重組人白細胞介素-13在大腸桿菌中的表達純化及鑒定

林輝煌,劉春鳳,尹鳳紅,丁玉梅,陳清西*

(1.廈門大學生命科學學院,福建廈門361102;2.廈門特寶生物工程股份有限公司,福建廈門361028)

重組人白細胞介素-13在大腸桿菌中的表達純化及鑒定

林輝煌1,2,劉春鳳2,尹鳳紅2,丁玉梅1,陳清西1*

(1.廈門大學生命科學學院,福建廈門361102;2.廈門特寶生物工程股份有限公司,福建廈門361028)

采用大腸桿菌(Escherichia coli)作為宿主,通過300 L發酵罐進行中試發酵表達重組人白細胞介素-13(rhIL-13)融合蛋白;經異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導,離心發酵液收集菌體,菌體經溶解、變性、稀釋復性及親和層析捕獲,獲得融合蛋白;融合蛋白經腸激酶酶切后,再經親和層析分離和分子篩精細純化等步驟,獲得高純度rhIL-13原液.每升發酵液可獲得高純度的rhIL-13原液約30 mg.通過本純化工藝獲得的rhIL-13原液經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測,純度大于98.75%;經高效液相色譜分子排阻(HPLC-SEC)法檢測,純度為100%;質譜(MS)法測定rhIL-13分子質量為12 348 u,與理論值基本一致;采用噻唑藍(MTT)法進行比活性檢測,比活大于8.0×106IU/mg;采用HPLC-SEC法和MS法對rhIL-13二硫鍵數目和位置進行分析,結果顯示二硫鍵數目和位置與理論一致.此操作方法可獲得高純度、高活性的rhIL-13原液,并且操作簡單,易于放大,可實現工業化規模生產.

重組人白細胞介素-13(rhIL-13);表達;純化;鑒定

白細胞介素-13(IL-13)是一種多功能細胞因子,主要由T細胞、嗜堿粒細胞、漿細胞及樹突狀細胞等,尤其是Ⅱ型輔助性T細胞(Th2)在活化狀態下分泌產生[1].IL-13的主要功能包括:誘導單核細胞分化,增強主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類分子的表達[2];抑制脂多糖誘導的單核因子分泌,控制炎癥反應[3];誘導B細胞增殖及合成IgE類抗體,增強B細胞表面MHCⅡ類分子、CD23及CD72的表達[4];協同IL-2刺激自然殺傷細胞產生干擾素,從而促進單核-巨噬細胞活化和Th1的免疫反應[3].此外,IL-13還能抑制Ⅰ型人類免疫缺陷病素(HIV-1)在巨噬細胞內復制,誘導中性粒細胞中IL-1RA基因表達和蛋白質合成[5].重組人IL-13(rhIL-13)為1條非糖基化的單鏈多肽,含112個氨基酸殘基,2對二硫鍵,分子質量約為12.3 ku[6].

目前rhIL-13基本上采用基因工程方法獲得,通過對其cDNA加入特定標簽和引物后進行PCR擴增,插入到質粒中經DNA重組后篩選陽性克隆,轉化入感受態細胞中進行發酵表達獲得融合蛋白,再通過對融合蛋白酶切和下游純化獲得rhIL-13蛋白[7-9].在操作過程中,工程菌的選擇、融合蛋白的復性和純化工藝等對rhIL-13產率和生物學活性影響較大[7].本研究中采用基因工程技術獲得高效表達rhIL-13融合蛋白的表達菌株,進行300 L發酵制備融合蛋白,經變性、復性以及親和層析、分子篩層析等分離純化后獲得高純度、高活性的rhIL-13原液.

1 主要材料

大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/p ColdⅡ-IL-13基因工程菌株由廈門大學生命科學學院酶學實驗室和廈門特寶生物工程股份有限公司構建并保存;酵母提取物和蛋白胨為Oxoid公司產品,丙烯酰胺為Promega公司產品;Chelating Sepharose Fast Flow (CS)、Superdex 75(S-75)填料為GE公司產品;其他試劑均為國產分析純.

主要儀器:30和300 L全自動發酵罐,B.Braun Biotech公司;全溫振蕩器,哈爾濱東明醫療器械廠;離心機,Beckman公司;P2B005A01超濾膜,Millipore公司;Basic 100蛋白純化儀,GE公司;LC1200高效液相色譜(HPLC)儀,Agilent公司;AutoflexⅢTOF/ TOF串聯質譜儀,Bruker公司;DU800紫外-可見光分光光度計,Beckman公司.

2 實驗方法

2.1rhIL-13融合蛋白的發酵表達

取rhIL-13工程菌株BL21/pColdⅡ-IL-13,按體積比1∶400接種至100 m L LB培養基,1 L三角瓶, p H 6.0、37℃、200～250 r/min培養至菌液在600 nm處吸光度(OD600)約為1,作為一級種;一級種按體積比1∶200接種至20 L LB培養基,30 L發酵罐,p H 6.0、37℃、200～250 r/min培養至OD600約為10,為二級種.二級種按體積比1∶6接種至120 L LB培養基, 300 L發酵罐,p H 7.0、37℃、溶氧(DO)70%(飽和度)培養至菌液OD600約為5.0;將發酵溫度降至15℃,用含40 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的氮源補料液1.5 L,1 h內流加誘導,過程中補加碳源或2 mol/L NaOH以維持p H 7.0,誘導總時長約24 h.發酵完畢后離心收集菌體.

2.2融合蛋白變性與捕獲

取發酵獲得的菌體50 g,按1 g菌體對應10 m L溶液的比例重懸于500 m L 100 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L鹽酸胍、30 mmol/Lβ-巰基乙醇(β-ME)、p H 8.0的緩沖液中,冰水浴維持30 min;用高速冷凍離心機10℃、10 000 r/min離心20 min得上清.

CS層析柱用50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L鹽酸胍、3 mmol/Lβ-ME、p H 8.0的緩沖液平衡4個柱床體積,再將離心上清液上樣;然后用50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L鹽酸胍、3 mmol/Lβ-ME、20 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液和50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L鹽酸胍、3 mmol/Lβ-ME、300 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液進行分步洗脫,收集目的樣.

2.3融合蛋白復性

捕獲的變性蛋白洗脫液按體積比1∶19加入到100 mmol/L Tris-HCl、0.8 mol/L鹽酸胍、0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.5 mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)、p H 8.0的緩沖液中.10℃左右緩慢攪拌復性48 h后,超濾至小體積,再用p H 8.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)超濾置換以去除鹽酸胍、GSH和GSSG,最后收集目的樣.

2.4融合蛋白酶切與純化

將腸激酶(EK)以摩爾比1∶120加入到超濾脫鹽后的樣品中,混勻后10℃酶切約14 h.

CS層析柱用30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、p H 8.0的緩沖液平衡5個柱床體積,酶切后樣品上樣,依次用30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液,30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、100 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液和30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液進行洗脫,并收集各洗脫峰樣品.

2.5S-75層析柱精純

S-75層析柱用p H 7.4的PBS平衡3個柱床體積,取上一步中由30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液洗脫所得目的樣上樣,再用p H 7.4的PBS洗脫收集目標蛋白. 0.22μm濾膜過濾除菌,分裝即為rhIL-13原液,-65℃以下凍存.

2.6rhIL-13的純度檢測

高效液相色譜分子排阻(HPLC-SEC)純度檢測:色譜柱為TSK GEL 2000 SWxl排阻柱,規格為直徑7.8 mm,柱高300 mm,粒徑5μm,孔徑12.5 nm,球蛋白分子質量分離范圍5～150 ku;樣品稀釋到0.2 mg/m L,取50μL上樣,以0.1 mol/L PBS(p H 7.0)-0.1 mol/L NaCl溶液為流動相,流速0.7 m L/min,柱溫為室溫,檢測波長280 nm.按面積歸一化法[10]計算目標峰面積占總峰面積的百分數,得出rhIL-13的HPLC-SEC純度.

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)純度檢測:取純化后的蛋白溶液,按質量分數1.25%(250 ng)、2.5%(500 ng)、5%(1μg)、100% (20μg)的上樣量進行SDS-PAGE分析.分離膠質量分數16%,電壓80～100 V,考馬斯亮藍G250染色.還原型方法步驟同上述非還原型方法,但使用2×還原型上樣緩沖液(取1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)與2.5 ×非還原型上樣緩沖液按體積比1∶4混合).

2.7rhIL-13的理化性質分析

采用Bruker公司REFLEXTMⅢ型基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)儀,測定rhIL-13分子質量;基質為α-氰基-4-羥基肉桂酸,蛋白分子質量標準品采用Bruker公司的Protein Calibration StandardⅡ,分析軟件為flex Analysis ver.3.0.54.0.

利用人紅白血病細胞系(TF-1)對rhIL-13具有依賴生長的特性,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法對rhIL-13進行比活性測定.標準品購自R&D公司,比活為7.8×105IU/mg.

采用LC1200 HPLC儀和AutoflexⅢTOF/ TOF串聯質譜儀進行二硫鍵分析.先用胰蛋白酶酶切后HPLC收集二硫鍵連接的肽段,再用α-糜蛋白酶酶切分析二硫鍵連接方式.

3 表達純化結果分析

3.1rhIL-13融合蛋白的發酵表達

對發酵過程中不同誘導時間的發酵液進行取樣,取相同OD600的菌體,高溫破碎,SDS-PAGE檢測,結果見圖1:rhIL-13融合蛋白表觀分子質量約為17 ku (圖1中箭頭所示),隨著誘導時間的延長,發酵的目的產物逐漸增加,獲得更多的生物量積累.300 L發酵罐最終獲得發酵液約120 L,離心獲得約2 kg菌體.

圖1　rhIL-13融合蛋白發酵表達過程菌體裂解液的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of lysates of rhIL-13 expressing strain during fermentation

3.2rhIL-13融合蛋白變性與捕獲

菌體經裂解和融合蛋白包涵體溶解后,蛋白處于變性狀態.發酵表達的融合蛋白N末端帶有6個組氨酸標簽,可特異性與CS層析填料結合.純化洗脫圖譜見圖2(a),圖中I號峰為未掛柱的雜蛋白,Ⅱ號峰為上樣后預沖洗下來的雜質,Ⅲ號峰為目標蛋白,共250 m L,檢測蛋白質量濃度為1.88 mg/m L.Ⅲ號峰對應收集樣品的電泳結果見圖3中泳道1.

圖3　SDS-PAGE法分析純化過程的rhIL-13樣品Fig.3 SDS-PAGE analysis of the samples of rhIL-13 during purification process

圖2　rhIL-13的捕獲與分離純化的層析譜圖Fig.2 Chromatogram of rhIL-13 during capture and purification process

3.3變性蛋白復性與超濾

Ⅲ號峰經稀釋后復性48 h,超濾去除鹽酸胍、GSH和GSSG等,同時進行緩沖液替換,最后超濾收樣200 m L,檢測蛋白質量濃度為1.1 mg/m L,樣品電泳結果見圖3中泳道2.

3.4融合蛋白的酶切與純化

按摩爾比120∶1向超濾后樣品中加入EK,10℃酶切14 h,酶切后樣品電泳見圖3中泳道3.

CS層析柱純化過程如圖2(b)所示,3種洗脫液洗脫所得樣品(Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ)分別收集,Ⅳ號樣品(40 m L,檢測蛋白質量濃度為3.1 mg/mL)用于下一步純化;3個樣品分別進行電泳檢測,結果見圖3中泳道4,5和6.

CS層析柱分離后的Ⅳ號樣用S-75層析柱純化和緩沖液置換,收集目的樣,見圖2(c),共收集2個峰(Ⅶ和Ⅷ).圖3中,泳道7對應Ⅷ號峰樣品,泳道8和9均對應Ⅶ號峰樣品,其中泳道9樣品中添加了DTT.樣品用0.22μm濾膜過濾除菌,分裝即為rhIL-13原液,-65℃以下凍存.

3.5純化過程各樣品電泳與收率分析

從圖3中泳道1可以看出,經變性捕獲后,菌體相關蛋白雜質已基本去除,融合蛋白純度較高;從泳道2可以看出超濾操作對樣品電泳純度基本上沒有影響;從泳道3可以看出,融合蛋白酶切較完全;從泳道4,5和6可以看出,酶切后產物被有效分離,主要目的蛋白在Ⅳ號洗脫樣中,Ⅴ號和Ⅵ號洗脫樣品主要為雜質;從泳道7可以看出,樣品經S-75柱純化后,純度較高,雜質進一步得到去除;從泳道8和9可以看出,雜質主要是二聚體雜質.

純化過程各步蛋白收率見表1,由于菌體溶解后樣品中含大量菌體蛋白,定量不準,因此未獲得數據.從表1可以看出,捕獲后到原液總收率為22.6%.

表1　純化中各步收率Tab.1 The recovery rate of each operation step during purification

4 原液檢測分析

4.1rhIL-13原液活性測定

采用TF-1/MTT比色的方法測定rhIL-13的比活性.rhIL-13能促進TF-1細胞增殖,且TF-1細胞的增殖數量與培養體系中rhIL-13含量呈劑量依賴性;MTT在活細胞的線粒體中可以定量地被還原為藍色的甲臜,通過比色法測定甲臜的量可以直接表示TF-1細胞的生長狀態.標準品購自R&D,進行3組平行實驗,3次測定的相對標準差(RSD)小于10%.平均比活為9.8×106IU/mg,遠大于標準品(7.8×105IU/mg).

4.2SDS-PAGE檢測結果

用非還原型和還原型SDS-PAGE法檢測純度.分別上樣1.25%(250 ng),2.5%(500 ng),5%(1μg)和100%(20μg),電泳結果見圖4:1.25%的目的蛋白條帶亮于雜質帶,表明rhIL-13的雜質含量低于1.25%,即rhIL-13的電泳純度大于98.75%.

圖4　SDS-PAGE法測定rhIL-13純度Fig.4 Determination of purity of rhIL-13 by SDS-PAGE

4.3HPLC檢測結果

rhIL-13的HPLC-SEC檢測結果見圖5,從圖中可以得知,按面積歸一化法計算,檢測樣品中rhIL-13的峰面積占總面積的100%,即rhIL-13原液的HPLC-SEC純度為100%.

圖5　HPLC-SEC法測定rhIL-13純度Fig.5 Determination of purity of rhIL-13 by HPLC-SEC

4.4MS檢測分子質量

MALDI-TOF MS測定rhIL-13的分子質量,結果顯示rhIL-13的分子質量為12 348 u(見圖6),與理論分子質量(12 312 u)基本一致.

圖6　MALDI-TOF MS法測定rhIL-13分子質量Fig.6 Determination of mass spectrum of rhIL-13 by MALDI-TOF MS

4.5rhIL-13的二硫鍵分析

rhIL-13分子中含4個半胱氨酸,理論上其第28位的半胱氨酸和第56位的半胱氨酸形成二硫鍵,第44位的半胱氨酸和第70位的半胱氨酸形成二硫鍵.

取2份樣品(其中1份加DTT處理)分別用胰蛋白酶酶切后,進行肽圖比較分析,可得50.7 min樣品為含二硫鍵肽段.將這些肽段用α-糜蛋白酶酶切后肽圖得36.2,38.8和43.8 min 3個樣品;對MS譜圖中這3個峰進行二次解析,在分子質量1 522 u(36.2 min)和2 395 u(43.8 min)的二次圖譜中發現二硫鍵的特征譜圖;再分別取36.2和43.8 min的樣品進行MS分析,同時與加DTT處理過的樣品進行對比,除了分子質量為506 u的肽段較小且得質子能力較弱而未出現在譜圖中,其他3個肽段(分子質量分別為1 019,1 077,1 320 u)均出現在譜圖中.rhIL-13原液二硫鍵的連接情況為C28-C56和C44-C70,與理論位置一致,如圖7.

圖7　rhIL-13的二硫鍵示意圖Fig.7 Diagram of disulfide bonds in rhIL-13

5 討 論

rhIL-13目前主要通過基因工程方法進行制備,而表達載體和表達菌株各有不同,如:王文等[7]構建了大腸桿菌表達菌株rhIL-13-p GEX-4 T-2/TG1進行GST-IL-13融合蛋白表達,但由于復性時大量目的蛋白的沉淀丟失及殘留鹽酸胍和原核多肽GST的影響,測得的生物活性并不高;江陽等[8]構建了畢赤酵母(Pichia pastoris)表達菌株p PICZαA-IL-13/GS115表達制備IL-13非融合蛋白,其生物學活性達到標準品的要求.

本研究采用大腸桿菌BL21/p ColdⅡ-IL-13表達菌株進行rhIL-13融合蛋白的表達,在15℃低溫環境下進行誘導,而低溫環境下蛋白質折疊速度影響較小,轉錄和翻譯速度被充分降低,為蛋白質折疊、產生有活性的蛋白和避免非活性蛋白聚合體形成提供了充足的時間,有利于目的蛋白的產生.表達產物融合蛋白攜帶組氨酸標簽和EK酶切位點,可通過親和層析高效獲得高純度目的蛋白,簡化了下游純化工作.

本純化方法主要分為3個步驟:1)采用CS親和層析,捕獲帶有純化標簽的目標蛋白,快速地與細胞破碎后釋放的酶、核酸、菌體蛋白、內毒素以及色素分離,有利于融合蛋白的穩定;2)EK酶切后蛋白用CS親和層析純化,利用不同蛋白質氨基酸序列中組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基與固定化金屬離子結合能力不同,用不同濃度的咪唑進行蛋白分離,獲得高純度的目標蛋白;3)最后用S-75分子篩進行精細分離,去除少量多聚體雜質,并替換緩沖體系,即得rhIL-13純品.

采用TF-1細胞增殖法測定rhIL-13活性,比活超過8.0×106IU/mg;SDS-PAGE結果表明,rhIL-13電泳純度超過98.75%;HPLC-SEC純度為100%.MS檢測rhIL-13分子質量為12 348 u,與理論分子質量12 312 u基本相符;rhIL-13二硫鍵位置與理論一致,為C28-C56和C44-C702對二硫鍵.

綜上,本研究利用BL 21/p ColdⅡ-IL-13菌株實現了rhIL-13融合蛋白的高效表達,并通過3步層析獲得了高純度、高活性的rhIL-13原液,操作過程簡單,易于放大生產,為采用基因工程技術工業化生產rhIL-13提供了可靠的技術支持.

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Expression,Purification and Identification of Recombinant Human Interleukin-13 in Escherichia coli

LIN Huihuang1,2,LIU Chunfeng2,YIN Fenghong2,DING yumei1,CHEN Qingxi1*

(1.School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China; 2.Amoytop Biotechnique Company of Xiamen,Xiamen 361028,China)

The recombinant human interleukin-13(rhIL-13)fusion protein was expressed in Escherichia coli,and conducted in the 300 L fermentation and induced by isopropylβ-D-thiogalactoside(IPTG),then bacteria were harvested by centrifugation.The bacteria pellet was dissolved,denaturalized,renatured and affinity chromatography was performed to obtain the fusion protein;after proteolysis by enterokinase(EK),affinity chromatography and exclusion chromatography,about 30 mg high purity rhIL-13 was obtained per liter of fermentation liquid.Subsequently,the purity of rhIL-13 was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),showing the purity of more than 98.75%,and the result of size-exclusion of high performance liquid chromatography(HPLC-SEC)analysis was 100%.The molecular weight by mass spectrometry(MS)analysis was 12 348 u, the same as the theoretic value.In addition,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)colorimetric method was performed to determine the specific activity of protein,and the result was more than 8.0×106IU/mg.The number and position of disulfide bond were also analyzed by HPCL and MS,and data showed that the disulfide bond number and position were consistent with the theoretic values.The high purity and activity of rhIL-13 was obtained by this process,which is simple and well suited for large scale production.

recombinant human interleukin-13(rhIL-13);expression;purification;identification

Q 356.1

A

0438-0479(2016)06-0836-06

10.6043/j.issn.0438-0479.201601013

2016-01-11 錄用日期:2016-03-08

國家高技術研究發展計劃(863)項目(2007AA021604)

chenqx@xmu.edu.cn

林輝煌,劉春鳳,尹鳳紅,等.重組人白細胞介素-13在大腸桿菌中的表達純化及鑒定[J].廈門大學學報(自然科學版),2016,55(6):836-841.

LIN H H,LIU C F,YIN F H,et al.Expression,purification and identification of recombinant human interleukin-13 in Escherichia coli[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(6):836-841.(in Chinese)