法測定AO與DNA溶液的最佳比值。實驗中保持溶液中AO的濃度為2.45×10-6mol/L,改變DNA的濃度,測定溶液在527 nm出的熒光強度,激發波長為495 nm,激發和發射狹縫皆為5 nm。

1.2.3 熒光淬滅實驗 采用熒光淬滅法研究銀杏酚C15∶1與DNA結合性質。取8只5 mL的容量瓶,分別加入370 μL DNA溶液、50 μL AO溶液和1.0 mL Tris-HCl緩沖液,搖勻,然后依次加入0、20、40、60、80、100、120、140 μL的銀杏酚C15∶1溶液,定容后室溫放置4 h。移取混合液于1 cm石英比色皿,放入自帶恒溫裝置的熒光分光光度計中恒溫10 min,分別在293 K及310 K下記錄其熒光發射光譜(激發波長為495 nm,發射光譜的掃描范圍為500～650 nm,激發和發射狹縫皆為5 nm)。同時在相同條件下記錄AO溶液、DNA溶液的熒光發射光譜。

1.2.4 離子強度實驗 取8只5 mL的容量瓶,分別加入370 μL DNA溶液、50 μL AO溶液、90 μL銀杏酚C15∶1溶液和1 mL Tris-HCl緩沖液搖勻,再分別加入一定量的NaCl溶液使其濃度依次為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mol/L(NaCl溶液濃度參見文獻[8]),定容。測定在NaCl加入前和加入后的熒光強度(激發波長為495 nm,發射波長527 nm,激發和發射狹縫皆為5 nm),以F/F0為縱坐標,NaCl濃度為橫坐標作圖,得到不同離子強度對Ginkgol-DNA-AO熒光強度的影響。

1.2.5 粘度的測定 將粘度計垂直插入298 K的恒溫玻璃水浴槽中,加入一定量的Tris-HCl緩沖液于粘度計中并恒溫15 min,用秒表測溶液在粘度計玻璃球中流經的時間,重復測定5次,誤差不超過±0.2 s。隨后加入一定量的AO和DNA溶液按同樣的方法測定。再逐漸加入不同濃度的Ginkgol測溶液流經時間。通過樣品在粘度計玻璃球中流經的時間計算平均相對粘度,平均相對粘度用(η/η0)1/3表示,η0和η分別表示沒有銀杏酚存在和有銀杏酚存在下的AO-DNA的粘度,而η的值根據公式η=(t-t0)/t0計算[9]。

1.2.6 熔解實驗 取2支10 mL的比色管,分別加入900 μL DNA,100 μL AO,2 mL Tris-HCl緩沖液,銀杏酚C15∶1溶液分別加入0 μL,140 μL并定容至10 mL。放置于水浴中加熱,升溫范圍為298～370 K,298～343 K范圍內每隔5 K測定體系的熒光強度,343～370 K范圍內每隔3 K測定體系的熒光強度。

1.3 數據分析

本實驗數據采用Origin8.5軟件進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 AO與DNA的結合性質

為研究AO與DNA的結合,分別掃描了AO、DNA和AO-DNA的熒光發射光譜,結果見圖1。從圖1可以看到,DNA溶液熒光發射光譜的熒光強度很弱,而AO在濃度為2.45×10-6mol/L時的熒光強度也很弱,但是當DNA與AO混合后,AO-DNA體系的熒光強度就大大增強。這是因為AO是一種具有平面結構的芳香類發色團,其平面芳環能夠嵌入到DNA雙螺旋結構的堿基對中,使其熒光大大增強[10]。

圖1 (a)DNA,(b)AO,(c)AO-DNA體系的熒光發射光譜Fig.1 The fluorescence emission spectra of(a)DNA,(b)AO,(c)AO-DNA注:c(DNA)=1.0×10-5 mol/L,c(AO)=2.45×10-6 mol/L。

從圖1可以看出,AO-DNA體系在527 nm處有一很強的熒光發射峰。固定AO濃度為2.45×10-6mol/L,測定AO-DNA體系在527 nm處的熒光強度隨DNA濃度的變化,結果見圖2。由圖2可見,當DNA濃度低于1.0×10-5mol/L時,AO-DNA體系的熒光強度隨著DNA濃度的增加明顯上升,在0～7.28 mol/L范圍內呈現較好的線性關系;而DNA濃度高于1.0×10-5mol/L,AO-DNA體系的熒光強度隨濃度增加的幅度明顯減少。因此,選取DNA的濃度為6.73×10-6mol/L。

圖2 AO溶液熒光強度隨DNA溶液濃度的變化Fig.2 Variations in fluorescence intensity of AO with increasing the concentration of DNA 注:c(AO)=2.45×10-6 mol/L。

2.2 熒光猝滅研究

通過熒光猝滅的方法來研究小分子與AO-DNA配合物的成鍵作用。本實驗中,在AO-DNA體系中加入不同濃度銀杏酚C15∶1后,體系的熒光強度被顯著猝滅,但熒光光譜并沒有發生紅移和藍移,結果見圖3。從圖3可以看出,AO-DNA系統在527 nm處有一很強的熒光發射峰,且熒光強度隨著銀杏酚C15∶1濃度的增加而逐漸減小。若銀杏酚C15∶1與DNA的結合是嵌入式結合,那么銀杏酚C15∶1將會與AO競爭結合嵌入到DNA雙螺旋結構的堿基對中,從而使AO與DNA的相互作用的程度減小,隨著銀杏酚C15∶1濃度的逐漸增加,AO逐漸從DNA中游離出來,使熒光強度逐漸降低[11]。

圖3 不同濃度銀杏酚C15∶1存在下AO-DNA的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of AO-DNA in the presence of Ginkgol at different concentrations 注:pH7.4,T=293 K;c(AO)=2.45×10-6 mol/L,c(DNA)=6.73×10-6 mol/L,c(Ginkgol C15∶1)=(1)0、(2)0.6、(3)1.2、(4)1.8、(5)2.4、(6)3.0、(7)3.6×10-6 mol/L。

2.3 熒光猝滅類型

一般來說,熒光猝滅方式分為靜態猝滅和動態猝滅。靜態猝滅與熒光團、猝滅劑形成的基態復合物有關,溫度升高會導致結合常數減小[12]。而動態猝滅則是在激發態壽命期間熒光團和猝滅劑發生碰撞,溫度升高則導致結合常數增大[13]。為了進一步研究體系的猝滅機制,可以用Stern-Volmer方程計算猝滅數據來判斷熒光猝滅的類型[14]:

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]

式(1)

其中F0和F分別表示AO-DNA體系在藥物不存在和存在時的熒光強度;Kq、Ksv分別為雙分子的猝滅速率常數和動態猝滅常數,τ0為不存在猝滅劑的情況下生物分子的平均熒光壽命(τ0=10-8s),[Q]為猝滅劑的濃度。以F0/F為Y軸,[Q]為X軸作圖。圖4是表示在293 K及310 K這兩個溫度下銀杏酚C15∶1對AO-DNA熒光猝滅的Stern-Volmer圖,從圖4中可以看出兩條曲線呈良好的線性關系,說明銀杏酚C15∶1對AO-DNA的猝滅是單一的猝滅類型。曲線的斜率即為Ksv,同時根據Ksv=Kqτ0求出Kq,結果列于表1中。從表1中可以看出,Ksv隨著溫度的升高而降低,說明銀杏酚對AO-DNA的猝滅是靜態猝滅。另外,Kq的值比生物分子的最大擴散速率常數(2.0×1010L/mol·s)還大,這也說明銀杏酚對AO-DNA的猝滅并非動態猝滅而是靜態猝滅。

圖4 不同溫度下銀杏酚C15∶1對AO-DNA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線圖Fig.4 Stern-Volmer plots for the fluorescence quenching of AO-DNA by Ginkgol at different temperatures

T(K)KSV(×105L/mol)Kq(×1013L/mols)R22931 5441 5440 98213101 3221 3220 9768

2.4 結合常數及熱力學函數的計算

對于靜態猝滅,結合常數以及結合位點的數目可以用下面的方程來計算[15]:

log[(F0-F)/F]=logKa+nlog[Q]

式(2)

在這個方程中,Ka和n分別表示結合常數和結合位點的數目,以log[(F0-F)/F]對log[Q]作雙對數曲線圖,如圖5。Ka和n的值分別通過截距和斜率得到,數據列于表2中。

表2 不同溫度下銀杏酚C15∶1與AO-DNA相互作用結合常數,結合位點數以及熱力學參數

圖5 不同溫度下log[(F0-F)/F]對log[Q]的曲線圖Fig.5 Plots of log[(F0-F)/F]vs log[Q]at different temperatures

熱力學函數的研究對判斷Ginkgol與鯡魚精DNA的結合模式具有重要的作用。小分子與生物分子的結合力類型主要受四種作用力的驅使:氫鍵作用力,疏水作用力,范德華力以及靜電作用力,這四種作用力都可以通過計算熱力學參數來判斷。當溫度的變化不是很大時,焓變ΔH可以看成是一個常數。焓變ΔH和熵變ΔS可以通過范特霍夫方程來計算:

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

式(3)

ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS

式(4)

Ka為結合常數,R為氣態常數,T為實驗溫度,ΔG、ΔH和ΔS分別代表吉布斯自由能變,焓變和熵變。相應的結果列于表2中。表2中的ΔG為負值,表明該反應自發的。ΔH和ΔS皆小于0,表明氫鍵作用力在反應過程中起主要作用。而氫鍵作用是判斷藥物與DNA發生嵌插作用的顯著特征[16],由此可以判斷,銀杏酚C15∶1很可能嵌入到了DNA的堿基對中。

2.5 粘度的測定

粘度的測定對DNA長度的變化非常敏感,它是判定藥物小分子和DNA之間結合模式的最關鍵有效的測試[17]。當小分子與DNA以典型的嵌入式結合時,要求DNA雙螺旋結構的相鄰堿基對之間的距離增大以容納足夠的配體,從而導致DNA雙鏈的延長,粘度因此有所增大[18];當小分子與DNA以溝槽或靜電作用結合時,對DNA的粘度幾乎沒有什么變化[17,19];而一種部分的,非經典的嵌入式結合則會使DNA得雙螺旋結構彎曲從而導致DNA粘度的減小[20-21]。圖6是表示在不同濃度銀杏酚C15∶1溶液的存在下DNA相對粘度的變化。在圖6中,保持DNA和AO的濃度不變,不斷增加銀杏酚的濃度,結果發現,隨著銀杏酚濃度的不斷增加,DNA的粘度逐漸增大,由此可以說明銀杏酚C15∶1與鯡魚精DNA的結合存在著嵌插作用。

圖6 298 K時不同濃度的銀杏酚C15∶1對DNA相對粘度的影響Fig.6 Effect of increasing concentrations of Ginkgol on the relative viscosity of DNA at 298 K

2.6 離子強度的影響

離子強度實驗也是辨別小分子與DNA結合模式的一種有效的方法。小分子與DNA結合的三種模式中,溝槽作用和嵌插作用都與DNA雙螺旋結構中的溝槽有關,只有靜電作用發生在溝槽之外[22]。DNA中的磷酸骨架帶有負電荷,NaCl溶液中的Na+會與其產生一種靜電作用力,從而使得DNA的雙鏈更加緊密[23]。當小分子與DNA以溝槽方式結合時,小分子結合到DNA雙螺旋的溝槽中,使其更容易暴露在溶劑環境中[24]。而若是小分子與DNA發生嵌插作用,插入到DNA上下堿基對的小分子受離子強度的影響較小,對周圍的環境變化不如溝區結合敏感。本實驗研究了不同NaCl濃度下,銀杏酚C15∶1對AO-DNA體系熒光強度的變化趨勢,如圖7所示,隨著NaCl濃度的不斷增加,體系的熒光強度并沒有明顯的變化趨勢,因此可以判定,銀杏酚C15∶1與DNA的結合屬于嵌入式作用。

圖7 離子強度對Ginkgol-AO-DNA熒光光譜的影響Fig.7 Effects of ionic concentration on fluorescence spectra of Ginkgol-AO-DNA注:c(AO)=2.45×10-6 mol/L,c(DNA)=6.73×10-6 mol/L,c(Ginkgol)=1.8×10-6 mol/L。

2.7 DNA熱變性實驗

DNA熱變性溫度的測定也能幫助判斷小分子與DNA的結合模式。一般說來,小分子若與DNA發生嵌入作用,則會使DNA的變性溫度升高,而非嵌入作用并不會使DNA的變性溫度明顯升高[25]。本實驗分別測定了AO-DNA體系以及加入銀杏酚C15∶1之后體系從25～97 ℃的熒光強度的變化,并以F25 ℃/F為縱軸,溫度為橫軸作熱變性曲線(如圖8所示),曲線躍遷的中點所處的溫度就是變性溫度。DNA的變性溫度大約為70 ℃[25-26],從圖8得AO-DNA的變性溫度為78 ℃,當加入銀杏酚C15∶1之后則降為75 ℃,這可能是因為銀杏酚的結合使DNA的雙螺旋結構受到了一定程度的破壞,使得AO與DNA的穩定性降低,因此熱變性溫度有所降低。而變性溫度變化較小,也說明嵌插作用性質沒有變,即銀杏酚C15∶1與DNA的結合強度比AO弱。

圖8 AO-DNA在有無Ginkgol存在下的熔解曲線Fig.8 Melting curves of AO-DNA in the absence and presence of Ginkgol注:c(AO)=2.45×10-6 mol/L,c(DNA)=8.19×10-6 mol/L,c(Ginkgol)=2.1×10-6 mol/L。

3 結論

以吖啶橙(AO)為熒光探針運用熒光光譜法研究了銀杏酚C15∶1與DNA的相互作用。結果表明銀杏酚C15∶1對AO-DNA的猝滅機制是靜態猝滅,兩者之間的主要作用力為氫鍵作用力。而粘度實驗、離子強度實驗和熔解實驗則發現銀杏酚C15∶1與DNA的結合模式是嵌入式結合,銀杏酚C15∶1嵌入到DNA雙螺旋結構的堿基對中。為銀杏酚的藥用機理提供一定的理論參考和臨床應用依據。

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Spectroscopic studies on the binding of Ginkgol C15∶1 and Herring Sperm DNA

YANG Xiao-ming1,LIU Pan-jun1,LI Yue-ying2,FANG Yang-yang3,SHI Ya-xiang4

(1.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2.School of Medicine,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;3.School of Chemistry and Chemical Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;4.Traditional Chinese Hospital,Zhenjiang 212003,China)

Objective:To study the interaction between Ginkgol C15∶1 and Herring Sperm DNA. Methods:The interaction between Ginkgol C15∶1 and Herring Sperm DNA was investigated by fluorescence spectroscopy,viscosity measurements and thermal dissolution assay in the Tris-HCl buffer(pH7.4)at 293 K and 310 K,Acridine Orange(AO)as the fluorescent probe. Results:The fluorescence quenching of Ginkgol C15∶1 by AO-DNA was a static quenching procedure. The main binding force was hydrogen bond force on the basis of thermodynamic parameters,which indicated the interaction between Ginkgol C15∶1 and AO-DNA was intercalation. Conclusions:The results of viscosity measurements and the thermal denaturation experiments further demonstrated that intercalative binding was the main mode between Ginkgol C15∶1 and AO-DNA.

Ginkgol C15∶1;Herring Sperm DNA;fluorescence spectrum

2016-04-14

楊小明(1963-)，女，博士，教授，研究方向：天然產物提取及活性研究，E-mail：XM_Yang1963@126.com。

國家自然科學基金資助項目(81372404)；鎮江市社會發展基金資助項目(SH2015072)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000