利用大型蚤和斑馬魚評價腈綸廢水好氧-厭氧處理過程的急性毒性和遺傳毒性變化

楊京亞，趙璐璐，張洲，劉薇,*，張新，徐曉晨，涂響

1.大連理工大學環境學院工業生態與環境工程教育部重點實驗室，大連116024

2.中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京100012

利用大型蚤和斑馬魚評價腈綸廢水好氧-厭氧處理過程的急性毒性和遺傳毒性變化

楊京亞1，趙璐璐1，張洲1，劉薇1,*，張新1，徐曉晨1，涂響2

1.大連理工大學環境學院工業生態與環境工程教育部重點實驗室，大連116024

2.中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京100012

腈綸廢水毒性較強且難以去除,對腈綸廢水毒性及污水處理過程毒性削減能力進行評價,可為開發該類廢水毒性減排技術提供科學依據。利用大型蚤及斑馬魚評價某腈綸廢水的急性毒性和遺傳毒性,及厭氧-好氧工藝對該廢水毒性的削減能力。采用大型蚤活動抑制率和斑馬魚致死率表征廢水急性毒性,采用斑馬魚肝細胞彗星尾矩表征廢水遺傳毒性。腈綸廢水處理前對大型蚤和斑馬魚的急性毒性單位(TU)分別為1.2和2.9,經厭氧-好氧工藝處理后分別降至＜0.4和0.5。遺傳毒性結果表明腈綸廢水對斑馬魚肝細胞造成DNA損傷作用,經處理后遺傳毒性仍顯著高于陰性對照組。理化指標與毒性指標相關性分析表明,該廢水氨氮與毒性顯著相關,推測氨氮可能是該廢水中的重要致毒因子之一。研究結果表明該腈綸廢水采用現有厭氧-好氧工藝無法有效削減毒性,對受納水體水生態環境造成潛在危害。

腈綸廢水；大型蚤；斑馬魚；急性毒性；遺傳毒性

腈綸廢水是一種典型有毒廢水,對微生物有顯著抑制作用,難生物降解[1]。其中干法腈綸在生產過程中先后加入二甲基甲酰胺、丙烯腈、四乙酸二氨基乙烷和壬基酚聚氧乙烯醚等20余種原料,并且在聚合反應中又生成不同分子量的聚丙烯腈,因此腈綸廢水中污染物含量多,且有機胺和氨氮含量高[2-3]。我國對廢水排放的水質評價與監督以理化分析為主,難以反映廢水中多種組分的綜合毒性效應[4]。廢水生物毒性監測,能彌補理化指標監測的不足。有研究者利用蠶豆根尖微核試驗、小麥發芽試驗、發光菌急性毒性試驗、斑馬魚急性毒性試驗分析腈綸工業廢水的急性毒性和遺傳毒性,結果表明腈綸廢水毒性較強,排入水體會對當地水生態系統乃至人類健康造成一定的危害[5-6]。

遼河流域主要污染物排放量遠遠超過受納水體環境容量,廢水的排放會增加區域環境負荷[7],其中化工和石化廢水是遼河流域重要污染來源之一。遼河流域化工與石化行業有機污染特征分析表明,典型企業排水與受納水體間存在明顯的源-匯響應關系[8]。因此,對代表性腈綸廢水進行毒性評價,及污水處理過程毒性削減能力進行評價,對于遼河流域化工與石化廢水污染控制具有重要意義。

大型蚤和斑馬魚是廢水毒性評價國際通用模式生物,其中斑馬魚70%的基因與人類基因直系同源[9],采用斑馬魚肝細胞彗星實驗對廢水遺傳毒性進行評價,有利于預測廢水對高等脊椎動物乃至人類健康的潛在危害[10]。本研究采用大型蚤、斑馬魚作為指示生物,對比分析了撫順市某石化腈綸企業排水的急性毒性和遺傳毒性特征,以及厭氧-好氧生化處理工藝對該廢水毒性的削減能力,可為開發腈綸廢水毒性減排技術提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試劑

氫氧化鈉(NaOH)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、正常融點瓊脂糖(NMA,1.2%)、低熔點瓊脂糖(LMA,1.0%)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司。Gelred染液購自美國Biotium公司。實驗試劑均為分析純。

細胞裂解液:將2.5 mol·L-1NaCl、10 mmol·L-1Tris、100 mmol·L-1Na2EDTA溶解后,用NaOH調節pH=10,置于4℃下備用。用前按體積比加入10%DMSO、1%Triton X-100。

電泳液:1 mmol·L-1Na2EDTA,300 mmol·L-1NaOH等體積混合,pH=13,4℃下保存。

1.1.2 儀器

光學顯微鏡(YS100,Nikon,日本)；TDZ4-WS低速臺式自動平衡離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；O-lympus IX71倒置式熒光顯微鏡(日本)。

1.1.3供試水樣

取自撫順某石化公司腈綸廠污水處理設施,該廠采用干法腈綸生產工藝,廢水處理采用厭氧-好氧工藝:經調節池混合后進入厭氧系統,出水進入一沉池沉淀,上清液化學氧化處理后在二沉池內混凝沉淀,后經流化床、硝化處理進入三沉池,出水經生物碳塔吸附處理后排放。本研究采集入水、厭氧池、沉淀池出水和最終排放水。水樣采集后,過濾除去懸浮顆粒物,測定水質常規理化指標(見表1),毒性測試前置于4℃保存,1周內進行毒性實驗。毒性測試過程中,水中溶解氧＞4mg·L-1,pH為6～8。

1.2 急性毒性試驗

大型蚤(Daphnia magna)購自大連海洋大學生命科學學院重點實驗室,采用6～24 h內新出生的小蚤,暴露24 h后,記錄不活動蚤數。預實驗后確定5個濃度梯度,同時設置空白對照。每個樣品設3個平行,每個樣品投放5只大型蚤。

斑馬魚(Danio rerio)購自大連市花鳥市場,曝氣去氯自來水中馴化1周,期間自然死亡率不超過5%,試驗前1天停止喂食。預實驗后確定5個濃度梯度,同時設置空白對照。每個樣品設3個平行,每個樣品1.2 L水,投放5條魚,低于1克魚/升水。靜態方式染毒96 h后,記錄存活的斑馬魚數目。

腈綸廢水對大型蚤、斑馬魚急性毒性的評價采用半數效應濃度(EC50)和毒性單位(TU)。EC50表示腈綸廢水使大型蚤行為抑制率或斑馬魚死亡率達到50%時所對應的濃度。TU=1/EC50。若當受試生物暴露于未稀釋廢水,急性毒性效應未達到50%,無法得到EC50,TU通過以下公式計算[11]:

TU=死亡率(行為抑制率)×100×0.02

本研究中急性毒性檢出限是20%,因此當急性毒性為20%時,TU=0.02×100×20%=0.4。當未稀釋水樣的急性毒性低于20%時,TU值用＜0.4表示。

1.3 斑馬魚彗星實驗

采用單細胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)實驗,也稱彗星實驗(comet assay),在單細胞水平上檢測DNA損傷[12]。每個平行測定樣品采集3條斑馬魚肝臟,混合制備肝細胞懸液。采用雙層凝膠結構制作電泳膠板,加入細胞裂解液裂解90 min,加電泳液使DNA解旋、電泳,后用Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液浸泡中和。晾干后用Gelred染色,倒置熒光顯微鏡觀察,在自動曝光條件下拍照獲取彗星圖像。以尾矩(tail moment,TM,即彗尾長度和尾部DNA含量的乘積)為指標反映暴露于廢水的斑馬魚肝細胞DNA損傷程度[13]。使用Casp軟件隨機抓取50個細胞圖像測定尾矩,結果用(平均值±標準差)表示。

1.4 質量控制/質量保證

毒性實驗采用空白對照、陽性對照、平行測定作為質控措施。采用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)作為急性毒性試驗的陽性對照物,K2Cr2O7對大型蚤活動抑制和斑馬魚致死作用的EC50分別為(0.7±0.1)mg·L-1和(293±16)mg·L-1。遺傳毒性實驗采用4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)作為陽性對照物。空白對照組彗星尾矩為(1.0±0.5),暴露于1μg·L-14-NQO時,彗星尾矩為(7.0±2.2)。

1.5 數據處理

利用SPSS19.0進行統計分析。采用probit analysis計算EC50。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行組間差異檢驗。采用Pearson分析考察理化指標與毒性指標之間的相關性。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 水質基本理化指標

腈綸廢水的理化參數測定結果可見表1。進水、厭氧池及初級淀池出水COD及氨氮濃度較高,后經化學氧化、二級沉淀、流化床處理后,出水COD和氨氮顯著降低。三沉池出水COD有所升高,原因可能有污泥指數高等。最終出水理化指標除氨氮外,達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918—2002)的一級標準,厭氧-好氧生化處理工藝對該腈綸廢水 COD、氨氮的去除率分別為81.6%和57.7%。

表1 污水處理廠各反應段出水的水質指標Table 1 Quality index of wastewater from sewage treatment process

2.2 腈綸廢水對大型蚤和斑馬魚的急性毒性

腈綸廢水不同處理工藝段出水對大型蚤的活動抑制作用和對斑馬魚的致死作用結果見表2。腈綸廢水未經處理前對大型蚤和斑馬魚具有明顯的急性毒性,暴露于原水造成大型蚤活動抑制率和斑馬魚死亡率為100%,TU分別為1.2和2.9。經過厭氧-一沉/二沉處理后,急性毒性沒有明顯變化。處理至流化床,急性毒性顯著降低。最終出水未發現大型蚤的活動抑制作用,對斑馬魚表現出輕微的致死作用。

圖1 陰性對照、腈綸廢水進水、出水的斑馬魚肝細胞彗星圖像(×100)注:(A)陰性對照,(B)進水,(C)出水。Fig.1 Comet images of hepatocyte collected fromDanio rerioexposed to negative control,influent and effluent of acrylic fiber wastewaterNote:(A)Negative control,(B)Influent,(C)Effluent.

圖2 腈綸廢水進水、出水在不同稀釋度下對斑馬魚造成的DNA損傷注:(A)進水,(B)出水；**代表與對照組相比P＜0.01。Fig.2 DNA damage in the hepatocytes ofDanio rerioafter exposure to effluents from the typical process stages of acrylic fiber industry at different concentrationsNote:(A)Influent;(B)Effluent.** represent significant differences atP＜0.01,compared with control values.

表2 腈綸廢水進水及不同工藝段出水對大型蚤和斑馬魚的急性毒性Table 2 Acute toxic effects onDaphnia magnaandDanio rerioexposed to acrylic fiber wastewater influent and effluents from different treatment units

2.3 腈綸廢水對斑馬魚的遺傳毒性

代表性對照和廢水作用于斑馬魚肝細胞的彗星圖像見圖1。對照組細胞尾矩為(1.0±0.5)(圖2)。隨著暴露稀釋梯度的升高,腈綸廢水不同工藝段出水對斑馬魚肝細胞造成的DNA損傷程度增加,暴露在腈綸廢水原水5%稀釋梯度下對斑馬魚肝細胞造成的DNA損傷的彗星尾矩為(19.2±3.4),較對照組呈極顯著差異(P＜0.01)；而出水10%稀釋梯度下對斑馬魚肝細胞造成的DNA損傷尾矩為(3.6±1.3),較對照組呈極顯著性差異(P＜0.01)。

3 討論(Discussion)

本研究選擇大型蚤及斑馬魚為受試生物,對腈綸廢水的毒性進行評價。結果表明腈綸廢水對大型蚤和斑馬魚產生明顯的急性毒性作用,并對斑馬魚肝細胞產生DNA損傷作用。大型蚤和斑馬魚作為浮游動物和脊椎動物的代表,其毒性測試結果對于廢水的潛在生態危害具有重要指示作用。經過厭氧-好氧生化工藝處理后,腈綸廢水的COD、氨氮及毒性降低,且單位COD的急性毒性降低,表明處理過程中強毒性物質被降解為低毒物質,該工藝對急性毒性和遺傳毒性具有一定的削減能力。但最終出水仍具有顯著的遺傳毒性,表明該廢水經處理后雖然毒性顯著降低,但對于水生態系統仍存在一定風險。張凱等[5]發現丙烯腈模擬廢水經Fenton、活性炭吸附、加成法處理后,對小麥的毒性降低,但對發光菌的毒性升高,提示該類廢水毒性削減難度較大。

單細胞凝膠電泳(彗星實驗)應用于檢測污染物對DNA造成的損傷程度[12],DNA損傷是指由化學或物理因素引起的DNA鏈斷裂、分子機體修飾和DNA交聯等,若這種損傷沒有得到及時的修復,就會引起突變,乃至癌變[13]。該腈綸廢水氨氮、COD均與遺傳毒性顯著相關(P＜0.05),表明遺傳毒性是該腈綸廢水的重要毒性特征,廢水中的主要成分能引起DNA損傷。Chang等[14]研究表明丙烯腈可引起原代培養的成人支氣管上皮細胞DNA單鏈斷裂。丙烯腈及其代謝產物可損傷生物膜,產生活性氧攻擊DNA大分子,造成DNA損傷,使小鼠精細胞DNA產生交聯作用[15]。有研究表明,二甲基酰胺在有氧的條件下會降解產生H2O2,且會導致DNA的損傷[16]。

此外,該腈綸廢水氨氮與急性毒性也顯著相關(P＜0.05),推測氨氮是造成腈綸廢水對水生生物產生毒性作用的關鍵致毒因子之一。當水中氨氮濃度超過25mg·L-1時,會對水體生態環境產生嚴重風險[17]。已有研究表明,氨氮對大型蚤和斑馬魚急性毒性的 LC50分別為 165.97mg·L-1和 101mg·L-1[19-20]。與本研究中腈綸廢水經在氨氮為30.7mg·L-1下對斑馬魚產生輕微致死效應的結果相近。氨氮對水生動物的急性毒性主要是非離子氨的作用,非離子氨通過細胞膜進入血液后轉化為NH+4,使神經元去極化,最終導致細胞死亡,即使是在劑量較低的情況下,也能對魚類神經系統產生影響[18]。腈綸廢水毒性鑒別仍需進一步研究,以確定廢水中的有毒有害污染物,有助于實現污染物源頭控制。

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Variation in Acute Toxicity and Genotoxicity of Acrylic Fiber Wastewater on Daphnia magna and Danio rerio during Anaerobic－aerobic Treatment Process

Yang Jingya1,Zhao Lulu1,Zhang Zhou1,Liu Wei1,*,Zhang Xin1,Xu Xiaochen1,Tu Xiang2
1.Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering(MOE),School of Environmental Science and Technology, Dalian University of Technology,Dalian 116024,China
2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment,Chinese Research Academy of Environmental Sciences,Beijing 100012,China

24 March 2015 accepted 5 April 2015

The acrylic fiber wastewater exhibits relatively high toxicity,which is difficult to be removed.The evaluation for the toxicity of the acrylic fiber wastewater and its reduction during the treatment process would facilitate the improvement of toxicity removal when optimizing the wastewater treatment technique.Daphnia magnaandDanio reriowere applied to evaluate the acute toxicity and genotoxicity of acrylic fiber wastewater,and the toxicity removal by anaerobic－aerobic(A/O)treatment process.The acute toxicity of the acrylic fiber wastewater was tested byDaphnia magnaimmobilization andDanio reriomortality.The genotoxicity was evaluated by comet tailmoment ofDanio reriohepatocyte.The acrylic fiber wastewater samples were collected from a representative chemical industry located in Fushun,Liaoning Province.The removal of COD and ammonia by the A/O process were 81.6%and 57.7%,respectively.The COD and the ammonia of the effluent from the treatment process were 36.2 and 30.7mg·L-1,respectively,which fell within the“Discharge Standard of Pollutants for Municipal Wastewater Treatment Plant”in China.The wastewaters induced acute toxicity toDaphnia magnaandDanio rerio, with the acute toxicity units at 1.2 and 2.9 before treatment,＜0.4 and 0.5 after A/O treatment,respectively.Acrylic fiber wastewater caused DNA damage toDanio reriohepatocyte,and the genotoxicity of the effluent was still significantly higher than that of the negative control group.Correlation analysis between physiochemical indexes and toxicity indicator showed that ammonia concentrations were significantly correlated with the toxicity,suggesting that ammonia may be one important toxicity factor in the acrylic fiber wastewater.The results suggested that the current A/O treatment process was limited in remove the toxicity of the acrylic fiber wastewater,and the discharged wastewater would pose potential hazard to the aquatic ecosystems of the receiving water.

acrylic fiber wastewater;Daphnia magna;Danio rerio;acute toxicity;genotoxicity

2015-03-24 錄用日期:2015-04-05

1673-5897(2016)1-225-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150324003

楊京亞,趙璐璐,張洲,等.利用大型蚤和斑馬魚評價腈綸廢水好氧-厭氧處理過程的急性毒性和遺傳毒性變化[J].生態毒理學報,2016,11(1):225-230

Yang J Y,Zhao L L,Zhang Z,et al.Variation in acute toxicity and genotoxicity of acrylic fiber wastewater onDaphnia magnaandDanio rerioduring anaerobic－aerobic treatment process[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):225-230(in Chinese)

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07202-002)

楊京亞(1990-),女,碩士,研究方向為水生態毒理學,E-mail:nearlyyang@163.com；

),E-mail:liu_wei@dlut.edu.cn

簡介:劉薇(1980-)，博士，副教授，主要研究方向為環境污染物暴露評估、毒性效應和機理,發表學術論文30余篇。