5種鹵代乙酰胺類消毒副產物對小鼠淋巴瘤細胞Tk基因致突變性研究

袁婷婷，王新亮，董慧峪

1.北京醫院檢驗科，北京100730

2.天津市城市規劃設計研究院，天津300201

3.中國科學院生態環境研究中心，北京100085

5種鹵代乙酰胺類消毒副產物對小鼠淋巴瘤細胞Tk基因致突變性研究

袁婷婷1，王新亮2，董慧峪3,*

1.北京醫院檢驗科，北京100730

2.天津市城市規劃設計研究院，天津300201

3.中國科學院生態環境研究中心，北京100085

鹵代乙酰胺類(HAcAm)消毒副產物(DBPs)是飲用水中新興含氮類DBPs之一。為探究HAcAms的致突變性,選擇小鼠淋巴瘤細胞作為受試細胞,分別考察了一氯代乙酰胺、二氯代乙酰胺、三氯代乙酰胺、一碘代乙酰胺、二碘代乙酰胺(DIAcAms)共5種HAcAms對小鼠淋巴瘤細胞Tk基因突變的影響。結果表明,在0.05～20μmol·L-1暴露濃度下,5種HacAms類DBPs對小鼠淋巴瘤細胞呈現出一定的細胞毒性,隨著暴露濃度的升高,細胞毒性增強。暴露4 h后,5種HacAms中只有DIAcAms呈現出顯著的致突變性(暴露劑量高于5μmol·L-1),且以小集落為主。上述研究結果為研究HacAms對哺乳動物細胞的致突變作用提供了基礎數據。

鹵代乙酰胺；小鼠淋巴瘤細胞；突變分析

飲用水消毒副產物(DBPs)是飲用水加氯消毒過程生成的微量污染物。部分DBPs對人或哺乳動物具有致癌、致畸形、致突變“三致”作用,三者之間緊密聯系,其中突變包括基因突變和染色體畸變,是癌癥和畸形產生的重要危險因素。基于DBPs在飲用水中檢出率、檢出水平和毒理學研究結果,世界衛生組織、美國環境環保署分別對飲用水中的14種、11種DBPs提出限量控制要求,我國《生活飲用水衛生標準》也將13種DBPs納入控制范圍(包括三鹵甲烷類、鹵乙酸類、鹵酸鹽、鹵乙腈等)。近年來隨著污染物解析技術的發展和毒理學研究的深入,發現未受控DBPs可能對人體健康造成危害的風險更大,由此未受控DBPs日益受到關注。

作為一種新型的鹵代含氮DBPs,鹵代酰胺類(HAcAms)DBPs已在歐美國家得到廣泛重視[1]。一氯乙酰胺(CAcAm)、一溴乙酰胺、二氯乙酰胺(DCA-cAm)、二溴乙酰胺和三氯乙酰胺(TCAcAm)均已在美國飲用水出廠水中檢出,最高濃度可達幾十μg·L-1[2]。已有毒理學研究表明,HAcAms的細胞毒性是鹵乙酸(HAAs)的102倍左右,遺傳毒性是HAAs的20倍左右[3],HAcAms細胞毒性顯著高于受控類三鹵甲烷(THMs)、HAAs,然而HAcAms對哺乳動物細胞的毒性與致突變性尚未有文獻報道,開展HAcAms對哺乳動物細胞突變的研究對全面了解其“三致”風險,保障人民群眾安全用水具有重要的意義[4-5]。

小鼠淋巴瘤細胞Tk基因突變試驗是一種具有較高的檢出靈敏度、較廣的檢測譜且簡便易行的體外短期致突變試驗方法[6]。該方法可檢出發生于Tk位點的點突變、小缺失,同時還能檢出包括Tk位點在內的大缺失、易位、重組甚至染色體非整倍性等廣泛的遺傳學改變。歐美國家均已將其列為一組必選的遺傳毒性測試,我國亦將其列為保健食品、藥品、化妝品等安全性毒理學評價中的必選實驗之一。本研究采用小鼠淋巴瘤細胞Tk基因突變試驗檢驗5種HAcAms類DBPs的致突變性,為水體中HAcAms類DBPs引起的健康風險提供毒理學依據,同時亦可為Tk基因突變試驗檢驗在水體中微量污染物風險評估中的應用積累數據資料。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用小鼠淋巴瘤細胞L178Ytk+/-3.7.2C由日本國立衛生研究所提供。5種受試HAcAms詳細信息如表1所示。實驗用陽性對照甲磺酸甲酯(MMS,98%)購自Sigma Aldrich(美國)公司,二甲基亞砜(DMSO,99%)購自中國國藥有限公司。

表1 5種鹵代乙酰胺類消毒副產物(DBPs)信息Table 1 Detailed information of the five investigated haloacetamides(HacAms)

表2 5種鹵代乙酰胺類DBPs的毒性與致突變性Table 2 Toxicity and mutagenicity of five HAcAms in mouse lymphoma cells

1.2 實驗方法

基礎培養基(RPMI-0)由RPMI 1640中添加200 g·mL-1丙酮酸鈉,100 U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素；處理用培養基(RPMI-5)、常規培養用培養基(RPMI-10)和集落生長用培養基(RPMI-20)分別有基礎培養基入5%、10%或20%的馬血清(56℃、30 min滅活)制成。L5178Y細胞液氮下保存,復蘇后常規開放式懸浮培養于RPMI-10,在37℃、5%CO2條件下培養至穩定的對數增長狀態,細胞密度維持在1×106·mL-1以下,使用時傳代不應超過10代。在與正式試驗相同條件下處理細胞,表達培養2 d后測定相對懸浮增長率(relative suspension growth, RSG)。在20%～100%RSG范圍內以等比或等差設定4個劑量。另設溶劑對照(DMSO)和陽性對照(MMS,10μg·mL-1)。受試物處理細胞用RPMI-5調整細胞密度為106·mL-1(每組20mL)。按1%體積加入受試物、溶劑對照或陽性對照,振蕩處理4 h。處理結束后,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清液,用PBS洗滌細胞一次,重懸于RPMI-10中,并調整細胞密度至2×105·mL-1。

d0平板接種效率(plating efficiency,PE0):將處理后的細胞用RPMI-20梯度稀釋至8個·mL-1,25 mL(陰性對照為50 mL)。以200μL·孔-1(1.6個細胞·孔-1)接種到一塊96孔培養板(陰性對照接種2塊)。培養12 d后計數每塊培養板有集落生長的孔數。d2平板接種效率(plating efficiency,PE2):剩余細胞作表達培養2 d。每天計數細胞密度,調整至2×105·mL-1,并計算每日細胞增長率(daily cell growth, DCG),據此求算2 d內RSG。PE2接種方法同PE0。

TFT抗性突變頻率(mutant frequency,MF)的測定:表達培養結束后,取適量細胞,用RPMI-20調整密度至1×104·mL-1,50 mL(陰性對照組為100 mL),加入三氟胸甘(TFT),使其濃度為2μg·mL-1。以200μL·孔-1(2 000個細胞·孔-1)接種2塊96孔培養板(陰性對照組接種4塊)。培養12 d后分別計數含有大集落(large colony,LC)的孔數、只含小集落(small colony,SC)的孔數、同時含有LC和SC的孔數。大小集落的區分標準:LC大小超過每孔直徑的1/4,呈薄層分布；SC大小在每孔直徑的1/4以下,呈塊狀,結構致密。

1.3 數據統計與分析

數據統計分析使用SPSS 19.0(IBM,USA)進行。采用ANOVA方法分析HAcAms暴露組與空白對照組之間的差異,P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

圖1 不同HAcAms劑量作用下Tk基因總突變頻率及小集落相對含量Fig.1 Effect of HAcAms dose on the mutant frequency ofTkgene and relative amount of small colony

2 結果(Results)

2.1 細胞毒性

當HAcAms的暴露劑量高于50μmol·L-1時,部分RTG低于本測試方法最低限定值(20%)[7],因此本文中5種HAcAms的暴露劑量均控制在0.05～20μmol·L-1范圍內。如表2所示,小鼠淋巴瘤細胞相對懸浮生長率(RSG)、RTG均隨著HAcAms劑量的增大而降低。當CAcAm、DCAcAm、TCAcAm、IA-cAm、DIAcAm的劑量為20μmol·L-1時,小鼠淋巴瘤細胞的RSG分別為55%、53%、58%、47%、41%, RTG值分別為48%、42%、35%、38%、28%,顯示出較強的細胞毒性,其中IAcAm、DIAcAm的RSG、RTG值均低于氯代 HAcAms的值,表明碘代HAcAms的細胞毒性高于氯代HAcAms。

2.2 5種HAcAms作用下Tk基因總突變頻率及小集落相對含量

5種HAcAms作用下Tk基因總突變頻率及小集落相對含量變化如表2、圖1所示。MMS陽性對照的結果表明,當MMS暴露劑量為10μg·mL-1Tk基因總突變頻率顯著提升且具有統計學意義(P＜0.001)。隨著5種HAcAms暴露劑量的增大,Tk基因總突變頻率均呈現出升高的趨勢。但只有DIA-cAm暴露劑量達到5μmol·L-1、20μmol·L-1時,Tk基因總突變頻率與溶劑對照差異才呈現出統計學意義(P＜0.05),其誘發突變頻率分別達到自發突變頻率的4倍及9倍。對DIAcAm各暴露劑量與總突變頻率做線性關系回歸分析,有較好的劑量響應關系(P＜0.05)。在觀察到大集落(LC)、與小集落(SC)2種表型的突變集落中,小SC的豐度多高于LC豐度。其中DIAcAm暴露劑量為5μmol·L-1、20μmol·L-1時,SC的相對豐度可分別達到 60.14%、67.14%,與Liviac等[8]觀測到DBPs暴露下小鼠淋巴瘤細胞大小集落豐度分布結果一致。

3 討論(Discussion)

飲用水中DBPs的長期暴露可能帶來的健康風險已成為飲用水安全保障的研究熱點之一。已有流行病學的研究調查了DBPs長期暴露與癌癥、生殖健康狀況(先天性畸形、死胎、流產、出生體重、成熟度和精液質量)等的關聯情況[9-11]。其中已發現了DBPs的濃度水平與膀胱癌發病概率的相關性,但生殖健康與DBPs的關聯尚未有定論[13]。本文采用哺乳動物細胞為受體細胞,考察了5種HAcAms暴露下的Tk基因總突變頻率,發現5種HAcAms均呈現出一定的細胞毒性,其中DIAcAm具有統計學意義的致突變性。在高劑量(20μmol·L-1)暴露下, Tk基因總突變頻率為DIAcAm＞IAcAm＞CAcAm＞TCAcAm≈DCAcAm,Plewa等[14]曾報道過13種HAcAms的慢性細胞毒性(以中華倉鼠卵巢細胞為受體),其中DIAcAm＞IAcAm＞CAcAm＞DCA-cAm＞TCAcAm,與本文毒性水平分布總體一致。

MX(3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2 (5H)-furanone)是一種氯化呋喃酮類物質,美國、英國、日本、中國均從氯化消毒的自來水中檢出MX[15]。盡管MX在氯化飲水中濃度一般為在幾十個ng·L-1級別,但可占氯化飲水有機提取物總誘變性的50%左右[16]。本研究根據美國環境保護署基于QSAR計算的T.E.S.T.數據庫中的5種HAcAms與MX的致突變數據進行比較,所得相對毒性數據如圖2所示。其中DIAcAm的相對致突變性最高(0.87),CAcAm最低(0.39),總體趨勢與本文實驗結果相一致。

碘代DBPs的細胞毒性與遺傳毒性通常均高于氯代DBPs與溴代DBPs[17],本文研究結果發現碘代HAcAms的致突變性顯著高于氯代HAcAms,進一步證實了碘代DBPs的高“三致”作用。已有研究證明,濾后水中的碘離子、含碘微量有機物及食鹽中的碘離子均有可能成為碘代DBPs的碘源,進而生成高毒性碘代DBPs[18][19]。飲用水中碘代DBPs的生成規律、濃度分布及毒性評估需引起足夠重視,以有效控制其帶來的飲用水健康風險。

圖2 基于QSAR計算的5種HAcAms致突變相對值(數據源自USEPA T.E.S.T.數據庫，以3-氯-4 -(二氯甲基)-5-羥基-2(5H)-呋喃(MX)為基準物)Fig.2 Mutagenicity of five HAcAms based on the calculation of QSAR (Relative mutagenicity value is calculated using USEPA T.E.S.T. database values and 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone is selected as the reference compound).

[1]Richardson S D.Disinfection by-products and other emerging contaminants in drinking water[J].Trends Analytical Chemistry,2003,22(10):666–684

[2]Richardson S D,Thruston A D Jr,Caughran T V,et al.I-dentification of new ozone disinfection by-products in drinking water[J].Environmental Science&Technology, 1999,33(19):3368–3377

[3]Plewa M J,Muellner M G,Richardson S D,et al.Occurrence,synthesis,and mammalian cell cytotoxicity and genotoxicity of haloacetamides:An emerging class of nitrogenous drinking water disinfection by-products[J].Environmental Science&Technology,2008,42(3):955–961

[4]徐倩,徐斌,覃操,等.水中典型含氮有機物氯化生成消毒副產物的潛能研究[J].環境科學,2011,32(7): 1967–1973 Xu Q,Xu B,Qin C,et al.Chlorination by-products formation potentials of typical nitrogenous organic compounds in water[J].Environmental Science,2011,32(7): 1967–1973(in Chinese)

[5]李冕,徐斌,夏圣驥,等.含氮消毒副產物鹵代酰胺的生成特性與控制研究進展[J].中國給水排水,2011,27 (14):31–34 Li M,Xu B,Xia S J,et al.State-of-the-art of formation and control of nitrogenous disinfection by-products:Halomides[J].China Water&Wastewater,2011,27(14):31–34(in Chinese)

[6]王亞男,李辛欣,王煜,等.用TK基因突變試驗評價土荊芥精油的遺傳毒性[J].癌變突變畸變,2014,26(5): 378–381 Wang Y N,Li X X,Wang Y,et al.Evaluation of the genetic toxicity of essential oil fromChenopodium ambrosioidesL.with TK mutation assay[J].Carcinogenesis, Teratogenesis and Mutagenesis,2014,26(5):378–381 (in Chinese)

[7]Clive D,Bolcsfoldi G,Clements J,et al.Consensus agreement regarding protocol issues discussed during the mouse lymphoma workshop:Portland,Oregon,May 7, 1994[J].Environmental and Molecular Mutagenesis, 1995,25:165–168

[8]Liviaca D,Creus A,Marcos R.Mutagenic analysis of six disinfection by-products in theTkgene of mouse lymphoma cells[J].Journal of Hazardous Materials,2011, 190:1–3

[9]McGeehin M A,Reif J S,Becher J C,et al.Case-control study of bladder cancer and water disinfection methods in Colorado[J].American Journal of Epidemiololy,1993, 138:492–501

[10]King W D,Marrett L D.Case-control study of bladder cancer and chlorination by-products in treated water(Ontario, Canada)[J].Cancer Causes Control,1996,7:596–604

[11]Cantor K P,Lynch C F,Hildesheim M E,et al.Drinking water source and chlorination byproducts.I.Risk of bladder cancer[J].Epidemiology,1998,9:21–28

[12]Vinceti M,Fantuzzi G,Monici L,et al.A retrospective cohort study of trihalomethane exposure through drinking water and cancer mortality in northern Italy[J].Science of the Total Environment,2004,330:47–53

[13]Villanueva C M,Cantor K P,Grimalt J O,et al.Bladder cancer and exposure to water disinfection by-products through ingestion,bathing,showering,and swimming in pools[J].American Journal of Epidemiololy,2007,165: 148–156

[14]Plewa M J,Muellner M G,Richardson S D,et al.Occurrence,synthesis,and mammalian cell cytotoxicity and genotoxicity of haloacetamides:An emerging class of nitrogenous drinking water disinfection byproducts[J].Environmental Science&Technology,2008,42(3):955–961

[15]Planas C,Ventura F,Caixach J,et al.Analysis of 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone(MX) and its brominated analogues in chlorine-treated water by gas chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry(GC-QqQ-MS/MS)[J].Talanta,2015, 144:145–156

[16]Smith R B,Bennett J E,Rantakokko P,et al.The relationship between MX[3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone],routinely monitored trihalomethanes,and other characteristics in drinking water in a longterm survey[J].Environmental Science&Technology, 2015,49(11):6485–6493

[17]Liu J Q,Zhang X R.Comparative toxicity of new halophenolic DBPs in chlorinated saline wastewater effluents against a marine alga:Halophenolic DBPs are generally more toxic than haloaliphatic ones[J].Water Research, 2015,65:64–72

[18]Ye T,Xu B,Wang Z,et al.Comparison of iodinated trihalomethanes formation during aqueous chlor(am)ination of different iodinated X-ray contrast media compounds in the presence of natural organic matter[J].Water Research, 2014,66:390–398

[19]Pan Y,Zhang X R,Li Y.Identification,toxicity and control of iodinated disinfection byproducts in cooking with simulated chlor(am)inated tap water and iodized table salt [J].Water Research,2016,88:60–68

Mutagenic Analysis of Five Haloacetamides Disinfection By-products in the Tk Gene of Mouse Lymphoma Cells

Yuan Tingting1,Wang Xinliang2,Dong Huiyu3,*
1.LaboratoryDepartment,Beijing Hospital,Beijing 100730,China
2.Tianjin Urban Planning&Design Institute,Tianjin 300201,China
3.ResearchCenter for Eco-environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China

30 November 2015 accepted 11 January 2016

Haloacetamide(HAcAm)is one of the emerging nitrogeneous disinfection by-products(DBPs)in drinking water.To evaluate the mutagenic potential of HAcAm,effects of 5 HAcAms including chloroacetamide,dichloroacetamide,trichloroacetamide,iodoacetamide and diiodoacetamide(DIAcAm)on thymidine kinase(Tk)gene in the well-validated mouse lymphoma assay were investigated in this study.The results showed that with the exposure levels from 0.05 to 20μmol·L-1,all the 5 HAcAms investigated exhibited cytotoxicity,which increased with the elevated exposure level.After 4 h of exposure,only DIAcAm increased the frequency of mutant colonies,with a higher proportion of small colonies.These results of HAcAms provided basic data for the evaluation of mutagen-ic potential to mammalian cells.

haloacetamide;mouse lymphoma cells;mutation assay

2015-11-30 錄用日期:2016-01-11

1673-5897(2016)1-153-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151130022

袁婷婷,王新亮,董慧峪.5種鹵代乙酰胺類消毒副產物對小鼠淋巴瘤細胞Tk基因致突變性研究[J].生態毒理學報,2016,11(1):153-158

Yuan T T,Wang X L,Dong H Y.Mutagenic analysis of five haloacetamides disinfection by-products in theTkgene of mouse lymphoma cells[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):153-158(in Chinese)

國家自然科學基金課題(51408590)

袁婷婷(1985-),女,檢驗醫師,研究方向為細胞生物毒理學,E-mail:ttyuan.ok@163.com；

),E-mail:hydong@rcees.ac.cn

簡介:董慧峪(1983-)，男，環境工程博士，助理研究員，主要研究方向水體安全消毒與輸配，發表學術論文10余篇。