長期飼喂鈥對鯉魚非特異性免疫酶活性的影響

吳紅松

菏澤學院，菏澤274015

長期飼喂鈥對鯉魚非特異性免疫酶活性的影響

吳紅松*

菏澤學院，菏澤274015

以鯉魚為研究對象,進行為期60 d的飼喂試驗,研究了硝酸鈥對其非特異性免疫的影響。結果表明:與對照組相比,在實驗劑量范圍內,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)在肝臟中呈先升高后降低的趨勢, SOD、GSH-Px酶活性在20mg·kg-1時,升高顯著(P＜0.05),三者在65mg·kg-1時都被顯著抑制(P＜0.05)；在腎中都被誘導,在65mg·kg-1升高顯著(P＜0.05)。肝腎中丙二醛(MDA)含量都變化不顯著(P＞0.05)。抗超氧陰離子自由基、抑制羥自由基能力和單胺氧化酶(MAO)活性都降低,且在65mg·kg-1時降低顯著(P＜0.05或P＜0.01)。因此,在飼料中添加稀土元素鈥20、42、65mg·kg-1,能夠影響非特異性免疫力,且鯉魚肝組織比腎臟反應更敏感。

鈥；鯉魚；非特異性免疫

鈥屬于鑭系元素中的重稀土類,在地殼中的豐度為1.4×10-6。作為添加劑,廣泛使用于糧食、水果、蔬菜等作物上；應用在畜、禽和水產養殖上。但稀土畢竟不是動植物的必須元素,在生產養殖上的安全應用引起了人們的關注。

據報道,適宜濃度的稀土元素添加給植物,浸種可提高種子的發芽率[1],噴施甜瓜葉面可提高甜瓜果實品質[2],增強作物抗鹽漬、抗酸雨等脅迫的能力[3-4]。而高濃度添加則可抑制種子的萌發,降低甜瓜產量和品質,損傷水稻根系,抑制蠶豆幼苗生長。適量的稀土添加到飼料中,可以提高鯽魚血清中超氧化物歧化酶、溶菌酶的活性[5],顯著提高比目魚生長性能[6],增加虹鱒魚采食量、提高日增重[7],增加火雞體重,降低飼料轉化率[8],改善保育期仔豬生長性能[9],增加灘羊血液中白蛋白、血紅蛋白等的含量,抑制人體癌細胞的生長增殖[10-13]。但高劑量的添加會降低比目魚免疫力,降低灘羊血液中的有機成分的含量,損傷小鼠肝、腦細胞,降低其免疫功能,抑制小鼠精子的質量和數量[14-17]。目前發現,大鼠肝臟是稀土元素主要蓄積器官[18],肉牛的主要蓄積器官為肝、腎和肋骨[19],稀土元素均可以磷酸鹽形式損害機體細胞[20]。但關于單一稀土元素鈥在水產動物體內的效應機理的研究報道較少。

本文以硝酸鈥作為飼料添加劑飼喂鯉魚60 d,通過對鯉魚肝腎臟內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、單胺氧化酶(MAO)、抗超氧陰離子自由基、抑制羥自由基活性和丙二醛(MDA)含量的研究,從生物化學角度揭示稀土元素鈥對鯉魚非特異性免疫酶活性的影響,以期能為稀土在水產養殖方面安全應用,進一步機理研究和安全評估上,提供參考依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物及試劑

鯉魚,購買自菏澤市牡丹區養殖場,平均體重340.1～436.5 g。硝酸鈥(Johnson Matiney Company提供,分析純)。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗動物處理

實驗前,將硝酸鈥以20、42、65mg·kg-1的含量分別添加到基礎飼料中(參照中國稀土農用網發布的:魚類飼料中添加的稀土以50mg·kg-1為宜)[21],混勻,顆粒機成型,再烘干,作為實驗組鯉魚的餌料。實驗期間,鯉魚先在實驗室馴養2周(馴養期間無死亡),然后實驗設3個平行組,每組36尾魚,以飼喂基礎飼料的鯉魚作為對照組,玻璃缸(120×80×60 cm)養殖,水溫16～18℃,充氧過濾泵供氧(OD＞6mg·L-1),每天8時和16時各投喂1次,換水1次,每次換一半。自然光照下飼喂60 d(期間各組魚均未出現死亡)。

1.2.2 酶液的提取

每實驗組隨機取鯉魚6尾擦干,解剖,分離出肝腎臟。按組織質量與0.65%的生理鹽水體積之比為m(g):v(mL)=1:5,勻漿,4℃,4 000 r·min-1,離心15 min,取上清,4℃冰箱保存備用。

1.2.3 酶活性的測定

SOD、CAT、GSH-Px、MAO、抗超氧陰離子自由基活性、抑制羥自由基能力和丙二醛(MDA)含量的測定,均采用由南京建成生物工程研究所提供試劑盒,按照試劑盒說明操作,利用紫外分光法測出吸光值,根據公式計算出各樣本的酶活和MDA含量。

1.3 數據處理

利用SPASS軟件,求出平均值±標準差,并進行單因素方差分析(ANOVA),各實驗組與對照組之間的兩兩比較采用最小顯著差數法(LSD),取顯著性水平為0.05。

2 結果(Results)

從圖1可以看出,用含硝酸鈥飼料飼喂60 d后。隨著飼料中硝酸鈥含量的增加,鯉魚肝臟中的CAT活性先升高后降低,與對照組相比,在20mg·kg-1時,升高不顯著(P＞0.05)；在42、65mg·kg-1時,肝中CAT活性比對照組極顯著降低(P＜0.01)。但腎臟中的CAT活性卻不斷升高,在20、42mg·kg-1時,升高不顯著(P＞0.05)；在65mg·kg-1時,腎中CAT活性比對照組極顯著升高(P＜0.01)。

如圖2所示,隨著飼料中硝酸鈥含量的增加,與對照組相比,鯉魚肝臟中的SOD活性先升高后降低,在20mg·kg-1時,升高顯著(P＜0.05)；在42、65mg·kg-1時,顯著降低(P＜0.05)。但腎臟中的SOD活性卻不斷升高,在20、42mg·kg-1時,升高不顯著(P＞0.05)；在65mg·kg-1時,升高顯著(P＜0.05)。

如圖3所示,鯉魚肝臟中的GSH-Px活性隨著硝酸鈥劑量的升高呈現先升高后降低的趨勢。與對照組相比,在20mg·kg-1時,受到了顯著的誘導(P＜0.05)；但在42mg·kg-1時,GSH-Px的活性降低,但差異不顯著(P＞0.05)；在65mg·kg-1時,活力顯著低于對照組(P＜0.05)。但鯉魚腎臟中的GSH-Px活性隨著硝酸鈥劑量的升高而呈現不斷升高的趨勢,且在劑量為65mg·kg-1時,與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。

圖1 硝酸鈥對鯉魚肝腎CAT活性的影響注:*表示處理組與對照組差異顯著(P＜0.05)；**表示處理組與對照組差異極顯著(P＜0.01)。Fig.1 Effect of nitrate holmium on CAT activity in the liver and kidney ofC.carpioNote:*shows significant difference compared with control group(P＜0.05) **shows extremely significant difference compared with control group(P＜0.01).

圖2 硝酸鈥對鯉魚肝腎SOD活性的影響Fig.2 Effect of nitrate holmium on the SOD activity in the liver and kidney ofC.carpio

圖3 硝酸鈥對鯉魚肝臟GSH-Px活性的影響Fig.3 Effect of nitrate holmium on the GSH-Px activity in the liver and kidney ofC.carpio

圖4 硝酸鈥對鯉魚肝腎MDA含量的影響Fig.4 Effect of nitrate holmium on the content of MDA in the liver and kidney ofC.carpio

圖5 硝酸鈥對鯉魚肝腎抗超氧陰離子自由基活性的影響Fig.5 Effect of nitrate holmium on the scavenging effect of superoxide anion free radical in the liver and kidney ofC.carpio

如圖4所示,與對照組相比,硝酸鈥劑量在20、42、65mg·kg-1時,鯉魚肝、腎臟中MDA含量都有所降低,但與對照組相比,差異都無統計學意義(P＞0.05)。

如圖5所示,在鯉魚肝腎內抗超氧陰離子自由基活力隨著硝酸鈥劑量的升高,呈先升高后降低的趨勢,與對照組相比在20mg·kg-1時,都有所升高,但不顯著(P＞0.05)；在42mg·kg-1時,活力都有所降低,肝臟與對照組差異極顯著(P＜0.01),而腎臟差異不明顯(P＞0.05)；在65mg·kg-1時,都極顯著降低(P＜0.01)。

圖6 硝酸鈥對鯉魚肝腎抑制羥自由基能力的影響Fig.6 Effect of nitrate holmium on the inhibition of hydroxide free radical in the liver and kidney ofC.carpio

如圖6所示,與對照組相比,鯉魚肝、腎臟中抑制羥自由基能力隨著硝酸鈥劑量的升高都呈逐步降低的趨勢,且變化趨勢一致。抑制羥自由基能力在20mg·kg-1時,肝臟內顯著降低,腎臟降低不顯著(P＞0.05)；但在42、65mg·kg-1時,肝腎臟中都呈極顯著降低(P＜0.01)。

圖7 硝酸鈥對鯉魚肝腎MAO活性的影響Fig.7 Effect of nitrate holmium on the MAO activity in the liver and kidney ofC.carpio

如圖7所示,鯉魚肝腎臟中MAO活力都隨著硝酸鈥劑量的升高而降低,與對照組相比,在20mg·kg-1時,兩者都差異不顯著(P＞0.05)；在42mg·kg-1時,僅肝臟中差異顯著(P＜0.05),在65mg·kg-1時,腎臟中差異顯著(P＜0.05),肝臟中差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論(Discussion)

田蜜等[22]認為輕稀土元素進入生物體后主要累積于肝臟。Shinohara等[23]報道了鈥、鈰、鑭等12種稀土元素進入小鼠后主要分布在肝、腎等組織。崔麗卿等[24]認為稀土離子半徑較小,表現為硬酸性,容易與作為硬堿的氧結合,可以通過此機制清除活性氧。活性氧的數量與殺菌力存在相關性,是反映非特異性免疫能力的一項指標。申治國等[25]通過研究在0.01～0.5 mmol·L-1濃度下鈰對正常肝細胞和V79細胞內ROS濃度的影響,為低濃度稀土能清除機體內自由基提供了直接的依據。本文用含硝酸鈥飼料飼喂鯉魚60 d后,與對照組相比,鯉魚肝中的CAT、SOD、GSH-Px活性均隨飼喂劑量升高呈現低促高抑的特點,在飼料中硝酸鈥含量為20mg·kg-1時,CAT活力升高不顯著,SOD、GSH-Px均升高顯著；在42mg·kg-1時,CAT、SOD顯著降低,GSH-Px降低不顯著；在65mg·kg-1時,3種酶與對照組相比均顯著降低。這與汪承潤等[26]用鈥溶液給小鼠腹腔注射染毒后現象一致,發現SOD,POD和CAT 3種抗氧化酶活力在10～40mg·kg-1劑量范圍內,3種酶活力均隨劑量的增加而升高；在40～60mg·kg-1劑量范圍內,3種酶活力呈現下降趨勢,表現出“低促高抑”的效應的結果一致。同時也與廖紅艷等[27]發現的低劑量的鑭對小鼠肝臟中谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性表現出激活作用,高劑量表現出抑制作用的結果相一致。郝述霞等[28]研究發現,低劑量稀土可抑制過氧化,高劑量可促進過氧化。劉穎等[29]以“長樂”和La(NO3)3灌大鼠胃6個月后也發現,低劑量均能抑制自由基的產生,提高肝組織中SOD、谷胱甘肽過氧化物酶的活性。腎臟中 CAT、SOD、GSH-Px活性呈逐步升高的趨勢,在65mg·kg-1時升至最大,且均與對照組相比差異顯著。可見,與腎臟中酶活性相比,肝臟對硝酸鈥劑量的增加更加敏感。這與黃可欣等[30]給昆明小鼠胃灌La(NO3)3后腎臟中GSH-Px較對照組顯著升高相似。這可能是由于鈥離子與鯉魚肝腎組織內過氧化物的配位結合阻止了自由基的生成,也可能是鈥離子通過與生物體內氧自由基的磁相互作用掩蔽自由基阻止單電子傳遞[31]。可見,稀土的抗氧化作用是通過其與自由基的相互作用以及增強抗氧化酶的活性來實現的。

環境脅迫誘發的活性氧自由基傷害生物膜的過程中,最重要的脂質過氧化產物是MDA,它是一種高活性的脂質過氧化物,能交聯脂類、核酸、糖類及蛋白質,也可使蛋白質的SH基氧化。在實驗劑量范圍內,與對照組相比,鯉魚肝腎中MDA含量均差異不顯著。與鞏菊芳等[32]發現的長期飲用不同劑量三硝酸鈥溶液對大鼠肝、腎中MDA含量無明顯變化的結果一致。這表明在20～65mg·kg-1劑量范圍內,不會使鯉魚肝腎細胞膜發生脂質過氧化,可能是由于鈥離子結合細胞膜,使其免受了自由基的氧化作用。這與劉湘陶等[33-34]研究的多種稀土離子對細胞膜脂質過氧化有較強的抑制作用的結果相似。

生物體內的氧自由基通過酶促反應,膜電子傳遞泄露,自動氧化不斷產生包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等,其中最主要、最具破壞性的也最具破壞性的是羥自由基。實驗中鯉魚抗超氧陰離子自由基能力,與對照組相比,均在劑量為20mg·kg-1時有所升高,在42mg·kg-1時,肝臟呈極顯著降低,而腎臟降低不明顯；在65mg·kg-1時,肝腎內均降低極顯著。肝腎中抑制羥自由基能力,隨著飼料中硝酸鈥含量的增加而顯著降低,且與對照組相比,在42、65mg·kg-1時,都下降極顯著。可能是鈥離子清除鯉魚體內多余的OH-,O2-自由基,使肝腎細胞中抗超氧陰離子自由基、抑制羥自由基能力降低。肝腎中抗超氧陰離子自由基能力沒有抑制羥自由基能力的降低的顯著,可能與鈥離子與不同自由基的相互作用強弱有關。

單胺氧化酶(MAO)是一類黃素酶,廣泛分布于生物體內各組織器官,尤以肝、腎等組織內含量最多,主要參與生物源氨代謝,能夠催化多種結構的胺類[35]。MAO變化可提示機體肝腎組織的損傷,尤其肝受損時MAO活性明顯升高。本文鯉魚肝臟中MAO在劑量為20mg·kg-1時,升高不顯著；在劑量為42mg·kg-1時,顯著降低,在65mg·kg-1時,降低極顯著。而鯉魚腎臟中MAO隨鈥濃度升高而不斷降低,在劑量為65mg·kg-1時,降低顯著,表現出一定的組織差異性。可見,一定濃度的鈥離子可能通過與自由基相互作用,降低了機體中MAO活性,從而減少胺代謝產物對肝腎組織的損傷作用。

綜上所述,在添加劑量范圍內,飼料中添加的硝酸鈥影響了鯉魚非特異性免疫力的酶活性。隨飼喂劑量升高,肝中的CAT、SOD、GSH-Px活性均呈現低促高抑的特點,腎中的CAT、SOD、GSH-Px活性呈逐步升高的趨勢,抗超氧陰離子自由基能力、抑制羥自由基能力在肝腎中均顯著降低。一定劑量鈥離子具有清除自由基能力,且表現出一定組織差異性,相同劑量下,肝比腎更為敏感[36]。肝腎中MDA含量都變化不顯著,MAO活性的降低,表明添加劑量范圍內的硝酸鈥,不會對肝腎細胞膜造成脂質過氧化等組織損傷。稀土元素的這種影響機制究竟是什么,還有待進一步深入研究。

致謝:本文得到了山東省菏澤學院張貴生副教授、朱道玉教授等的辛苦協助，在此表示感謝。

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Effect of Holmium on the Activities of Nonspecific Immune Enzymes in Cyprinus carpio

Wu Hongsong*
Heze University,Heze 274015,China

5 November 2015 accepted 24 December 2015

In order to investigate the effects of nitrate holmium on innate immune response ofCyprinus carpio(C. carpio),a 60-day period of feeding trial was conducted.The result showed that,with the increasing of nitrate holmium,the activities of catalase(CAT),the superoxide dismutase(SOD)and the glutathione peroxidase(GSH-Px)in the liver were all increased first and then decreased.In the liver,the activities of SOD and GSH-Px were induced significantly when the concentration of nitrate holmium was 20mg·kg-1(P＜0.05),while the three enzymes mentioned above were significantly inhibited in the group including 65mg·kg-1nitrate holmium(P＜0.05).Additionally, the activities of the three enzymes in the kidney were all induced remarkably when the dose of nitrate holmium was 65mg·kg-1(P＜0.05).Both in the liver and kidney,the malonaldehyde(MDA)appeared little changes(P＞0.05)in the range of experimental concentrations.The activities of monoamine oxidase(MAO),the scavenging effects of hydroxyl and the superoxide anion free radical in the liver and kidney were all decreased,especially in the group including 65mg·kg-1nitrate holmium(P＜0.05 orP＜0.01).These results suggested that the addition of rare-earthelement holmium to the feed could significantly affect the immunity ofC.Carpio in the range of experimental concentrations and the liver was more sensitive to holmium than the kidney.

cerium;C.carpio;innate immunity

2015-11-05 錄用日期:2015-12-24

1673-5897(2016)1-375-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151105002

吳紅松.長期飼喂鈥對鯉魚非特異性免疫酶活性的影響[J].生態毒理學報,2016,11(1):375-381

Wu H S.Effect of holmium on the activities of nonspecific immune enzymes inCyprinus carpio[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):375-381(in Chinese)

山東省教育廳科研發展計劃項目(J08LF54)；山東省動物生理生化與應用重點實驗室資助

),E-mail:hellowhs@163.com

簡介:吳紅松(1977-)，女，山東省菏澤市人，碩士，講師，研究方向為動物學。