桔小實蠅雌雄蟲對18種寄主揮發物的觸角電位差異比較

譚 靜，陳 玲，李紅亮*，王 強，商晗武*

（1.中國計量學院 生命科學學院，浙江 杭州 310018；2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021）

桔小實蠅雌雄蟲對18種寄主揮發物的觸角電位差異比較

譚 靜1，陳 玲1，李紅亮1*，王 強2，商晗武1*

（1.中國計量學院 生命科學學院，浙江 杭州 310018；2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021）

桔小實蠅 （Bactroceradorsalis）是一種重要的檢疫性害蟲，其雌蟲經常選擇多種水果果實進行產卵和為害，因此這些寄主水果的揮發物很有可能是引誘桔小實蠅雌蟲的嗅覺信息。為了系統研究不同寄主水果揮發物對桔小實蠅雌雄蟲的嗅覺反應差異，本研究從8種寄主中選擇18種常見的植物揮發物，分別對其雌雄進行觸角電位 （EAG）測試。結果顯示，雌雄成蟲個體之間有11種無顯著性差異，其他7種雌雄之間均呈極顯著性差異 （P＜0.01）。其中，雌蟲對反-2-己烯醛、苯甲醛和3，4二甲基苯甲醛等3種，雄蟲對乙醛和水楊酸甲酯等2種具有較強的EAG反應 （均＞300mV）。另外發現，雌雄成蟲對于供試的醛類、酯類和酮類的平均反應值均較醇類和萜烯類的平均反應值強 （P＜0.01），而雌雄之間除醛類外，其他類別揮發物并無差異。表明桔小實蠅雌雄成蟲對植物的嗅覺選擇性和敏感性存在著明顯的差異，同時在揮發物類別上也有一定的相似性。

桔小實蠅；寄主揮發物；觸角電位；雌雄比較

桔小實蠅（Bactroceradorsalis）是一種重要的檢疫性害蟲，與多數寄生害蟲嗜好植物莖葉不同，桔小實蠅主要以香蕉、柑橘和芒果等多種果實作為寄主，其為害方式主要是以雌蟲產卵于果皮下，幼蟲取食果肉，從而導致果實腐爛或未熟先黃而落，是生產中最重要的寄生害蟲之一［1］。目前對桔小實蠅的綜合防治過程中，主要防治措施有物理防治、化學農藥防治、性誘滅雄、食物誘殺和生物防治 （釋放不育雄蟲和寄生蜂）等，其中誘劑誘殺是一種既有效又環保的防治措施，但目前采用的甲基丁香酚僅引誘雄蟲，對雌蟲的引誘作用有限［2］，而單純的雄蟲引誘難以達到預期的防治效果。所以基于寄主植物揮發物，開發和設計包括針對桔小實蠅雌蟲的新型氣味引誘劑已成為一種新的研究思路。

昆蟲可以對來自外界環境中的各種氣味物質進行嗅覺感知和精確識別，這在昆蟲進行寄主選擇、覓偶、產卵地選擇等行為中具有重要意義［3］。昆蟲對其寄主植物揮發物的嗅覺識別均主要依賴于觸角上密布的嗅覺感受器來完成的，而這些感受器能夠對某些氣味產生電信號沖動，基于此，Schneider［4］于1957年建立了一種方法，即利用電極和電流放大儀來記錄昆蟲觸角化學感受器對信息素的電信號的總體反應，即觸角電位（Electroantennogram，EAG）技術。EAG技術目前在昆蟲嗅覺電生理研究方面已經成為不可缺少的手段，也是化學生態學中最常用、最重要的電生理技術之一［5］，EAG技術能反應昆蟲觸角上所有感受器對氣味反應的整體活性情況，并能快速地推測昆蟲嗅覺對某種氣味是否產生活性和敏感性［6］。這對于開發和設計害蟲的嗅覺引誘等功能具有重要的理論意義。

目前，已經有許多關于EAG用于桔小實蠅嗅覺反應的報道，如對性誘劑［7］、啤酒廢酵母酶解液［8］、礦物油乳化后的香蕉提取物［9］、木瓜揮發物［10］以及7種寄主揮發物作為嗅覺 EAG測試［11］等，但上述研究采用的桔小實蠅主要的寄主揮發物較為單一或數量有限。因此本研究經文獻查閱并確立8種寄主18種常見的寄主植物氣味揮發物 （表1），比較研究了桔小實蠅雌雄蟲對候選氣味的EAG活性，這不僅充實了桔小實蠅嗅覺生理功能研究理論基礎，為進一步篩選對桔小實蠅雌雄蟲具有引誘活性的氣味物質提供了理論依據。

表1 桔小實蠅部分主要寄主揮發物的成分及相對含量

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

桔小實蠅為本實驗室內人工飼養的種群。飼養條件為：溫度 （26±1）℃，相對濕度 （75±5）%，光周期L∶D為12∶12（光12h，暗12h）。待其化蛹、羽化后，收集性成熟時期的雌蟲進行試驗，試驗前饑餓3h。

1.2 試驗儀器和試劑

觸角電位儀 （荷蘭Syntech公司），由智能化數據獲取控制器 IDAC-2、刺激氣流控制器（SyntechCS-55）、微動操作儀（SyntechMN-151）及Syntech軟件處理系統4部分組成。

根據相關文獻報道，確定供試的各種寄主揮發物 （表1），所有揮發物的化學標準品，均購自百靈威科技有限公司。其他耗材，如導電膠，手術刀，刀片，錫箔紙及定性濾紙等均為國產。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑及刺激樣品的制備

分別將每種化合物溶于液體石蠟，并配成0.1（V/V）溶液進行EAG測定。劑量反應測試時，選擇熒光結合試驗中具有代表性的化合物，用溶劑作為對照。

1.3.2 觸角電位測定

首先用手術刀將桔小實蠅觸角從基部切下，然后小心地將桔小實蠅觸角的兩端用導電膠分別黏在EAG的金屬電極上。這時觀察顯示屏上的基線變化情況，等到基線平穩以后，便可以開始試驗。

在濾紙條上（2cm×0.5cm）滴加10μL待測樣品溶液，使溶劑揮發一會后，再將濾紙塞進巴斯德管內，用錫箔紙把管口兩端封住，防止樣品揮發。另取10μL液體石蠟+濾紙作為空白對照。測試時將巴斯德管一端插入送氣管外側直徑為2mm的小孔內，送氣管管口與觸角縱向垂直，并與觸角相距1cm左右。同時點擊手標和踩腳踏板，刺激時間0.2s，刺激氣流為100mL·min-1，2次刺激時間相隔2min，以保證觸角感覺器的感覺功能完全恢復。

隨機測定待測樣品。由于隨著時間的延長，觸角的生理活性也會跟著降低，為避免此種情況對試驗造成不利的影響，以0.01（V/V）的葉醇 （溶劑為液體石蠟）作為標準參照刺激對各測試樣品的刺激反應進行標準化校正。因為通過預試驗發現，桔小實蠅對葉醇的反應存在穩定的峰值，所以選擇葉醇作為標準參照。在測定樣品前先進行1次對照CK（液體石蠟）和標準參照刺激，然后測試5個樣品，再進行對照和標準參照刺激，如此循環往復，每個觸角約測試5個樣品，每個待測樣品重復6次，EAG反應值參照［20］的方法計算。

1.3.3 數據統計方法

利用SPSS16.0軟件對雌雄蟲分別對所有揮發物的EAG反應的相對值采用單因素方差檢驗（P＜0.05）分析，LSD法兩兩比；雌雄蟲對某一種或某一類的揮發物之間的比較采用t檢驗分析。所有結果最后用Origin8.0軟件進行數據處理和顯示。

2 結果與分析

2.1 桔小實蠅雌雄蟲對寄主揮發物EAG反應的差異比較

為了比較18種寄主植物揮發物對桔小實蠅雌雄成蟲的EAG反應值，按照雌蟲EAG反應值從大到小排列，并對同一揮發物的雌雄EAG數據進行方差分析。結果如圖1所示，經t檢測分析，桔小實蠅雌雄成蟲個體之間對18種揮發物中的11種（61.1%）沒有體現顯著性差異，這表明大多數供試植物揮發物引發的桔小實蠅EAG反應與其性別關系不大。而其他7種揮發物均呈極顯著性差異，如雌蟲對反-2-己烯醛 （雌/雄）為 （600.95± 50.83）mV/（42.18±7.13）mV、苯甲醛 （雌/雄）為 （434.63±53.1）mV/（196.08±9.63）mV、3，4-二甲基苯甲醛 （雌/雄）為 （295.69± 25.19）mV/（42.18±7.13）mV、丁酸丁酯 （雌/雄）為 （242.57±30.57）mV/（132.08±18.33）mV和順-3-己烯乙酸酯 （雌/雄）為 （132.32± 12.8）mV/（34.5±11.7）mV等5種氣味的EAG反應較雄蟲強 （P＜0.01，**）；而雄蟲對水楊酸甲酯 （雌/雄）為 （49.17±9.11）mV/（347.26± 51.52）mV和乙醛 （雌/雄）為 （88.91±6.34）mV/（326.07±55.15）mV等2種氣味的EAG反應較雌蟲強。這表明對于某些植物揮發物，桔小實蠅雌、雄蟲可能具備獨特的嗅覺感受和分辨能力。

圖1 桔小實蠅雌雄成蟲對18種揮發物的EAG反應值比較

2.2 桔小實蠅雌雄蟲對各類氣味揮發物的EAG反應比較

將18種桔小實蠅寄主揮發物按照化合物類型分成5類，并對雌雄分別對各類的EAG反應分別進行單因素方差分析。圖2顯示，桔小實蠅雌蟲對酯類、醛類以及酮類三者反應較強。其中，醛類的整體反應最強 （反應值 ＞250mV），其次為酮類（反應值＞180mV）和酯類 （反應值 ＞140mV），這三類之間均存在顯著差異；對醇類和萜烯類的反應最弱，經方差分析，這2類揮發物與前3種揮發物存在顯著差異。桔小實蠅雄蟲對酯類、醛類以及酮類三者反應較強。其中，酯類反應最強 （反應值＞150mV），但比較結果顯示，3類物質的反應差異不顯著。雄蟲同樣對醇類和萜烯類的反應最弱，方差分析表明，這2類揮發物與前3種揮發物也存在顯著差異。

同一類揮發物雌雄進行比較 （圖2）可知，雌蟲對醛類的敏感性極顯著高于雄蟲，而雌雄蟲對其他類型的揮發物并未表現出顯著差異。此外，桔小實蠅無論雌雄對供試的醛類、酯類和酮類的平均反應值均比醇類和萜烯類的平均反應值 （反應值均＜100mV）強，且達到極顯著水平，而雌雄之間卻不顯著。這也表明桔小實蠅對某些揮發物存在著較為明顯的敏感性或選擇性，而這種性質與性別之間可能并無直接關聯。

圖2 桔小實蠅雌雄成蟲對5類揮發物的EAG反應值比較

3 討論

在開展對實蠅防治研究的過程中，除了易對環境造成污染的化學防治外，以性誘劑為代表的化學生態防治技術在桔小實蠅防治過程中具有重要的體現［21］。但取食少量的誘劑可大幅提高正常雄蟲和不育雄蟲的交配競爭能力及對雌性的吸引力，但經過一段時間的亞劑量的性誘劑處理后，桔小實蠅當代和后代雄性對性誘劑的趨性下降［22］。而EAG數據也顯示，雌雄蟲對甲基丁香酚等性誘劑的反應一般［11］。由于植食性昆蟲對其嗜好寄主植物的氣味選擇有明顯的傾向性［23］，故利用桔小實蠅寄主水果揮發性物開發食物源誘劑成為生物統合防治的重要策略。但由于桔小實蠅寄主果實很多，且每種寄主所含的植物揮發性物質的種類和含量又各有所異，因此，本研究前期篩選出幾種重要的寄主果實及其揮發物種類和含量，并利用EAG技術比較桔小實蠅雌雄蟲對18種寄主植物揮發物的嗅覺反應，通過對雌雄個體間的EAG反應進行比較發現，雌雄成蟲個體間對18種揮發物中的11種 （61.1%）并未表現顯著性差異，這表明大多數供試植物揮發物引發的桔小實蠅EAG反應與性別關系不大。

其他7種揮發物雌雄之間均呈極顯著性差異。如桔小實蠅雌蟲對反-2-己烯醛、苯甲醛和3，4二甲基苯甲醛等3種氣味分子具有顯著的EAG反應，而雄蟲對乙醛和水楊酸甲酯具有較靈敏的EAG反應。這表明桔小實蠅雌雄蟲對于某些植物揮發物可能具備獨特的嗅覺感受和分辨能力。這可能是由于昆蟲的雌、雄蟲在整個種群的生存和繁衍中承擔的責任不同，所以導致對植物氣味的反應上也經常存在著性別的差異［24］。如茶小卷夜蛾對6種寄主植物的EAG數據表明，雌蟲對寄主植物如蘋果葉、莖和果反應較大，而雄蟲則無反應［25］；而綠盲蝽的EAG反應表明，雄蟲對性信息素比雌蟲更敏感，而雌蟲則趨向于植物揮發物［26］。這可能是因為雌蟲要選擇合適的寄主植物進行產卵，所以雌雄成蟲間的嗅覺對植物的選擇性和敏感性存在著明顯差異。雌蟲在繁衍后代中需要尋找寄主植物產卵，而雄蟲則是尋找交配對象，昆蟲的不同性別對于不同揮發性物質的反應，是否是雌雄蟲分工長期對生態的適應結果。

具體來看，在醛類化合物中，桔小實蠅雌蠅對反-2-己烯醛的反應最強，其次為苯甲醛，而雄蟲對這2種揮發物的反應并不強，雌雄均達極顯著差異。而其中反-2己烯醛和苯甲醛分別在芒果皮和哈密瓜中含量最高，在柑橘［12］也均有分布，由于桔小實蠅成蟲對成熟芒果果肉揮發物能夠對桔小實蠅的雌雄蟲均有顯著的引誘作用［27］，而芒果成熟度越高，對雌蟲引誘效果越強［28］，這說明桔小實蠅雌蟲有可能是由于對這2種醛類有較強的嗅覺敏感性而對成熟芒果具有明顯的趨性。此外通過對桔小實蠅普通氣味結合蛋白2的體外功能驗證，發現其均能夠與反 2-己烯醛和苯甲醛有較強結合［29］。這從分子層面說明了這些揮發物也參與桔小實蠅的嗅覺識別過程。因此，這些揮發物有可能在雌蠅引誘劑設計和篩選方面發揮作用。對于烯烴，研究顯示，桔小實蠅雌雄成蟲對包括α-蒎烯和3-蒈烯等芒果氣味揮發性物質的嗅覺行為反應均無顯著性差異，同時也均沒有明顯的行為定向反應［30］。這與本研究中EAG的結果非常吻合，即雌雄成蟲對2種萜烯類物質的EAG反應也無顯著差異，同時也是所有測試揮發物中最弱的。

從相似點上看，桔小實蠅無論雌雄，二者對于供試的醛類、酯類和酮類的平均反應值，均要比醇類和萜烯類的平均反應值 （反應值均 ＜100mV）強，且達到極顯著水平，而雌雄之間卻不顯著，這也表明桔小實蠅對某些揮發物存在著較為明顯的敏感性或選擇性，而這種性質和性別并無直接關聯。這體現了雌雄蟲不僅對敏感類型揮發物的類別不同，對最敏感型的反應值也存在差別。此外，水楊酸甲酯和乙醛能引起桔小實蠅雄蟲觸角強烈電生理反應，這也暗示2種揮發物可能與桔小實蠅雄蟲性吸引有關，這與甲基丁香酚非常相似［7］，而這2種揮發物是否能引起雄蟲趨性還需要進一步的行為學研究。

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（責任編輯：張瑞麟）

S436.619

A

0528-9017（2016）05-0677-05

文獻著錄格式：譚靜，陳玲，李紅亮，等.桔小實蠅雌雄蟲對18種寄主揮發物的觸角電位差異比較 ［J］.浙江農業科學，2016，57（5）：677-681.

10.16178/j.issn.0528-9017.20160520

2016-01-20

浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地開放基金 （2010DS700124-KF1209）；農業部農藥殘留檢測重點實驗室開放基金 （2012PRG02）

譚 靜 （1990—），女，山東威海人，在讀碩士，研究方向為農業昆蟲學。

李紅亮，博士，副教授，主要從事昆蟲嗅覺生理生化工作，E-mail：atcjlu@126.com。商晗武，博士，研究員，從事農業昆蟲與害蟲防治工作，E-mail：hwshang@cjlu.edu.cn。