碲化鎘量子點(diǎn)對(duì)小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及重要生物酶活性的影響

王吉龍，韓瑩，王萌萌，孫湖泊，黃沛力,*，孫志偉

1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京100069

2.環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069

3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050

4.北京體育大學(xué)，北京100084

碲化鎘量子點(diǎn)對(duì)小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及重要生物酶活性的影響

王吉龍1,2，韓瑩3，王萌萌1,2，孫湖泊4，黃沛力1,2,*，孫志偉1,2

1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京100069

2.環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069

3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050

4.北京體育大學(xué)，北京100084

探討了碲化鎘量子點(diǎn)(cadmium telluride quantum dots,CdTe QDs)對(duì)小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)及琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)和三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase,ATPase)活性的影響。將20只雄性ICR小鼠隨機(jī)分成QDs染毒組和對(duì)照組,采用尾靜脈注射方式進(jìn)行一次性染毒,染毒組每只小鼠注射2μmol·kg-1體重的CdTe QDs(以Cd2+的摩爾濃度計(jì)算)。每5只為一組分別在染毒后的1 d、3 d和7 d處死小鼠,另外5只注射生理鹽水作為對(duì)照組。取部分肝組織在透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)變化并使用試劑盒測(cè)定肝臟中SDH、Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶的活性。結(jié)果顯示CdTe QDs暴露后染毒組小鼠肝細(xì)胞胞漿疏松,線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡、嵴減少等結(jié)構(gòu)變化,表明肝細(xì)胞受到損傷且染毒1 d后損傷最嚴(yán)重；肝臟中染毒組SDH活性與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.05)；染毒1 d后,Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性與對(duì)照組相比顯著升高,隨著染毒后時(shí)間的延長(zhǎng),其活性呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)。單次量注射CdTe QDs能夠引起小鼠肝臟損傷,抑制SDH活性,引起ATP酶活性改變,這些癥狀在暴露時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。

碲化鎘量子點(diǎn)；小鼠；肝組織；超微結(jié)構(gòu)；琥珀酸脫氫酶；ATP酶

量子點(diǎn)(quantum dots,QDs)作為一種新型的納米材料,因其具有獨(dú)特的光學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像、追蹤和標(biāo)記以及藥物篩選等生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域[1]。其中鎘系QDs,由于含有Cd元素,對(duì)其潛在毒性的研究成為了當(dāng)今亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。研究表明,QDs能夠分布在生物體內(nèi)多個(gè)組織器官,并聚集在肝臟、腎臟等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)[2]。進(jìn)一步研究表明,QDs可以以胞吞的形式通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并以線粒體作為靶標(biāo)。線粒體是細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換器,三羧酸循環(huán)、電子傳遞及氧化磷酸化均在線粒體內(nèi)進(jìn)行,線粒體損傷后將影響細(xì)胞的活性進(jìn)而引起臟器損傷[3-4]。本實(shí)驗(yàn)以雄性ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究了CdTe QDs對(duì)小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、線粒體標(biāo)志酶SDH及膜蛋白酶ATP酶的影響,以其進(jìn)一步探討量子點(diǎn)對(duì)肝細(xì)胞的毒作用機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

ICR小鼠,雄性,SPF級(jí),體重24.3～27.9 g,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK-(京)2012-0001。嚴(yán)格控制飼養(yǎng)環(huán)境(實(shí)驗(yàn)室溫度(22 ±2)℃,相對(duì)濕度55% ±15%,正常通風(fēng)換氣,采用12 h光照/12 h黑暗飼養(yǎng)),用滅菌顆粒料和純凈水喂養(yǎng)。染毒開(kāi)始前動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)一周。CdTe QDs購(gòu)于南京捷納思新有限公司(粒徑3～4 nm,激發(fā)波長(zhǎng)490 nm,發(fā)射波長(zhǎng)620 nm)；SDH、Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器設(shè)備

AX200電子分析天平(日本Shimadzu公司), KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司),臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司),RF-5301pc熒光分光光度儀(日本Shimadzu公司),JEM-1400透射電子顯微鏡(日本Jeol公司),Mili-Q超純水機(jī)(法國(guó)Milipore公司)。

1.3 小鼠染毒及處理

用無(wú)菌生理鹽水將CdTe QDs配成濃度為250 nmol·mL-1的溶液。染毒前超聲處理30 min,使團(tuán)聚量子點(diǎn)均勻分散。將20只小鼠隨機(jī)分為染毒組和對(duì)照組,每組5只。采用尾靜脈注射方式一次性染毒,染毒組每只小鼠注射2μmol·kg-1體重的CdTe QDs(以Cd的摩爾濃度計(jì)算),對(duì)照組注射等體積生理鹽水。分別在染毒后1 d、3 d和7 d處死小鼠,取部分肝組織在透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)變化。其余組織迅速用生理鹽水清洗后置于-80℃冰箱以備用。

1.4 肝組織勻漿制備

將小鼠脫頸處死后立即摘取肝臟,在冰冷的生理鹽水中漂洗,以去掉表面的血跡,濾紙拭干,稱重,加入預(yù)冷的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH 7.8),冰浴中用玻璃勻漿器制成1%組織勻漿,將勻漿以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min,取上清備用。

1.5 肝臟組織的超微結(jié)構(gòu)觀察

將小鼠處死后,在肝臟右前葉上取1 mm3大小肝組織(染毒組和對(duì)照組肝臟均取相同部位),快速放入體積分?jǐn)?shù)為4%的戊二醛中固定(4℃,2 h以上)；0.1 mol·L-1PBS(pH 7.2)漂洗3次,每次15 min；經(jīng)過(guò)戊二醛-鋨酸雙重固定(4℃,1.5 h)；0.1 mol·L-1PBS(pH 7.2)漂洗3次；梯度乙醇、丙酮系列脫水3次(體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇15 min,體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇15 min,體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇15 min, 100%乙醇10 min)；環(huán)氧樹(shù)脂包埋、聚合(45℃,12 h；60℃,36 h)；超薄切片機(jī)切片(厚度60 nm)；經(jīng)醋酸雙氧鈾30 min、檸檬酸鉛3 min雙重染色,并蒸餾水水洗；透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)改變。

1.6 SDH活力的測(cè)定

使用SDH試劑盒測(cè)定SDH活力,應(yīng)用雙抗體夾心法,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定肝組織中SDH的活力濃度。

1.7 Na＋/K＋-ATP酶、Ca2＋/Mg2＋-ATP酶活性的測(cè)定

使用試劑盒測(cè)定Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性。ATP酶可分解ATP生成ADP及無(wú)機(jī)磷,測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量可判斷ATP酶活力的高低。其活性定義為:單位時(shí)間(h)單位質(zhì)量(mg)組織蛋白的ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為1個(gè)ATP酶活力單位(μmol·(mg·h)-1)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,使用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 CdTe QDs對(duì)小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

染毒組和對(duì)照組的肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常,胞質(zhì)均勻分布,細(xì)胞器、糖原顆粒豐富,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)繞線粒體存在,核仁清晰,核膜清晰完整,核染色質(zhì)分布均勻,異染色質(zhì)和常染色質(zhì)散在分布,無(wú)異常,如圖1(A)所示。染毒組肝細(xì)胞胞漿疏松,細(xì)胞器分散,胞質(zhì)內(nèi)脂滴與溶酶體相對(duì)增多,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變化不明顯。染毒1 d后線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡較多,線粒體膜融合,嵴減少,基質(zhì)密度降低；細(xì)胞核溶解出現(xiàn)空泡(圖1 B)。染毒3 d后細(xì)胞器出現(xiàn)腫脹,少量空泡化現(xiàn)象(圖1 C),染毒7 d后的結(jié)果與對(duì)照組相比出現(xiàn)輕微損傷但沒(méi)有1 d、3 d組損傷嚴(yán)重(圖1 D)。

圖1 小鼠肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖注:細(xì)胞核(N),線粒體(M),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)；A,對(duì)照組(×8 000)；B,1 d組(×8 000)；C,3 d組(×8 000)；D,7 d組(×8 000)。Fig.1 The hepatocytes ultrastructure of mice nuclear(N),mitochondrion(M),rough endoplasmic reticulum(RER)Note:A,control group(×8 000);B,1 d group(×8 000);C,3d group(×8 000);D,7 d group(×8 000).

2.2 肝臟中SDH活性的變化

小鼠肝臟組織勻漿中SDH活性的變化如圖2所示。與對(duì)照組相比,各染毒組SDH活性明顯降低(P＜0.05),其中染毒1 d后的SDH活性最低,而7 d SDH活性有所上升,但尚未恢復(fù)到正常水平。染毒1 d、3 d、7 d后結(jié)果兩兩比較有顯著性差異(P＜0.05),且隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)SDH活性有逐漸升高的趨勢(shì)。

圖2 CdTe QDs對(duì)小鼠肝臟中SDH活性的影響注:n=5；與對(duì)照組比較,*P＜0.05。Fig.2 The effect of CdTe QDs on SDH activities in mouse liver tissueNote:n=5;compared with the control group,*P＜0.05.

2.3 肝臟中Na＋/K＋-ATP酶活性的變化

小鼠肝臟組織勻漿中Na+/K+-ATP酶活性的變化如圖3所示。與對(duì)照組相比,染毒1 d和3 d后的Na+/K+-ATP酶活性明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。而染毒7 d后的Na+/K+-ATP酶活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.4 肝臟中Ca2＋/Mg2＋-ATP酶活性的變化

小鼠肝臟組織勻漿中Ca2+/Mg2+-ATP酶活性的變化如圖4所示。與對(duì)照組相比,染毒1 d、7 d后的Ca2+/Mg2+-ATP酶活性明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。而染毒3 d后的Ca2+/Mg2+-ATP酶活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

圖3 CdTe QDs對(duì)小鼠肝臟中Na＋/K＋-ATP酶活性的影響注:n=5；與對(duì)照組比較,*P＜0.05。Fig.3 The effect of CdTe QDs on Na+/K+-ATPase activities in mouse liver tissueNote:n=5;compared with the control group,*P＜0.05.

圖4 CdTe QDs對(duì)小鼠肝臟中Ca2＋/Mg2＋-ATP酶活性的影響注:n=5；與對(duì)照組比較,*P＜0.05。Fig.4 The effect of CdTe QDs on Ca2+/Mg2+-ATPase activities in mouse liver tissueNote:n=5;compared with the control group,*P＜0.05.

3 討論(Discussion)

QDs由于其具有獨(dú)特的熒光特性越來(lái)越受到研究者的關(guān)注,同時(shí)它對(duì)環(huán)境的影響和生物安全性問(wèn)題也逐漸被人們所關(guān)注。針對(duì)生物應(yīng)用及其安全性評(píng)價(jià),了解量子點(diǎn)在體內(nèi)的生物學(xué)行為顯得尤其重要。而肝臟是機(jī)體的重要器官,具有儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)、排除血液毒素、促進(jìn)膽汁分泌等功能。有研究表明, QDs在小鼠體內(nèi)肝臟富集程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他部位[5-6]。因此,深入探討QDs對(duì)肝組織的毒性效應(yīng)有重要意義。

超微結(jié)構(gòu)容易直接的表現(xiàn)出外源物對(duì)機(jī)體的作用情況,本研究中肝臟組織超微結(jié)構(gòu)顯示,肝細(xì)胞胞漿疏松,細(xì)胞器分散,線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡,線粒體膜融合、嵴減少、基質(zhì)密度降低等,說(shuō)明以2μmol·kg-1體重的CdTe QDs染毒對(duì)小鼠肝細(xì)胞造成損傷。

SDH存在于諸多組織臟器中,主要定位于細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴膜的內(nèi)側(cè)膜中,為線粒體的標(biāo)志酶,可催化琥珀酸生成延胡索酸參與三羧酸循環(huán)。SDH是三羧酸循環(huán)的限速酶,其活性大小可表明機(jī)體細(xì)胞有氧氧化能力的高低,反映線粒體狀態(tài)[7-8]。Hong等[9]通過(guò)對(duì)小鼠連續(xù)60 d染毒,發(fā)現(xiàn)隨著TiO2納米顆粒物染毒劑量的增加,睪丸內(nèi)SDH的活性逐漸降低。本研究顯示,各染毒組小鼠肝臟中SDH活性與對(duì)照組相比均顯著降低,與楊利劍等[10]探討納米羥基磷灰石作用于大鼠肝線粒體時(shí)對(duì)SDH活性的影響所得到的結(jié)果相似,說(shuō)明CdTe QDs對(duì)肝細(xì)胞的損傷伴隨著SDH的活性下降。從不同染毒組SDH活性的變化趨勢(shì)來(lái)看,暴露1 d時(shí)SDH活性最低,而肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也在1 d時(shí)損傷最為嚴(yán)重。CdTe QDs染毒1 d、3 d、7 d后的結(jié)果互相對(duì)比后發(fā)現(xiàn):隨著時(shí)間的延長(zhǎng),SDH活性逐漸上升,提示該損傷有一定的恢復(fù)趨勢(shì),這與肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖顯示的損傷程度基本吻合。

ATP酶存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上,是生物膜上的1種蛋白酶,它在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要的作用。機(jī)體在病理狀態(tài)下,ATP酶活力發(fā)生一系列轉(zhuǎn)變,所以ATP酶的活性是各種細(xì)胞能量代謝及功能有無(wú)損傷的重要指標(biāo)[11-12]。Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶是細(xì)胞膜上重要的ATP酶,有研究表明,這2種酶在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用[13-14]。劉信勇等[15]發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管懸濁液中長(zhǎng)期暴露條件下,試驗(yàn)組Na+/K+-ATP酶活性均大于空白組,35 d時(shí)斑馬魚體內(nèi)組織的Na+/K+-ATP酶活性比28 d時(shí)要低,但變化無(wú)顯著性差異。高春生課題組[16]研究水體銅對(duì)黃河鯉Na+/K+-ATP酶活性的影響,結(jié)果表現(xiàn)為低濃度Cu2+對(duì)黃河鯉肝臟Na+/K+-ATP酶活性有促進(jìn)作用,且隨著Cu2+處理時(shí)間的延長(zhǎng)促進(jìn)作用逐漸加強(qiáng)。Hu等[17]研究納米SiO2對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響,用不同濃度納米SiO2對(duì)小鼠進(jìn)行染毒發(fā)現(xiàn),隨著染毒計(jì)量的增加,腦中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/ Mg2+-ATP酶活性都顯著降低。本研究中發(fā)現(xiàn), CdTe QDs染毒后Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性有明顯的波動(dòng)變化,與對(duì)照組相比都有所升高,提示CdTe QDs對(duì)這些酶有一定的激活作用,這一點(diǎn)與Sastry和Gupta[18]在研究重金屬離子對(duì)水生動(dòng)物體內(nèi)ATP酶活性的影響所得到的結(jié)果非常相似,估計(jì)這是機(jī)體在長(zhǎng)期毒物負(fù)荷下的一種保護(hù)機(jī)制,也可能是機(jī)體受到刺激后的一種代償性升高,當(dāng)這種刺激超出機(jī)體的適應(yīng)能力時(shí),將會(huì)導(dǎo)致ATP酶活性消耗性降低。這種變化是否與QDs進(jìn)入細(xì)胞的方式有關(guān)(胞吞或者離子通道),將有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,CdTe QDs染毒后會(huì)抑制體內(nèi)的SDH的活性,該酶活力受到抑制后就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化過(guò)程受阻,直接影響ATP的生成從而造成三羧酸循環(huán)及能量代謝紊亂[19]。ATP酶活性升高,使得ATP酶需消耗更多的ATP來(lái)保證能量代謝的進(jìn)行,此時(shí)SDH活性受到抑制ATP生成減少, ATP酶就不能正常進(jìn)行逆化學(xué)梯度的離子轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外離子濃度的相對(duì)穩(wěn)定,從而進(jìn)一步引起機(jī)體代謝紊亂?？傊?CdTe QDs能夠引起小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,抑制SDH活性,引起ATP酶活性改變。關(guān)于CdTe QDs對(duì)肝臟組織的損傷作用,還有待于進(jìn)一步探討。

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Influences of CdTe Quantum Dots on Ultrastructure and Enzymatic Activities of Mice Liver

Wang Jilong1,2,Han Ying3,Wang Mengmeng1,2,Sun Hubo4,Huang Peili1,2,*,Sun Zhiwei1,2
1.School of Public Health,Capital Medical University,Beijing 100069,China
2.Beijing Key Laboratory of Environmental Toxicology,Beijing 100069,China
3.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China
4.Beijing Sport University,Beijing 100084,China

27 July 2015 accepted 18 September 2015

In the present study,influences of cadmium telluride quantum dots(CdTe QDs)on the ultrastructure and the activities of succinate dehydrogenase and adenosine triphosphatase in liver of mice were examined.Twenty ICR mice were randomly divided into exposed groups and control group,and injected with 2μmol·kg-1weight of CdTe QDs(as Cd)by tail intravenous injection(IOCV).Mice injected with normal saline were used as the control.Each of 5 mice was sacrificed at 1 d,3 d and 7 d,respectively.Liver tissue was sampled to observe the ultrastructural changes by transmission electron microscopy(TEM)and homogenized to measure enzymatic activities of SDH, Na+/K+-ATPase,Ca2+/Mg2+-ATPase using assay kits.The TEM results showed that mitochondria swelling,vacuole, crest reduction occurred after CdTe QDs exposure,indicating the hepatocytes damage,especially for 1 d exposure. The activities of SDH in the treated groups were significantly lower than that in the control group(P＜0.05).The activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in the liver tissue were significantly higher than those in the control group at 1 d exposure.As the exposure time increasing,the activities of ATPase showed a downward trend. We concluded that single dose of CdTe QDs exposure could induce mice liver damage,affect activities of both SDH and ATP enzyme,which could gradually recovered.

cadmium telluride quantum dots;mice;liver tissue;ultrastructure;succinate dehydrogenase;ATPase

2015-07-27 錄用日期:2015-09-18

1673-5897(2016)1-283-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150727001

王吉龍,韓瑩,王萌萌,等.碲化鎘量子點(diǎn)對(duì)小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及重要生物酶活性的影響[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2016,11(1):283-288

Wang J L,Han Y,Wang M M,et al.Influences of CdTe quantum dots on ultrastructure and enzymatic activities of mice liver[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):283-288(in Chinese)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273131)；北京市教育委員會(huì)科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(KZ201510025027)；首都醫(yī)科大學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人及團(tuán)隊(duì)交流培養(yǎng)項(xiàng)目

王吉龍(1988-),男,碩士研究生,研究方向?yàn)樾l(wèi)生毒理學(xué),Email:wangjilong21@126.com；

),E-mail:huangpl@ccmu.edu.cn

簡(jiǎn)介:黃沛力(1963—)，女，無(wú)機(jī)化學(xué)碩士，首都醫(yī)科大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，長(zhǎng)期從事納米材料檢測(cè)技術(shù)與生物體內(nèi)化學(xué)穩(wěn)定性研究。