地黃根際土壤不同萃取部位的化感效應研究

陳 楓，李 娟*，聶 銘，申軍艷，索艷飛，王豐青，張重義

（1.河南農業大學 農學院，河南 鄭州 450002；2.福建農林大學 農學院，福建 福州 350002）

地黃根際土壤不同萃取部位的化感效應研究

陳 楓1，李 娟1*，聶 銘1，申軍艷1，索艷飛1，王豐青1，張重義2

（1.河南農業大學 農學院，河南 鄭州 450002；2.福建農林大學 農學院，福建 福州 350002）

為研究地黃根系分泌物的化感作用，探索其中的化感物質種類和分布，以70%甲醇提取地黃茬后根際土壤，利用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取得到不同極性的部位。通過種子發芽測試和田間盆栽試驗來檢測和驗證各部位的化感強度，利用HPLC檢測各部位中的阿魏酸、香豆酸、香草酸、對羥基苯甲酸、丁香酸五種酚酸的含量。結果表明，正丁醇部和水部能抑制種子的萌發和幼根的伸長生長，化感作用效應指數分別達到-0.22和-0.43；正丁醇部對盆栽地黃塊根的生長抑制作用最強，超過水部，其酚酸類總含量高達2.094μg·mL-1，主要含有香豆酸、對羥基苯甲酸和香草酸；地黃根系分泌物對種子和地黃塊根的影響是不同的，需要在種子發芽試驗的基礎上進一步進行盆栽塊根繁殖試驗，才能確定某些化感物質是否是導致地黃連作障礙的化感物質。

地黃；連作障礙；化感物質；酚酸

地黃（RehmanniaglutinosaLibosch.）是玄參科地黃屬多年生草本植物，主產于河南省溫縣、武陟、孟縣、修武、沁陽、博愛等地，與懷牛膝，懷菊花，懷山藥一起并稱為 “四大懷藥”，是我國栽培歷史最早的藥用植物之一［1］。地黃在種植過程中存在著嚴重的連作障礙。種植1年之后，需間隔8—10年才能再次種植［2-4］。張寶等［5-7］通過地黃種植前后土壤及其根系分泌物的分析對比，對地黃連作障礙的成因及消減技術進行研究。李振方等［8-9］研究認為，根系分泌物的化感自毒作用可能是導致地黃連作障礙的主要原因，其中的酚酸類物質可能是主要化感物質［10-13］。由于化感物質在土壤中的含量極低及分離提取困難等原因，目前地黃化感自毒作用的研究多數停留在種子發芽生物測試階段［14-15］，缺乏后期田間試驗的驗證。為進一步明確導致地黃連作障礙的化感物質，本研究以地黃茬后土壤為試驗材料，通過種子發芽生物測試和盆栽試驗來研究地黃根際土壤總提取物的不同萃取部位的潛在化感效應，并利用HPLC對其各部位中的酚酸類物質進行檢測，研究地黃根際土壤中化感物質的分布及作用方式，進一步揭示地黃連作障礙機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用土壤取自河南省溫縣姚莊堤北頭村。茬后土為2013年地黃收獲時塊根附近的土壤，對照組土壤為同一區域8年內未種植過地黃的耕層土壤。供試品種為地黃溫85-5，由溫縣農業科學研究所提供，經河南農業大學高致明教授鑒定為Rehmanniaglutinosa。

1.2 供試土樣中化感物質的提取與分離

取供試土樣200kg陰干，過40目 （0.42mm）篩。以70%甲醇超聲提取2次，過濾、合并濾液，濃縮至膏狀。水溶后以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次進行萃取，最終分別得到萃取物5.30，4.15，2.01和16.14g，以及水提物92.88g。

1.3 種子發芽生物測試

按照各萃取物在土壤中的比率分別配置母液，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水浸提液的濃度分別為0.14，0.11，0.05，0.41和2.38mg·mL-1。

種子生物測試采用培養皿濾紙法。以蘿卜種子為受試對象。試驗設5個提取部位，每個提取部位設5個濃度，分別為母液濃度的0.2，1，2，3和4倍。對照組只添加蒸餾水。重復3次。滅菌后的培養皿中放入消過毒的蘿卜種子30粒。每天補充1mL蒸餾水。培養條件為：白天溫度25℃，時間12h，光強10000lx；夜間溫度18℃，時間12h；濕度恒定。連續7d記錄種子的發芽情況，并在第7天測量種子根長。計算各萃取部位對蘿卜種子的化感作用效應指數（responseindex，RI）。

RI=（TR/CK-1）（TR＜CK）

RI=（1-CK/TR）（TR≥CK）

式中，TR為處理值，CK為對照值；RI＞0表示促進作用，RI＜0表示抑制作用。數據采用Excel2010和IBMSPSS19.0數據處理軟件進行統計分析。

1.4 田間盆栽試驗

盆栽試驗于2014年6月在河南農業大學科教園區進行。試驗用土為未種過地黃的土壤。種植前，將各萃取部位按照采集時地黃根際土壤中的濃度分別外源添加到地黃盆栽中。另設頭茬土和重茬土作為對照。每處理重復6次。生長過程中進行常規田間管理。定期測定各處理組地黃地上部位的葉片數、葉面積、冠幅、冠幅面積等形態指標和SOD活性［16］、相對電導率［17］等生理指標，收獲時測定地黃的塊根鮮重、塊根體積以及根系活力［18］。數據采用Excel2010和IBMSPSS19.0數據處理軟件進行統計分析。

1.5 HPLC檢測

1.5.1 儀器和試劑

Waters高效液相色譜儀，泵Waters1525，檢測器Waters2480，Breeze色譜工作站。阿魏酸、香豆酸、香草酸、對羥基苯甲酸、丁香酸等對照品均購自ACROS公司。流動相使用的甲醇為色譜醇，水為屈臣氏蒸餾水。所有流動相均過0.22μm微孔濾膜。

1.5.2 對照品溶液和樣品溶液的配制

稱取對羥基苯甲酸22.45mg、香草酸22.62mg、丁香酸23.60mg、香豆酸21.31mg和阿魏酸22.55mg，分別置于5個100mL容量瓶中。用少量甲醇溶解后用高純水定容，作為單一標樣的母液。分別取10mL將其稀釋100倍作為單一標樣工作液。再取各單一標樣的母液10mL混合后稀釋100倍，作為混合標樣工作液。進樣前過0.22μm微孔濾膜。

分別稱取石油醚部 139.00mg、氯仿部107.00mg、乙酸乙酯部 500.00mg、正丁醇部420.00mg和水部提取物2341.00mg，用蒸餾水定容至100mL，作為樣品溶液。進樣前過0.22μm微孔濾膜。

1.5.3 色譜條件

采用H&EAQ-C18色譜柱（4.6m×150mm，5μm），檢測波長280nm，柱溫20℃，進樣量20μL。流動相為甲醇∶水 （20∶80），水相用冰醋酸調節pH值為2.6，流速1.0mL·min-1。

1.5.4 標準曲線的制備

分別取各單一標樣工作液2，4，6，8和10mL于容量瓶，定容至10mL，搖勻。在上述色譜條件下，測定峰面積。以Y為峰面積，X為溶液濃度，求得回歸方程 （表1）。

表1 5種酚酸的標準曲線

2 結果與分析

2.1 不同處理對蘿卜種子發芽率和胚根長度的影響

地黃根際土壤提取物各部位對種子的發芽率和胚根的伸長生長均具有明顯的影響。由表2可知，除4倍濃度之外，石油醚的各濃度均能促進蘿卜種子的發芽和胚根伸長。而氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物處理對蘿卜種子的發芽率和胚根長均存在明顯的低促高抑現象。水組在1倍濃度時就表現出對種子發芽的抑制作用；4倍濃度時水組發芽率最小，為對照的69.7%，且對胚根伸長的抑制作用也最強；RI值為-0.43，與對照存在極顯著差異。正丁醇組在2倍濃度時開始對發芽率和胚根伸長起抑制作用，4倍濃度時發芽率為對照的89%，抑制指數為-0.22，與對照存在顯著差異。

2.2 盆栽地黃相關指標比較

2.2.1 地上部分生長指標

由表3可知，在出苗30d時，頭茬組地黃葉片數最多，各項指標與重茬組顯著差異。水和氯仿提取物各項指標與重茬地黃接近，與頭茬存在顯著差異。出苗60d時，頭茬組地黃生長較穩定，冠幅面積 （地黃地上部分在地面的投影面積）大幅增加。重茬組的葉片數、冠幅面積都急劇減小，與頭茬組存在極顯著差異。各處理與頭茬地黃無顯著差異。出苗90d時，各組地上部分生長減慢，地上部分冠幅減小，各組差異不顯著。

表2 不同處理對蘿卜種子發芽率及胚根長度的影響

表3 各處理在不同時期地黃地上部分生長指標比較

2.2.2 葉片SOD活性

由表4可知，在出苗30～90d期間，頭茬地黃的SOD是先增大后減小，重茬組先減小后基本保持不變，水組、正丁醇組和乙酸乙酯組 SOD一直減小。出苗30d時，重茬組SOD活性最大，正丁醇組SOD活性次之，與其他各組差異達到顯著水平，水組和乙酸乙酯組的SOD大于氯仿組、石油醚組和頭茬組，但差異未達到顯著水平。重茬組、水組、正丁醇組和乙酸乙酯組的SOD大于頭茬，這可能是該組含有的化感物質刺激了地黃的防御機制，從而使其產生大量的SOD，導致SOD顯著增加。在出苗60d，頭茬組地黃SOD最大，與各處理組均達到極顯著差異；其他各處理組SOD均顯著下降，各組間顯著未達到差異水平。在出苗90d，乙酸乙酯組SOD顯著降低，石油醚組顯著增加，其他各組與正茬地黃無顯著性差異。

表4 各處理不同時期的SOD活性比較

2.2.3 葉片相對電導率

由表5可知，在30d時，重茬組相對電導率最大，頭茬相對電導率最小。水組、正丁醇組與重茬接近，差異未達到顯著水平。乙酸乙酯組與水組、正丁醇組差異達到顯著水平，與石油醚組、氯仿組頭茬組差異達到極顯著水平。這可能是由于正丁醇組、水組和乙酸乙酯組處理導致地黃細胞膜受損導致的。在60d時，石油醚組和氯仿組相對電導率最小，與其他組差異達到顯著水平，其他各組差異未達到顯著水平。90d時，各處理組相對電導率顯著減小，與頭茬和重茬差異均達到極顯著水平，各處理組之間無顯著差異。

表5 各處理不同時期葉片的相對電導率比較

2.2.4 收獲時期的生理指標

由表6可知，在收獲期，頭茬地黃塊根質量最大，達到44.38g。正丁醇組地黃的塊根鮮重最小，為19.47g，僅為頭茬地黃的43.9%，差異極顯著；水組次之，其塊根為25.89g，為頭茬質量的58.3%，與頭茬地黃存在顯著差異；其他各處理組彼此差異不顯著。塊根體積的變化與塊根鮮重基本一致。頭茬地黃的根系活力最強，水組和石油醚組根系活力最弱，其中其余各組之間差異未達到顯著水平。

2.3 HPLC測定各萃取部位酚酸含量

通過HPLC檢測各組分溶液中5種酚酸的含量。由表7可知，石油醚部和氯仿部不含有酚酸類物質；乙酸乙酯部含有對羥基苯甲酸；正丁醇部位含有3種酚酸，分別為香豆酸，對羥基苯甲酸和香草酸，且總量最大，高達2.094μg·mL-1；水部含有酚酸種類最多，含除香豆酸之外的其他4種酚酸，酚酸總量僅次于正丁醇部，達到1.107μg· mL-1。酚酸類物質的化感作用已被許多學者證實，正丁醇部和水部具有較強的化感作用，這可能與它們含有大量的酚酸類成分有密切關系。

表6 各處理組收獲期的地黃形態及生理指標比較

表7 不同萃取部位的酚酸含量

3 小結與討論

近十年來，學者們對地黃的根系分泌物進行了系列的研究。劉紅彥等［19］研究發現，向盆栽地黃中添加地黃茬后土壤或地黃葉等殘體均能抑制地黃塊根的生長；吳宗偉等［14］研究發現，水培地黃的根系分泌物具有化感作用；李建軍等［20］研究發現，地黃塊根分泌物和根系潰爛腐解產生的化感物質能抑制地黃種子萌發和幼苗生長；李振方等［21］通過95%乙醇提取地黃的須根，并將其分為不同的萃取部位，發現乙酸乙酯部提取物能抑制種子幼根的伸長生長，地黃須根和地黃茬后土中含有同樣的化感物質，地黃收獲時散落在田間的須根可能是化感物質的一個重要來源。然而，上述這些研究主要是通過提取少量根際土壤并利用傳統的種子發芽生物測試來測定物質是否具有化感作用的。這種方法雖然時間短、效果明顯，但卻存在2個方面的問題。首先，前人在研究地黃的根系分泌物時所采集的土壤量一般較少。地黃的根系分泌物通過根系分泌和莖葉塊根等殘體的腐爛將化感物質釋放到土壤中，導致化感物質在土壤中分布不均勻，多集中在根系和腐爛的殘體附近。當地黃茬后土壤采樣量較少時，化感物質的種類和含量可能會受到影響。本研究在已有研究的基礎上，比較了不同提取溶劑及提取方法的提取效率和總提物的化感效應，最終采用70%甲醇超聲提取的方法。為了滿足盆栽試驗和后期分析試驗的需求，本試驗共提取地黃根際和根區土壤200kg，得到的化感物質種類和含量更具有代表性。其次，地黃在生產過程中主要采用種栽繁殖，對種子具有化感作用的物質是否對地黃種栽具有相同的作用還有待探討。在田間試驗中，由于土壤成分復雜以及來自土壤微生態系統的各種作用，很多在生物測試中具有活性的物質，往往在田間試驗中失去作用。因此，為了進一步明確地黃的化感自毒物質，本試驗同時利用種子發芽生物測試和盆栽試驗來測定和驗證不同萃取部位的化感作用。研究結果顯示，在種子發芽試驗中，作用最強的是水部位，其在濃度為4倍時發芽率為51.11%，根長為5.29mm，RI為-0.43；而正丁醇組發芽率為65.56%，根長為7.22mm，RI為-0.22；水組對種子發芽率和幼根伸長生長的抑制作用強于正丁醇組。田間試驗結果則表明，正丁醇組對地黃塊根發育抑制作用最強。田間盆栽結果與種子發芽試驗結果存在一定差異，這表明對種子具有化感作用的物質對塊根不一定具有化感作用。已有研究僅通過種子發芽試驗就認為，土壤中的某些化感物質就是導致地黃連作障礙的化感物質是不嚴謹的，需要進一步進行田間試驗來驗證。

本研究試驗結果表明，地黃的乙酸乙酯、正丁醇和水浸提液在不同濃度條件下影響種子的發芽率及胚根伸長，并存在低促高抑現象，高濃度的各處理組均對受試植物的幼根的伸長生長產生明顯的抑制作用。在地黃盆栽試驗中，水組、正丁醇組和乙酸乙酯組對地黃地上部的生長有一定的抑制作用，但與頭茬都沒有形成顯著差異。田間盆栽試驗結果顯示，這些部位對地黃塊根發育的影響更為顯著，其中以正丁醇部位的抑制作用最強。HPLC檢測結果也顯示，不同萃取部位的化感物質存在較大差異，以正丁醇和水部的含量和種類最多，其中正丁醇部含有香豆酸、香草酸和對羥基苯甲酸，酚酸總含量最高，達到2.094μg·mL-1。杜家方［11］對不同間隔年限地黃土壤中酚酸類成分的研究結果顯示，地黃的葉片及塊根生長與香豆酸、對羥基苯甲酸和香草酸這3種酚酸類成分呈顯著負相關，且這3類酚酸類成分在地黃茬后2～8年的土壤中均呈逐漸下降趨勢。本試驗的HPLC檢測結果也顯示，化感作用最強的正丁醇部位，其主要酚酸類物質為香豆酸、對羥基苯甲酸和香草酸。這與其研究結果基本一致，也說明地黃的自毒作用可能主要與這3種酚酸類成分有關。

與水稻、大豆、黃瓜等忌連作植物不同，地黃是典型的具有化感自毒作用的根類藥材，地黃等根類中藥材的有效成分主要是次生代謝產物。地黃在生長過程中不斷在體內積累，并向土壤中分泌次生代謝產物，這些次生代謝物質通過土壤微環境的一系列變化會對地黃塊根產生影響，可能會影響地黃塊根中有效成分的積累和變化。而這些物質與化感作用存在密切關系［22］。因此，根類藥材的化感作用可能并不能完全消除，在研究如何減輕連作障礙的基礎上，要保證藥材的有效成分不發生變化才具有意義，研究清楚化感物質的作用機制和物質基礎，對于改進藥材品質、增加藥材產量具有重要的意義。

［1］ 溫學森，楊世林，魏建和，等.地黃栽培歷史及其品種考證 ［J］.中草藥，2002，33（10）：946-949.

［2］ 張重義，尹文佳，李娟，等.地黃連作的生理生態特性［J］.植物生態學報，2010，34（5）：547-554.

［3］ 馬麗，王廣飛，王明星.連作對懷地黃塊根生長和品質的影響 ［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2011，9（4）：76-77.

［4］ 李晶晶，李烜楨，張寶，等.不同來源地黃化感物質對土壤微生物功能多樣性的影響 ［J］.廣東農業科學，2014，41（10）：48-50.

［5］ 張寶，李烜楨，馮法節，等.地黃根系分泌物化感效應與酚酸類物質的關系研究 ［J］.中藥材，2015，4（38）：659-663.

［6］ 古力，牛苗苗，鄭紅艷.連作地黃的植株形態生理效應研究 ［J］.中藥材，2013，5（36）：691-695.

［7］ 李晶晶，李煊楨，李振方，等.不同種植土壤對地黃生長和酶活性及其根際土壤微生態的影響 ［J］.植物資源與環境學報，2015，24（1）：42-47.

［8］ 李振方，齊曉輝，李奇松，等.地黃自毒物質提取及其生物指標測定 ［J］.生態學報，2010，30 （10）：2576-2584.

［9］ 李娟，黃劍，張重義，等.地黃化感自毒作用消減技術研究 ［J］.中國中藥雜志，2011，36（4）：405-408.

［10］ 郭冠瑛，王豐青，范華敏，等.地黃化感自毒作用與連作障礙機制的研究進展 ［J］.中國現代中藥，2012，14（6）：35-39.

［11］ 杜家方，尹文佳，張重義，等.不同間隔年限地黃土壤的自毒作用和酚酸類物質含量 ［J］.生態學雜志，2009，28（3）：445-450.

［12］ 李娟，申軍艷，陳楓，等.2種乙烯抑制劑對連作地黃生長的影響 ［J］.江蘇農業科學，2015，43（10）：332-335.

［13］ 馮法節，李明杰，古力，等.地黃EST-SSR標記的開發及擴增體系的建立 ［J］.廣東農業科學，2015，42（10）20-126.

［14］ 吳宗偉.地黃根系分泌物的生物活性及其分離和鑒定［D］.鄭州：河南農業大學，2009.

［15］ WUL，WANGH，ZHANGZ，etal.Comparative metaproteomicanalysisonconsecutivelyrehmanniaglutinosa monoculturedrhizospheresoil［J］.PLOSONE，2011，6（5）：1-6.

［16］ 張志良，瞿偉菁，李小芳.植物生理學實驗指導 ［M］.北京：高等教育出版社，2009.

［17］ 陳建勛，王曉峰.植物生理學實驗指導 ［M］.廣州：華南理工大學出版社，2006.

［18］ 鄭堅，陳秋夏，金川，等.不同TTC法測定楓香等闊葉樹容器苗根系活力探討 ［J］.浙江農業科學，2008（1）：39-42.

［19］ 劉紅彥，王飛，王永平，等.地黃連作障礙因素及解除措施研究 ［J］.華北農學報，2006，21（4）：131-132.

［20］ 李建軍，李靜云，王君.地黃塊根水提液對地黃種子萌發及幼苗生長的影響 ［J］.河南師范大學學報 （自然科學版），2014，42（1）：101-104.

［21］ ZHENFangLi，YANQiuYang，DONG-FengXie，etal. Identificationofautotoxiccompoundsinfibrousrootsof Rehmannia（RehmanniaglutinosaLibosch.） ［J］.PLOS ONE，2012，7（1）：1-8.

［22］ 張重義，李明杰，陳新建，等.地黃連作障礙機制的研究進展與消減策略 ［J］.中國現代中藥，2013，15（1）：38-44.

（責任編輯：張瑞麟）

S567.23+4

A

0528-9017（2016）05-0693-05

2016-03-08

國家自然科學基金 （81373910；81102756）

陳 楓 （1988—），男，河南洛陽人，碩士研究生，主要從事藥用植物栽培學研究工作，E-mail：chen_feng2014@126.com。

李 娟，博士，副教授，主要從事藥用植物栽培學與化學生態學研究工作，E-mail：juanli2003@126.com。

文獻著錄格式：陳楓，李娟，聶銘，等.地黃根際土壤不同萃取部位的化感效應研究 ［J］.浙江農業科學，2016，57（5）：693-698.

10.16178/j.issn.0528-9017.20160525