環境混合物的聯合毒性研究方法

楊蓉，李娜，饒凱鋒，馬梅,*，王子健

1.北京市南水北調水質監測中心，北京100195

2.中國科學院生態環境研究中心中國科學院飲用水科學與技術重點實驗室，北京100085

環境混合物的聯合毒性研究方法

楊蓉1,2，李娜2，饒凱鋒2，馬梅2,*，王子健2

1.北京市南水北調水質監測中心，北京100195

2.中國科學院生態環境研究中心中國科學院飲用水科學與技術重點實驗室，北京100085

人類和其他生物通過多重途徑暴露于大量的環境污染物中。單一化合物由于其在環境中非常低的濃度使得人們忽視其可能的健康危害,然而,多種化合物在環境中同時存在,就意味著更加復雜的聯合作用的可能性。Something from nothing現象引起了科學界對于環境混合物加和作用和潛在協同作用的關注,致使許多研究聯合毒性的數學和生物模型的提出和應用。本文綜述了這些研究方法,以及未來化學混合物研究和管理面臨的挑戰。

混合物；聯合作用；作用方式；模型預測

人類和其他生物終生暴露在不同來源、不同種類的多種環境污染物中,單一污染物環境暴露在實際環境中并不存在。檢測各污染物的環境濃度水平、并評價其毒性和健康風險一直是科學界和大眾的關注焦點。傳統方法中通常是通過對目標化合物的分析定量測定其環境濃度,并根據其毒性數據判斷其潛在的健康影響。雖然儀器和方法學的發展帶來了檢測限的降低和更多痕量物質的發現,但儀器分析檢測到的目標化合物種類有限,可能只占種類繁多的環境污染物中很少一部分,會導致我們忽略了未知污染物的存在和毒性效應。例如,Escher等[1]研究了包括回用水、飲用水、雨水在內的9個環境水樣造成的氧化應激反應,指出已知化合物的貢獻小于0.1%,而超過99.9%的氧化應激都由未知化合物造成。另一方面,環境污染及其健康影響的調查與評價,其最終目的是保護生態系統和人類健康。從這個角度考慮,污染物濃度本身并沒有實質意義,但是其所產生的生物毒性或對健康的干擾效應才是應該受到關注的重點。因此在生態和健康風險評估中,暴露評價和危害評價均是整體研究中的不可或缺的部分。

毒理學研究中的毒性測試則關注整體生物效應,通常是測定某個具體污染物或混合物樣品針對具體受試生物和測試終點的毒性表現。在20世紀,絕大多數的毒理學研究和風險評價都停留在單一化合物的水平上[2],因為針對單一物質的毒性研究花費低廉且簡單易行。然而,已有大量證據證明混合物的聯合毒性并不能簡單地通過組分濃度或毒性當量加合來描述,而是表現出相互影響、相互作用,會產生諸如加和、協同或拮抗等聯合毒作用。此外,聯合毒性還會隨著組分濃度水平、濃度比、暴露時間、路徑和順序、以及測試生物的狀態發生變化。由此可見,混合物的聯合毒性研究是一個挑戰性與必要性并存的課題。基于單一物質的毒性研究和管理策略很難用來解決復雜的污染問題,而研究聯合效應對進行風險評價、改進環境標準和環境容量、開展預防評價對策都有很強的推動作用和現實意義。

對聯合作用的描述及其評價方法的探討已日益引起研究人員和環境管理人員的重視,提出了許多基于生理學、毒理學和生物統計學的方法模型并加以應用優化。近年來,美國環保署(United States Environmental Protection Agency,USEPA)、毒物與疾病登記署(Agency for Toxic Substances and Disease Registry,ATSDR)、經濟合作與發展組織(Organization for Economic Cooperation and Development, OECD)和世界衛生組織(World Health Organization, WHO)等[3-7]一系列具有影響力的環境機構和組織也開始發布混合物毒性研究的準則和標準。本文綜述了這一領域的進展和主要成就,包括用來預測聯合毒性的數學和生物學模型,以及未來化學混合物研究和管理面臨的挑戰。

1 聯合作用的分類(Classification of combined effects)

Bliss[8]于1939年發表的論文標志著混合污染物聯合毒性研究的開始,其中首次提出了聯合作用的分類方法:獨立作用(independent joint action)、相似作用(similar joint action)和協同作用(synergistic action)。Bliss強調了聯合作用分類的關鍵之處,即一種組分的存在是否干擾混合物中其他組分的效果。由此,聯合作用可被分為無相互作用(non-interative,包括獨立作用和相似作用)和相互作用(interactive,此處的“協同作用”包含了傳統意義上的協同和拮抗)2種。在無相互作用的進一步分類中,也考慮了混合物組分的作用位點和路徑是否相同。

表1 Bliss的聯合作用分類法Table 1 Classification of combined effects by Bliss

表1說明Bliss僅將協同作用定義為對加和的偏離,但并未對此開展進一步討論。在此基礎上, Plackett和Hewlett[9-10]根據作用方式(mode of action, MoA)的不同,對相互作用做了進一步分類。復雜相似作用(complex similar action)和關聯作用(dependent action)兩個概念被分別用來描述機理相似和機理不同的混合物組分的相互作用(見表2)。然而,Plackett和Hewlett的分類法仍存在不足之處,它只適用二元混合物,不能用于多組分混合物、尤其是復雜環境樣品的分類。因此,Ashford[11]在總結了以上分類法的特性和優缺點后,將各種聯合作用基于亞系統、作用位點和混合物組分重新分類,提出了將組分相似性、關聯性、一致性等信息同時納入框架的新方法(見表3)。與前述分類法不同,新引入的部分相似作用(partially similar)和部分關聯作用(partially dependent)2個概念更加符合環境樣品的真實情況,也為聯合作用提供了更加細致的描述。

表2 Plackett和Hewlett的聯合作用分類法Table 2 Classification of combined effects by Plackett and Hewlett

在Ashford分類法提出的同一時期,WHO和USEPA也發布了各自推薦的聯合作用分類,主要參考了半世紀前Bliss分類法的思路。WHO[12]將聯合作用分成獨立作用(independent joint action)、加和作用(additive effects)、協同作用(synergistic joint action)和拮抗作用(antagonistic joint action)4類；USEPA[5]則將最后兩者合并,分為劑量加和(dose addition)、效應加和(response addition)和相互作用(interaction)3類。30多年來,WHO和USEPA的巨大影響力使其推薦的分類法被普遍采用。但這也帶來了以下問題:作為自然界中廣泛存在的現象,相互作用的研究不應當僅僅滿足于諸如“偏離加和”、“協同(大于加和)”和“拮抗(小于加和)”的現象描述,而應該更加深入到作用方式和機理的探討。因此,雖然WHO和EPA對本領域中關鍵概念的推廣和標準化作出了很大貢獻,但他們的觀點并不能代表混合物毒性研究的最新進展。

圖1 基于數據質量的混合物風險評價Fig.1 Flow chart for evaluating mixtures based on data quality

表3 Ashford的聯合作用分類法Table 3 Classification of combined effects by Ashford

2 無相互作用模型(Non-interactive combined effects)

USEPA于1986年發布的化學混合物風險評價指南是混合物毒性研究領域的重要文檔。其針對混合物毒性研究提出了3個層次的問題,以指導不同數據質量的混合物進行研究方法的選擇[5-6]:(1)是否是高質量數據?(2)是否有完全混合物數據?(3)混合物組分信息是否已知?因此,可以由數據質量的評價開始,評估已有數據并選擇合適的風險評價方法,如Teuschler[13]的流程圖所示(圖1)。完全混合物及充分相似混合物是把混合物看作一個整體加以評價,在混合物組分信息已知的情況下,可以通過對其組分的分析來評價混合物,這更利于聯合毒性的分析和預測、以及作用模式機理和相互作用的探討。在基于組分的預測方法中,大多數研究聯合效應的模型都與2個基本概念相關,是由Loewe和Bliss分別提出的濃度加和模型(concentration addition,CA)和效應加和模型(response addition,RA)。在相互作用不存在或組分濃度低到可以忽略相互作用的情況下,濃度加和和效應加和都被USEPA推薦為風險評價的通用方案,方法簡便可靠,應用廣泛[8,14]。這兩者的區別在于混合物每一組分是否具有毒理學相似性。混合物各組分可能具有相同或不同的作用方式,結合相同或不同的作用位點(target of action, ToA),這都會影響對評價方法和預測模型的選擇。

濃度加和也被稱為劑量加和[5]和簡單相似作用[8]。它基于混合物組分共享一個作用方式的假設,認為在混合物各組分結構類似、生理功能和毒理行為相似、只在毒性效力上有所區別、某組分與其他組分無相互作用。因此,在調整各組分的毒性強度后,我們可以將各單一化合物的劑量(或濃度)相加,由此計算聯合效應[15]。嚴格地說,濃度加和只可用于所有組分競爭結合同一分子位點的情況[16],但這一苛刻的條件可以適當放寬至各組分可以引起相同生物響應[17]。濃度加和說明即使各化合物濃度低于其各自無觀察效應濃度(no-observed effect concentration,NOEC),也可能會產生顯著的聯合作用。其可表示為:

其中,pi表示i化合物濃度在混合物總濃度中的比例,ECx,i表示i化合物產生x%效應時的濃度,比如各化合物的半數效應濃度(half-effective concentration,EC50),ECx,mix表示混合物產生x%效應時的濃度[18]。顯然,不論單個化合物的濃度是否低于無觀察效應濃度,混合物中每個化合物對總體的毒效應均有貢獻。

濃度加和是混合物風險評價中使用最多的方法,它具有簡單的數學表達式,方便易用,傾向在某種程度上高估了聯合作用,這有利于潛在風險的識別、符合預防原則。并且當復雜混合物的毒性信息不完全已知時,濃度加和可以被用作通用解決方法,因為模型預測和實驗觀察到的結果總體而言相差不大[19-20]。由這個方法衍生出來的方法眾多,包括危害指數法(hazard index,HI)[21-22]、毒性單位法(toxic unit,TU)[23-24]、相對強度因子法(relative potency factor,RPF)[6]、毒性當量因子法(toxicity equivalence factor,TEF)[25]、總體負荷法(total body residue,TBR)[26]等,需要根據毒性機理和毒理學相似性方面的相關信息進行選擇[15]。

濃度加和模型及其衍生方法在環境研究和管理中得到廣泛的應用。有許多研究者利用濃度加和研究混合物毒性,受試生物包括細菌、酵母、細胞、嚙齒類和魚類,測試終點涵蓋生物發光[27]、酶活性[28-29]、細胞增殖[30-31]、卵黃蛋白原水平[32-33]、mRNA 表達[34]、子宮增重[35]等。另外,作為濃度加和的衍生物,標準化合物當量法也被成功應用于描述聯合作用。例如,用二噁英的TEF表示混合體系相對于2, 3,7,8-TCDD的芳烴受體結合效應[25,36],用雌激素的EEF表示混合體系相對于雌二醇的雌激素受體結合效應[37],用RPF表示有機磷農藥混合物相對于甲胺磷的乙酰膽堿酯酶抑制效應[38],而用BaP-TEF表示化合物的遺傳毒物相對于苯并[α]芘的致癌性[39]。

另一方面,效應加和是每個混合物組分效應的加和,也稱獨立作用[8,40]或簡單非相似作用[15]。此時,混合物中的化合物被認為彼此獨立地與不同的系統或靶位點發生作用、不影響其他物質的毒性。效應加和通常被描述為:

其中,E(cmix)表示混合物的聯合毒效應,E(ci)表示i化合物單獨作用時的毒效應。與濃度加和概念中的“不論濃度大小,所有組分均對總毒性有所貢獻”不同,效應加和模型認為各化合物的濃度必須在其環境安全水平以上才能對混合物的總毒性有所貢獻[41]。當混合物中各化合物具有不同的作用方式、且每個組分的存在不會影響其他化合物毒性時,效應加和對聯合毒性有更好的預測能力[42]。

事實上,環境中化合物作用完全相同或完全不同的情況很少發生,濃度加和和效應加和用于實際樣品都存在局限性。因此Junghans[43]在更接近實際混合物的探索中提出了整合濃度加和/效應加和于一體的兩步預測(two-step prediction,TSP)模型,其表達式如下:

顯然,上式為濃度加和和效應加和表達式的結合。作用方式的化合物先各自組成數個集合,分別用濃度加和預測集合內效應；之后,集合間聯合作用的再使用效應加和預測。兩步預測模型已被應用于污水處理廠出水的評價,被證明可用于評價復雜混合物的效應[44]。

無相互作用模型在實踐中得到廣泛應用,很長一段時間內幾乎被用于混合物毒性描述和預測的通用解決方案。表4總結了使用濃度加和和效應加和進行的部分聯合毒性研究,顯然,混合物組分的作用方式和最優模型選擇具有一定相關性。

表4 濃度加和和效應加和模型在混合物毒理研究中的應用Table 4 Application of CA and RA in mixture toxicity researches

然而,研究者發現現實世界里無相互作用的普適性并不令人滿意。例如,在針對雌激素混合物的研究中,采用 MCF-7細胞增殖[53-55]、海龜性別決定[56-57]和小鼠子宮增重[58]作為測試終點,也都發現了協同或拮抗效應。Vijver等[59]綜述了2010年之前發表的文獻,發現模型預測是無相互作用的只占全部數據的13%。對有機有毒物質,加和模型有較好的預測效果,但不同金屬離子之間主要是協同和拮抗作用。由此可知,實際環境中存在的相互作用更加普遍。這就意味著預測相互作用需要有新的方法學突破,應該重點考慮不同的靶點和不同的作用方式之間的交互影響[60]。理論上,這類聯合毒性的研究更需要數學模型、生理學、系統毒理學、計算機預測等多方面的支持與合作,目前處于發展階段。

3 常見的聯合毒性實驗設計(Common experimental design for combined effects)

濃度加和效應加和模型使用雖廣,但其最大的缺點在于它們忽視了組分之間可能的相互作用。相互作用是對加和性(additivity)的偏離的經驗性描述,會影響混合物的毒理學應答和整體毒性,一般分為協同和拮抗效應。許多研究者研究了混合物組分之發生的相互作用頻率及強度,證明在真實世界里相互作用是普遍存在的[59,61]。當組分的濃度和濃度比發生變化時,可能會有更微妙和復雜的相互作用發生[62]。因此,研究者提出了諸多用于研究聯合毒性、分辨加和、協同和拮抗的實驗設計方法,在此予以綜述。

3.1 等效線圖

在特定效應水平對二元混合物進行分析時,等效線圖是區分加和效應和相互作用的經典統計方法[14]。在此圖上,x軸和y軸分別是組分A和B的毒性單位,用混合物中該組分濃度與其單獨作用時特定效應水平下濃度(一般是EC50)的比值表示(Ci/ EC50i)。當混合物兩組分之間沒有相互作用,實驗點會形成一條筆直的“加和線”,如圖2所示。如果實驗點出現在加和線的上方和下方,即認為有拮抗和協同作用發生。

圖2 等效線圖(I:加和效應；II:協同效應；III:拮抗效應)Fig.2 Isobologram(I:additivity;II:synergism;III:antagonism)

盡管等效線圖可以直觀地表示聯合效應,它也存在很多方面的局限:只可用于二元混合物在某一特定效應水平上的評估,因此需要開展大量工作來精確地測定每一組分的等效應濃度[63]。然而,在試驗方法學的發展下,某一效應水平上的毒性數據——如EC50已經不是評估和比較混合物毒性的唯一指標。環境中化合物濃度隨空間和時間變化巨大,只研究單一濃度比的傳統方法難以反映環境現實,而增加組分和濃度組的數量又會大大提高工作量。此外,實驗設計方式和實驗產生的誤差會很大程度地影響基于等效線設計而得出結論的置信度水平,需要在統計學方法的幫助下得到清晰、可控、數據使用充分的實驗設計[64]。

3.2 混合物毒性指數法

混合物毒性指數法是通過公式計算定量判斷模型預測值和實際觀測值之間關系的方法。針對二元混合物,大多數指數法是由等效線圖推導得出的,與其代數等價。例如Finney[65]的K值法,定義K為實驗得到的EC50和濃度加和預測到的EC50的比值。從理論角度講,K=1說明毒物具有加和作用,K＜1或K＞1說明它們有拮抗或協同作用。但由于實驗誤差和實驗動物狀態的波動,在0.4到2.5之間的K值一般被認為表示加和。之后,也有其他研究者推薦了不同的K值加和區間,或者提出了更完善的K值評價系統[66-67]。

其他可行并常用的指數法包括毒性單位、加和指數(additive index,AI)、混合毒性指數(mixture toxicity index,MTI)、相似參數(similarity parameter,λ)等,它們在近年仍被用于聯合毒性評價[68-69],其定義式、特性、應用等詳細闡述可參見曾鳴等[70]的綜述。與等效線圖相比,指數法可用于多元化合物的聯合毒性預測,并使大量毒性數據最終以一個清晰、簡明的數字呈現,從而更受歡迎[71]。但是,指數法具有與等效線圖相似的缺點,其僅適用于具有單調劑量-效應曲線、EC50單指標即可用來確定整個作用區域的化合物。若混合物由數種劑量-效應曲線為U型或倒U型的組分構成,其聯合毒性將不能用指數法計算。

3.3 析因分析

為避免傳統實驗設計上的種種局限,研究者開始采用統計學方法研究化學混合物的聯合毒性。其中,析因分析是一種判斷多組分體系是否存在相互作用的定性方法,它可以同時觀察不同因子的作用,分析因子之間的相互作用,提供各化合物各濃度間的數學關系。與等效線圖和指數法不同,析因設計能夠分析獲得的所有數據點,并不要求提供各化合物精確的劑量-效應方程,因此可以提高試驗效率,更全面地利用實驗數據,減少工作量和實驗動物用量,得到高質量的結果[72-73]。采用析因分析研究聯合毒性的思路為:(1)獲得各組分的單一劑量-效應曲線；(2)選擇合適的濃度進行混合物析因設計(2水平2因子是最簡單的)；(3)通過雙因素方差分析并結合均數輪廓圖判斷混合物組分間有無交互作用。若估計邊緣均數輪廓圖中曲線互相平行,認為混合物各組分間表現為相加,兩條曲線互相遠離表示協同,曲線靠近或交叉為拮抗。例如,孫立偉等[33]利用析因分析研究了雌二醇、壬基酚、雙酚A所組成的二元混合物的雌激素作用,發現估計邊緣均數輪廓圖的所有線條基本平行,說明組分間不存在相互作用。這一方法也可以擴展到三元混合物的情況[74-75],以大幅度減少多組分、多組合、多濃度水平下混合物設計和毒性測試的工作量。

4 生物學和生理學模型(Biological and physiological models)

4.1 效應終點與混合物作用靶點和作用方式

在毒理學研究中,決定用什么生物進行暴露、暴露后檢測哪些指標,這些方面的考慮和研究何種類化合物或其混合物的毒性同樣重要。當生物體暴露在環境樣品中,各種化合物通過飲食、呼吸和皮膚進入機體和組織,通過血液、淋巴等組織液運輸達到靶位點。通過與相應的生物分子結合干擾正常生理過程。它們依次導致可逆的生理生化改變和不可逆的病理改變,并隨之產生病變、疾病和死亡。因此,作為環境混合物的作用對象,生物體是一個過于復雜的系統。化合物在不同機體層面上都可引起效應,有的還能在不同靶位點引起不同的效應,所以評價一個化合物毒性會有很多個測試終點可供選擇。

對同樣的受試物和同樣的測試生物,不同的毒理學終點具有不同的敏感性。例如,針對銅對布氏雙尾藻的生長抑制作用,Rijstenbil等[76]發現當所選擇的效應終點不同時會獲得不同的劑量-效應關系。也就是說,在給定的銅濃度下,親脂配體、有性繁殖、胞溶現象等效應終點會表現出強度不同的響應。而金小偉等[77]在評價壬基酚的生態風險時,選擇存活、生長、生化指標以及繁殖作為測試終點會使得實驗的靈敏性逐漸升高,相應使預測無效應濃度(predicted no effect concentration,PNEC)值逐漸降低。因此在毒性研究中測試終點的選擇是非常重要的,生物測試方法的開發也正在囊括越來越多的毒理學效應終點。

然而,污染物具有不同的致毒機制和作用方式。單一化合物進入生物體內都會引起不同位點、不同水平的反應,混合物、尤其是作用機制復雜的混合物導致的聯合效應將由于ToA和MoA的不同而更難以分析和預測。例如在一個復雜混合物中,有機污染物和重金屬離子組分對于生物體的作用靶點可能相差甚大,這大大增加了研究混合物毒性的難度。傳統意義上對于化合物急性毒性的分類相對簡單,主要是炎癥性損傷和反應性損傷；而當涉及慢性毒性或健康效應會讓聯合毒性研究舉步維艱。例如,多氯聯苯和對硫磷都是典型有機污染物,但它們的致毒機理分別是抑制免疫系統和抑制膽堿酯酶；而作為重金屬,鉛的作用位點是神經海馬細胞,鎘的主要作用位點是骨骼細胞,硒和鉈的主要作用位點則分別是膠原蛋白代謝和Na/K-ATP酶。在很多環境樣品毒性評價中,實驗人員把測試生物暴露在復雜混合物中檢測急性毒性。但由于存在眾多的致死途徑,導致結果復雜和無法解釋。例如,一項4種抗生素聯合暴露魚腥藻和綠藻的研究發現聯合毒性呈現出協同效應[78],但這一結果只針對此研究所用的混合物,這種結論對預測模型的開發和外推至人類的風險評估幫助有限。因此,為了解釋復雜混合物的效應,研究者已經把注意力轉到了基于作用機制的研究思路上。此時關注的重點是受體、作用方式和機理,而不是一種或一類化合物對整體動物或細胞的毒性。從這一角度,“改變攝入和排泄過程的化合物”、“抑制某特定酶的化合物”等概念會比“酚類”、“重金屬”更易于在聯合毒性領域進行分類和開展研究。在Groten等[15]的綜述里,“簡單混合物”被定義為10個或以下化合物的集合；但在新的框架下,它也許會表示包含了相同作用方式物質的混合物,因為它的組分之間不存在相互作用,討論起來相對簡單。隨著角度的變化,很多概念和思考方式都會不同。這個基本概念預示著未來的聯合毒性研究將更多側重于與毒理學研究同步[79]。在本實驗室最近發表的2篇文章中,也強調了基于相同作用方式和作用靶點研究聯合毒性的重要性[48,80]。

4.2 基于過程的研究框架:對危害指數的修正

近年來,系統毒理學方法越來越多地應用于相互作用的判斷和預測中。從生物學過程的角度看,相互作用會在3個層次上發生[62]:一是生物體外的相互作用,排放到環境中的大多數污染物都會與某些環境成分或互相發生作用,以改變暴露水平和最終被生物體吸收的量。例如土壤、沉積物顆粒對可溶性腐殖質的吸附和解吸,藥物和酸性物質影響金屬的生物可利用性等[81-82]。二是化合物在體內吸收、分配、代謝、排出(aborption-distribution-metabolism-excretion,ADME)過程中的相互作用(毒物代謝動力學)。當組分B改變組分A的攝入和/或消除,解毒或激活作用會發生,引起組分A在靶位點的濃度改變。如丙磺舒可通過降低青霉素的腎臟排泄加強其藥效,和鋅可通過降低鉛的吸收抑制鉛中毒[83]。三是靶位點的相互作用(毒物作用動力學)。如果混合物各組分和相同位點競爭或非競爭性結合,組分B的存在將會影響組分A和靶位點的結合,影響其毒性。例如,阿托品可通過結合乙酰膽堿受體位點拮抗有機磷的毒性,他莫昔芬由于可與雌激素競爭結合受體被用于雌激素陽性乳腺癌的治療。后兩個層次在聯合效應研究中更受重視,一些毒物代謝動力學和毒物作用動力學的修飾也被用來反映化學組份在體內的濃度變化和相互作用。因此,有研究者使用生理藥代動力學模型(physiologically-based pharmacokinetic model,PBPK)和證據加權法(weight of evidence,WOE)對危害指數HI進行修正,使基于濃度加和的HI成為基于相互作用的IbHI(Interaction-based HI),這也是結合相互作用描述聯合毒性的方法之一。兩者分別對機體內靶位點的暴露濃度和相互作用存在時相應的區別進行修正,從而使危害指數更接近實際情況。

在基于組分信息研究聯合毒性時,組分濃度、作用方式和作用強度等信息對開展評價都很關鍵。在離體毒性測試中,測試生物是細菌、真菌和細胞,因此一般默認暴露濃度即為靶位點濃度。但對于比較高等的生物體,化合物進入體內后要經歷復雜的ADME過程,直接用暴露濃度計算聯合效應會造成較大誤差,很不利于毒性評價和離體試驗結果的外推。由于靶位點濃度很難獲得,需要用暴露濃度或給藥量進行模型推導。PBPK模型就是建立在生理學和解剖學上的一種整體模型,研究化合物在體內如何分配,屬于毒物代謝動力學范疇[84]。與經典的房室模型不同,在PBPK模型中,生物體被看作一系列與組織和器官對應的隔室,以血液、淋巴液、膽汁等為傳輸工具連接[85]。每個隔室里的化合物濃度都被看作時間和暴露量的函數,從而可以計算[86]。它提供了化合物在血液和各個隔室里的濃度-時間關系,反映了物理參數的變化如何影響ADME過程,也表現出高濃度到低濃度、急性毒性到慢性毒性的可外推性[87],在化合物風險評估中有越來越多的應用[88]。有研究報道在高濃度混合物引起中央神經系統毒性時,經PBPK修正的危害指數比基于簡單濃度加和的危害指數更大[89]。這說明了在混合物風險評價中考慮多組分的藥代動力學相互作用的必要性。PBPK模型是一個分室模型,其對系統預測的置信度水平與分室的復雜程度有關。例如,即使分室到細胞水平,仍然沒有解決預測不同污染物進入細胞后與不同生物大分子之間的相互作用問題。

WOE是USEPA推薦的相互作用存下HI的修正方法[6]。它是一種基于經驗觀察和機理研究的定性判斷,可以在給定暴露條件下對相互作用進行分類和整理[40,90]。WOE把多組分化合物拆解成二元組合,通過判斷相互作用方向、毒理學作用機制、毒理學意義的重要性和其他修正因子將每個組合的相互作用信息轉化為用數字表示的權重,然后對HI進行修正。在一篇有關WOE應用的綜述文章里, 380個來自ATSDR文檔的二元混合物被按照上述3個方面分組并賦予相應權重[91]。例如,鋅和鉛的聯合作用表現為拮抗,其作用機制清晰,毒理學重要性強,此合物被歸入＜IA組。另一個例子是TCDD和p, p’-DDE的相互作用,p,p’-DDE的存在對TCDD并無影響,對其作用機制的了解不足,毒理學重要性較弱,因此屬于=IIIC組。然而,WOE的應用經常顯示出我們對二元混合物機理的了解遠遠不足。未來,實驗數據、專家判斷和計算機工具的結合將為WOE在混合物風險評價里的應用提供更好的支持。WOE方法是一個管理學方法,并不需要科學理論的支持。

4.3 動態能量平衡理論

如前所述,化合物進入體內會與多重位點發生作用,導致多種作用方式的影響。致死、生長抑制、干擾繁殖、致畸致癌,每一類效應都包含諸多測試終點可供進行生物測試。因此,測試終點的選擇始終是混合物毒性評價的重要問題,諸多測試終點的結果無法統一、難以外推也一直是研究者的思考重點。在此情況下,動態能量平衡(dynamic energy budget, DEB)理論的提出在一定程度上指出了聯合毒性研究的新方向。DEB是使用能量作為效應端點的研究方法。生物體從外界物質中獲得能量,之后這些能量被用于生長、成熟、繁殖等一系列生物過程。特定的生物對能量如何獲得和分配會保持一個特定的模式,但當暴露在有毒化合物中時,此分配過程就會受到干擾、甚至被破壞[92]。DEB把生命周期里的測試終點都綜合到能量上,以解釋為何混合物毒性能夠隨時間變化,并在不同測試終點有不同表現[93]。致死、半致死、生長繁殖等任何作用終點都與能量流相關,而任何毒物單獨或聯合作用都會擾亂能量的分配過程。因此,通過結合與時間相關的實驗結果、各種相互作用參數和不同測試終點的效應,我們就能解釋混合物組分的特定相互作用。在這個模型中,能量化身為國際通用貨幣,影響被認為是一個消費過程。

前文中2個無相互作用模型——濃度加和和效應加和都是數學模型,均將生物體看作黑箱,不關注作用方式和作用位點,針對不同的測試終點結果通常被分開解釋；PBPK和WOE具有很強的物種特異性,無法克服不同種群和個體間物理、化學、生化和生理參數的差異,導致外推困難。而作為毒物代謝動力學和毒物作用動力學的結合,DEB理論包含了各種與新陳代謝機制有關的參數,這樣的綜合分析方法在分析毒理學內在機理上是不可缺少的。在一項熒蒽和芘對大型溞不同測試終點的聯合毒性研究中利用DEB理論描述了4個維度(熒蒽濃度,芘濃度,時間,響應)和3種測試終點(存活率,體長,繁殖率)的信息,最終證明2種多環芳烴作用于相同靶位點,其混合物的聯合毒性表現為加和效應[94]。這是目前可以預測未經測試的化合物和暴露情境下聯合毒性的有限選擇。

5 展望(Perspective)

聯合毒性研究是一個極具挑戰性但又有很強的現實意義的課題。從20世紀上半葉至今,科學界在無相互作用模型的應用上收獲了許多有價值的數據；而近年來隨著對生物體作用位點和作用途徑的研究,又發展了一系列基于生物學和生理學的模型來將復雜問題簡單化。這些研究可以看作是一個良好的開端,但是尚沒有看到能夠解決實際問題的希望。

混合物研究的難點在于當環境復合污染體系的組分眾多,各組分濃度變化幅度巨大、且作用機理各不相同。同時,由于單一污染物可以作用于不同靶點、或通過靶點間是生物學交叉作用(cross-talk)來影響最終的效應。發展預測能力和外推能力更好的新方法和新模型是未來的研究方向。如前所述,目前的研究能夠證明在單一靶點或單一作用方式上的聯合毒性基本符合濃度加和原理,并已經廣泛應用于諸如二噁英類污染物的環境管理。因此未來的研究工作不僅需要研究復雜體系中各組分的相互作用,更需要了解這種相互作用的毒理學機制,認識混合體系中單個組分的作用方式,及其發揮聯合作用的過程機理。已經有很多研究者利用定量活性結構關系(quantitative structure-activity relationship,QSAR)模型預測未經過毒性測試的新型化合物的毒性,以此評價其在混合物中的聯合效應類型[95],這也成為聯合毒性研究極有潛力的分支之一。可以預期,環境組學、計算毒理學方法與靶向毒性測試技術的聯合應用、多學科知識的融合才可能會導致新的突破。

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Review on Methodology for Environmental Mixture Toxicity Study

Yang Rong1,2,Li Na2,Rao Kaifeng2,Ma Mei2,*,Wang Zijian2
1.Beijing Water Quality Monitoring Center for South-to-North Water Diversion,Beijing 100195,China
2.Key Laboratory of Drinking Water Science and Technology,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China

25 November 2015 accepted 8 January 2016

Both human and wild animals are simultaneously exposed to numbers of environmental pollutants,and via multiple exposure pathways.The adverse effect of single chemical could sometimes be ignored due to its low environmental concentration.However the effects of co-existing multiple chemicals could not be negligible because of the so-called“something from nothing”phenomenon.Therefore the joint toxicity of a mixture arouse to be a hot topic,especially on the additive and potential synergistic actions of environmental mixtures.A numbers of mathematical or biological models have been developed and applied to investigate the combined effects of environmental pollutants.In this review paper,widely used and newly emerging models were evaluated on their suitability to the circumstances,and the future challenges in toxicology of chemical mixture research and their applications in environmental management were discussed.

environmental mixture;combined effects;mode of action;model prediction

2015-11-25 錄用日期:2016-01-08

1673-5897(2016)1-001-13

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151125002

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自然科學基金重點課題(No.51290283)；自然科學基金青年基金(No.21307131)；國家高技術研究發展計劃項目(No.2014AA06A506)

楊蓉(1987-),女,博士,研究方向為水生態毒理學,E-mail:ygrg1987@gmail.com；

),E-mail:mamei@rcees.ac.cn

簡介:馬梅(1967—)，女，博士，研究員，博士生導師，主要從事水生態毒理學研究。