OECD魚類生物蓄積測試的優化策略研究

楊婧，劉敏，趙華清，鄧蕓蕓，王綠平，張京佶，殷浩文

上海市檢測中心，上海201203

OECD魚類生物蓄積測試的優化策略研究

楊婧，劉敏，趙華清，鄧蕓蕓，王綠平，張京佶，殷浩文*

上海市檢測中心，上海201203

作為化學品風險管理中的重要環境行為參數,生物蓄積性不僅是分類、標簽、評價和控制環境風險的基本指標,也是鑒別化學物質持久性和環境危害性的重要標準。2012年OECD頒布了新的生物蓄積測試方法,由此給生物蓄積優化策略帶來了全新的挑戰,原有的判別優化策略的方法需要作出新的發展與調整。針對新生物蓄積測試方法引發的優化策略挑戰,通過層次研究及文獻分析,歸納了基于OECD新305生物蓄積測試標準的優化測試策略,為優化、簡化測試及化學品安全管理提供了科學基礎。

魚；生物蓄積；優化策略

目前,國際上主要采用的標準方法有經濟合作與發展組織(OECD)的生物蓄積測試標準(OECD 305)、美國環境保護署(USEPA)1996年頒布的測定魚類 BCF的指南草稿[1]以及美國試驗材料協會(ASTM)2013年頒布的與OECD方法相似性極高的識別魚類和海洋軟體動物中生物富集性的標準[2],使用最廣的為OECD 305標準,我國的化學品測試、評價與管理也主要依據OECD標準。

近35年間陸續頒布了3個不同版本的OECD 305標準,1981年版[3]及1996年版[4]與USEAP和ASTM標準類似,均以水暴露方式下的生物富集因子(bioconcentration factor,BCF)評價蓄積性。2012版OECD新305[5]標準則有較大變化,將更多動物福利、簡化試驗和節約成本的考慮體現在標準中,率先引入了攝食暴露這一不同暴露層面的生物蓄積測試方法,實驗室獲取BMF(生物放大因子,biomagnification factor)值也首次作為測試及評價終點列入標準。

新305標準的變化與發展,為盡可能多地獲取化學品的生物蓄積數據提供了可能,同時,也給測試策略的優化及化學品安全管理帶來了新問題及挑戰。現有的魚類生物蓄積性評估策略[6-11]均僅針對水暴露體系,尚無攝食暴露的優化策略。并且,上述策略均以“3R”原則為出發點,涵蓋非試驗方法、替代試驗及動物試驗等不同層次,未涉及測試技術層面的細化策略。因此,基于新305標準的測試技術層面的優化、不同暴露層面所獲結果的評價與應用等諸多技術細節仍需明確。

針對上述問題與挑戰,通過層次研究及文獻分析,研究了生物蓄積性測試及評估主要流程中的技術細節及關鍵影響因素,明確了OECD新305方法技術操作層面的細化策略及替代評估方式的使用,歸納了基于OECD新305標準、側重于測試技術層面的生物蓄積性評估策略,為優化、簡化測試及化學品安全管理提供了科學基礎。

1 前期數據的收集、分析與利用

蓄積性評估前的已有信息收集、分析及利用,對測試的優化及豁免具重要意義。GLP實驗室獲取的可靠試驗數據為前期數據的首選,還可參照Klimisch原則[12]對其他試驗數據的可靠性進行評價。此外,類似物的試驗數據、物質/類似物的軟件預測數據也具一定的參考性。

1.1 物質理化數據

需了解分子式及結構(如可能)、純度、組分、辛醇水分配系數(Kow)、溶解性、穩定性(如揮發性、光解、水解及降解性)、吸附性等數據。logKow小于3或具有快速生物降解性的物質或組分,可直接豁免生物蓄積測試(見圖1)。此外,上述信息有助于初步測試方案的形成,如具一定吸附性的物質,水暴露時可考慮容器的預飽和,或與揮發性或水溶解度極低的物質一樣,考慮攝食暴露。

應注意,分子量、分子尺寸、Kow及溶解性等參數對化學品的蓄積行為有重要影響[13-15],可用于蓄積性預測及測試方案優化,但對于logKow≥3的物質,上述參數作為生物膜透性及豁免蓄積測試的依據仍需科學驗證。由不斷更新的文獻可知,這些參數的生物膜透性/蓄積性判定臨界值仍在不斷修正與完善,尚未形統一標準[6,11,16-22]。隨著研究深入,不斷發現蓄積性與logKow相關性較低的物質(如多氯聯苯類等)[23],建立在BCF與logKow間關系基礎上的預測模型仍需根據日益增加的實驗數據不斷修正和調整。

1.2 物質的生物毒性及其他生物數據

毒性效應可能改變或影響受試生物的常規生理功能(如呼吸速率)而產生不可靠的BCF值,故生物毒性數據如魚類急性毒性試驗的LC50或長期試驗的LC50、NOEC或LOEC等為試驗濃度設計的重要信息。

一般認為,不能很快代謝轉化的物質可能具生物蓄積潛能。模型研究認為,代謝率相對低的物質,即使具極強的疏水性(lgKow＞6),仍有可能極大影響蓄積性[24]。因此,在蓄積測試中了解物質的代謝信息,有利于試驗結果的解釋。具有一定代謝性的物質,可依其代謝程度選擇豁免、簡化或優化試驗(見本文3)。

2 OECD新305標準中技術細節的不確定性與測試策略研究

標準中整合了完整水暴露、簡化水暴露及攝食暴露等3種試驗,從不同試驗方法及暴露方式的大致適用范圍和操作原則可知,不同試驗方法/暴露方式的選擇和使用并無絕對界限,仍存在技術細節上的不確定性。通過項目研究,逐一分析并明確了這些技術細節,形成了側重測試層面的生物蓄積性評估策略(見圖1)。

2.1 水暴露及攝食暴露方式的比較及選擇

標準中不同暴露方式的選取主要依據為操作的難易程度,認為水暴露適用于logKow在1.5至6之間的多數物質,也可能適用于logKow＞6的物質,實際操作中,強疏水性物質(logKow＞5且水溶解度低于0.01～0.1mg·L-1)水暴露與水溶液化學分析的難度大大增加,故可考慮攝食暴露。但操作難易程度的衡量并無統一標準,尤其2種暴露方式均滿足要求時如何選取,標準并未明確。

針對上述問題,比較了含雌二醇(E2)、二甲苯麝香(MX)及六氯苯(HCB)在內logKow4.0～6.1的物質水暴露及攝食暴露的結果:吸收階段,水暴露下的魚體吸收速率k1均高于攝食暴露魚體的吸收速率,物質更易在魚體達到吸收穩態。鎳、鉈的黑頭軟口鰷生物蓄積研究[26]、多溴聯苯醚(logKow5.9～10)對鉤蝦[27]及雌二醇對金魚的生物蓄積研究中[28]均發現相同的結果。

標準規定了攝食暴露的周期且未強制規定應達到物質的吸收平衡,因此,在有限的暴露周期內,攝食暴露獲取的動力學 BCF(kinetic bioconcentration factor,BCFK)值很可能低于該物質水暴露下的BCF值。綜上,認為試驗操作及分析方法的精度滿足試驗要求、物質水暴露濃度能維持穩定時,應優先考慮水暴露方式。無法滿足水暴露試驗條件或疏水性極強、水暴露無法在60 d內達到一定體內濃度的物質,可考慮攝食暴露。

2.2 簡化水暴露與完整水暴露方法及選擇

標準中水暴露試驗有常規水暴露及簡化水暴露2種,后者以簡化的小型試驗(如減少取樣點等)取代完整水暴露試驗獲取BCF數據。滿足水暴露條件并可預測物質吸收及清除符合一階動力學、logKow小于6或可能快速代謝的物質,通過簡化水暴露有可能直接獲取科學的BCF數據。

為進一步簡化、優化水暴露試驗,標準提出BCF值可能不受暴露濃度影響時(如高、低濃度BCF差異小于20%時),可僅設1個試驗濃度組。標準還指出水暴露最初為非極性物質設計,此類物質通常設1個試驗濃度即可。研究了logKow值在0.53～4.51之間不同物質的水暴露結果后發現:通常認為的非極性物質(logKow＞3的物質)[18,19],高、低濃度組間的結果差異最高可達1個數量級。可見,以常規的極性判定標準(logKow＞3)作為水暴露試驗僅設1個試驗濃度的依據并不充分。尤其在對物質信息知之甚少時,僅設1個試驗濃度需慎重。

標準認為開展前期試驗可能利于確定簡化水暴露適用性,在簡化水暴露試驗中還指出:有時以超過1個濃度的簡化水暴露試驗作為前期試驗確定BCF值是否受暴露濃度影響可能更具優勢。可見,在對物質信息了解較少的情況下,需開展1個以上濃度的前期試驗或簡化水暴露試驗確定簡化水暴露適用性及濃度對BCF的影響。如開展前期試驗,整個試驗周期將長于單次試驗。如簡化水暴露不適用、簡化水暴露中任何跡象表明物質與預測表現不同(如明顯偏離一級動力學)、獲得的動力學BCF值(BCFKderived from a minimised test,BCFKm)小于穩定階段BCFSS的70%、簡化試驗的BCF值(BCFKm,BCFKm略小于BCFSS時用BCFss)超過500等,仍需進行完整水暴露試驗。綜上,物質信息了解有限時,從科學性與試驗成本、周期和受試生物用量的角度綜合權衡,直接進行1個以上濃度的常規水暴露試驗更為可行。

此外,水暴露試驗通常不推薦使用溶劑或分散劑,這類物質可能增加試驗水中的有機碳含量進而顯著影響流水試驗中自由溶解物質的量,具快速生物降解性的溶劑(如丙酮)還可導致流水體系中細菌滋生。但溶解度極有限的物質(如低于0.1mg·L-1),使用助溶物質可能有助于獲取水暴露所需的試驗貯備液,但應注意,溶劑用量不可超過臨界濃度(100mg·L-1或0.1 mL·L-1),不應顯著改變受試物在試驗體系中的溶解度(如顯著高于其水溶解度),當魚體對受試物生物利用度一定的時候,高于實際溶解度的試驗濃度往往會導致錯誤的低估BCF值。

2.3 攝食暴露與結果判定

攝食暴露可避開水暴露中需面對的一些困難,包括在水暴露體系中各組分水溶性各異的多組分物質,但其測試終點為BMF,與水暴露終點BCF不具有直接可比性,并且,現有標準及相關管理法規中均未明確如何使用實驗室獲取的BMF值進行生物蓄積性判定。

野外數據的生物蓄積性判定標準通常為BMF＞1,但野外的BMF數據往往受水及攝食暴露雙重暴露的影響,與標準試驗條件下單純通過攝食途徑獲取BMF值存在一定差異。有研究[28]比較了實驗室條件下鯉魚在9種低水溶性化學品暴露下脂肪校正后的BCF值(BCFL值)和BMF(BMFL值),除鄰三聯苯外(BCFL為810),其余物質的BCFL均超過1 000,管理上判定為具有生物蓄積性,但僅六氯苯及4,4'-亞甲基雙(2,6-二叔丁基苯酚)的BMFL超過1,其余的BMFL值僅在0.03至0.4之間。綜上,管理上如對實驗室BMF值繼續沿用BMF大于1的判定依據可能會低估一些物質的生物蓄積性。

圖1 魚類生物蓄積優化評估策略Fig.1 The optimized strategy for assessment of fish bioaccumulation

目前,尚無較系統的大數據研究建立實驗室BCF值與BMF值的關聯。因此,現階段攝食暴露試驗中,可嘗獲取動力學BCF值(BCFK),該數據有助于當下的化學品安全管理對物質蓄積性的判定。但應注意該數據適用于物質吸收或清除符合一級動力學方程的情況,并且需通過證據權重法衡量相關參數的適用性后方可用吸收速率常數k1估算BCF。隨研究深入,通過數據積累建立實驗室BCF數據與BMF數據間的關聯后,有望明確并細化實驗室BMF數據的蓄積性判定并運用于化學品的安全管理。

攝食暴露并非水暴露困難時的萬能解決方案,該方法受餌料處理溶劑、餌料加標技術、定量化學分析方法以及相應的前處理方式等因素的限制。當水及攝食暴露均無法滿足生物蓄積性評估要求時,可考慮其他替代評估方式(見本文3)。

2.4 化學分析方法的選擇與方法適用性、精確度及準確性評價

化學分析技術及分析數據的質量直接影響暴露方式的選擇及試驗結果的準確性。標準指出分析方法需有適用性、精確度及準確性,但未列出判定依據,僅指出試驗前期應建立化學分析方法并獲得較高的回收率(比如,通常大于85%)。

通常,蓄積試驗要求分析的樣品涉及試驗用水、魚體和餌料3種成份差異較大基質,針對物質的不同,需采用不同的前處理方法。對于餌料和魚體等相對復雜的基質,往往需增加必要的凈化過程,常用有凝膠滲透色譜和固相萃取等。前者簡單、自動化程度高,對蛋白質等大分子基質的凈化作用較好,但對極性小分子化合物的凈化能力不明顯。后者可根據各物質的特性,針對性地選取凈化柱、靈活選取各種試劑達到較好的凈化效果,但過程復雜,目前自動化有限,需要操作者具有較好的專業背景。因此,分析方法的選擇,需要在科學性及可操作性之間尋求平衡。

研究選取了10種logKow在0.53至6.2之間溶解性、揮發性及蓄積性各異的代表性物質,分別建立相應基質體系中的分析方法。涉及液相/氣相色譜、液相/氣相色譜-質譜等儀器分析手段,包括直接分析和液液萃取、加速溶劑萃取、超聲萃取、固相萃取、凝膠凈化等多種常規前處理方法,實現了不同介質中化學物質的特異性分析及高靈敏度檢測。上述研究給出了分析方法適用性、精確度及準確性的基本評價依據:

(1)相關系數:氣相色譜和液相色譜分析,相關系數R≥0.99；氣相色譜-質譜和液相色譜-質譜分析,相關系數R≥0.95。

(2)回收率:方法的平均回收率范圍 70% ～120%,理想狀態為80%～110%。難分析樣品,在精密度可接受范圍內,可允許更低的回收率。

(3)精密度:通常,精密度RSD≤20%。特殊條件下,可接受更高的精密度值。

2.5 多組分物質生物蓄積性的簡化測試思路

多組分物質一直是生態毒性測試中的難點。這類物質在試驗前期可供試驗設計參考的信息往往較少,難以像單一物質一樣在早期形成簡化/優化方案。組分明確的多組分物質,可從其lgKow＞3、不具生物降解性組分的水溶性及其水溶液穩定性的角度綜合考慮,選擇合適的試驗暴露方式；組分不明的物質,如有合適的水暴露體系的制備及分析方式,仍可嘗試水暴露,反之,則采用餌料暴露方式以避免不同組分水溶解性各異給定量分析帶來的困擾。測試中,化學分析方法的適用性及靈敏性起著關鍵作用,為對多組分的物質的蓄積測試進行優化,可在試驗前期進行包括水、餌料或溶劑中的物質穩定性在內研究以便優化試驗設計。

2.6 生物蓄積測試結果的重要影響因素及控制

除試驗方法/暴露方式選擇和化學分析技術(見本文2.5節)外,試驗魚種的內在生物學特性也是蓄積性結果的重要影響因素。

不同的物質在魚體組織中的濃度分布狀況差異較大:不同抗生素因作用模式不同,在肌肉、消化組織、魚膽、血漿及肝臟等不同部位均可能存在顯著生物蓄積[14,21]。鎘[22]在腎臟中的生物蓄積性大于肝臟、腸道、鰓及肌肉等組織,而卡馬西平[29]及有機氯[30]則顯著蓄積在不同魚種的肝臟中。因此,在選取特定組織(如肌肉或肝臟)進行濃度分析前需對物質的組織分布有一定程度了解,選取代表性組織。對于小型魚,取全魚進行分析有利于獲取真實、準確的生物蓄積性數據。

不同研究中物質的魚體含量與性別的關系各異,有研究表明不同性別魚體中銅[31]、鎘[32]和汞[33-34]的含量有顯著差異,也有研究表明鉛、汞、鎘和砷的魚體含量與性別無關[35]。多氯聯苯(PCBs)的生物蓄積研究[36]中也發現PCBs在肌肉中的濃度無顯著性別差異,但雄魚的PCBs濃度隨魚齡增加而增加,且在生命周期各階段均有顯著差異,而雌魚的PCBs濃度則始終維持在一恒定水平。推測這種差異是雌魚和雄魚的生長速率及能量(食物攝入)需求不同所致。此外,雌魚可能通過產卵將體內的PCBs濃度部分轉移。魚齡60 d至150 d的稀有鮈鯽及斑馬魚雌、雄魚的差異研究也證實了上述推測,90 d日齡的稀有鮈鯽雌、雄成魚體脂有顯著差異。此外,雌魚的體脂含量與體重相關性較好,而120 d以上雄魚可能因精巢發育成熟后營養分配變化的原因致使體脂含量反而下降；性腺發育階段120 d和150 d的斑馬魚雌、雄魚體重差異顯著。綜上,可知性別對蓄積性影響的實質為不同性別的魚(或處于生育階段不同性別的魚)生長速度、對能量的需求量各異致使體重、體脂等出現明顯差異所致。因此,雌、雄個體差異較大的魚種應盡量避免雌、雄魚混用的測試方式；雌、雄個體差異較小的小型魚種,繁殖期前、個體差異較小階段,可混用進行測試。

物質的潛在生物蓄積性一般與其親脂性有關,其BCF/BMF或在魚體內濃度與脂肪含量有良好的正相關性[37,38]。相同魚種及不同魚種間因脂肪含量導致的BCF差異可達2至5倍[38-39]。因此,試驗期間魚體脂肪含量變化較大或使用自身脂肪含量較高的魚種,脂肪校正非常必要。此外,暴露期間,可能存在因試驗魚生長、體重增加而導致物質在單位魚體濃度降低的生長稀釋現象,這種偽清除的過程致使過高估算k2(清除速率常數；d-1)從而低估動力學BCFk或BMFk。故可通過生長-校正清除速率常數(k2g)計算生長-校正生物放大因子或在在計算k2時以每尾魚(整尾魚為基礎)所含化學物質的質量數據替代濃度數據以降低或避免生長稀釋對結果的影響。近期一項不同魚種甲基汞生物蓄積的大樣本(約2 538個)調查發現,對不同體重、體長魚進行標準化數據處理后,雌、雄魚體內的甲基苯含量無顯著性差異[40]。二甲苯麝香(MX)的稀有鮈鯽、斑馬魚及虹鱒(rainbow trout)的攝食暴露、六氯苯(HCB)的稀有鮈鯽、虹鱒及鯉魚幼魚攝食暴露,也發現經生長及脂肪校正后不同魚種的BMFg(生長-校正生物放大因子)和BMFL(脂肪-校正生物放大因子)無顯著差異。因此,為進一步減少個體差異對結果的影響,有必要對BCF/BMF結果進行生長及脂肪校正。

圖2 生物蓄積性評價中的代謝研究策略Fig.2 The strategy of metabolism study during the assessment of fish bioaccumulation

3 生物蓄積性測試及評估的優化與替代評估方式

在測試前期或同期開展魚體代謝研究有利于生物蓄積性評估的優化。獲取代謝信息的途徑有2種:(1)現有數據(包括已有的毒代動力學數據)收集、分析、文獻檢索或軟件預測等；(2)在蓄積試驗前期或試驗期間開展代謝相關的試驗研究。可借鑒藥物代謝的研究手段,開展組織、細胞或亞細胞水平的體外或體內研究[41-45],還可從細胞響應、分子及蛋白水平的反應中篩選識別出與代謝相關的生物標識[46],揭示物質在魚體中的代謝性。根據物質的代謝信息,豁免、中止或優化蓄積測試(見圖2)。

對于受限于自身性質、試驗條件等、難于開展生物蓄積測試的物質,可采用軟件/模型預測(如生物蓄積性或毒代動力學軟件/模型)、替代試驗評估(如一些公認度較高的體內或體外評估方式)或文獻調研等方式獲取生物蓄積性的評估數據。

4 結論與展望

針對現有策略中測試層面及OECD新305標準中的技術不確定性進行研究,明確了物質(含多組分物質)不同試驗方法/暴露方式的選擇及優化測試原則:建議在可能的情況下,先考慮水暴露方式；前期信息較少時,直接進行1個以上濃度的完整水暴露試驗；攝食暴露時,通過獲取BCFSS或提供BCFK值(如適用)為現階段的化學品分類及安全管理提供參考；明確了以分析方法標準曲線的線性相關系數、回收率和精密度評價方法適用性、精確度及準確性的方式及原則；為獲取更準確的結果,建議選取代表性組織或全魚(小魚)進行化學分析,對BCF/BMF結果進行生長和脂肪校正。建議引入代謝研究以簡化、優化或豁免試驗,對于難于開展生物蓄積測試的物質,采用替代性評估方式獲取蓄積性信息。通過上述研究及文獻分析,形成了基于OECD新305標準的涵蓋前期數據收集、分析與利用,生物蓄積優化測試策略,代謝性研究及替代評估方式等內容的魚類生物蓄積優化評估策略。

隨著后續研究的深入及數據的積累,還可對策略中的以下方面進行更為細化的補充:

(1)通過在攝食暴露中同時報道 BCFK或BCFSS,或通過對更多物質進行實驗室條件下的BCF與BMF比較研究,建立BCF與BMF數據間可靠性較高的轉化關系,實現實驗室BMF數據直接用于化學品的分類管理；

(2)開發科學性及操作性較好的代謝評價方法,為生物蓄積測試的豁免、簡化、優化或結果解釋提供科學依據；

(3)建立穩定性、重復性及通用性較好的生物蓄積性體外替代評價體系,為無法通過OECD新305方法獲取數據的物質的生物蓄積性評價提供較為可靠的數據支持。

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Study on Optimized Strategy of Fish Bioaccumulation Test Based on the OECD Guideline

Yang Jing,Liu Min,Zhao Huaqing,Deng Yunyun,Wang Lvping,Zhang Jingji,Yin Haowen*
Shanghai Academy of Public Measurement,Shanghai 201203,China

11 January 2016 accepted 5 April 2015

As one of the main parameters of environmental behavior in risk assessment,bioaccumulation is important to the classification,labeling,assessment and environmental risk control of chemicals,and it is also a criteria for identifying persistence and hazard of chemicals.A new OECD test guideline of bioaccumulation in fish,which was adopted in 2012,has brought new challenges to optimized strategy of bioaccumulation test.In this situation,a new test strategy should be developed and refined.An optimized strategy of bioaccumulation based on the new test guideline was studied based on analytic hierarchy process and literature research.Different from the traditional one, the suggested strategy focuses more on the testing levels,and provides a scientific basis for the optimization and simplification of bioaccumulation test as well as chemical safety management.

fish;bioaccumulation;optimized strategy

2016-01-11 錄用日期:2015-04-05

1673-5897(2016)1-117-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20160111003

楊婧,劉敏,趙華清,等.OECD魚類生物蓄積測試的優化策略研究[J].生態毒理學報,2016,11(1):117-125

Yang J,Liu M,Zhao H Q,et al.Study on optimized strategy of fish bioaccumulation test based on the OECD guideline[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):117-125(in Chinese)

環保公益性行業科研專項(2013167028):化學品富集環境行為參數測試技術研究

楊婧(1982-),女,工程師,研究方向為生態毒理學,E-mail:yangj@apm.sh.cn；

),E-mail:yinhw@apm.sh.cn

簡介:殷浩文(1959—)，男，教授級高級工程師，主要研究方向為化學品生態風險評價及生態毒理學，發表學術論文40余篇，專著及合著6部。