禽肉彎曲菌污染分析及冷藏條件下失活動力學特征

劉 璽，潘 航，Narayan Paudyal，方維煥，李肖梁

(浙江大學 動物科學學院 動物預防醫學研究所/浙江省動物預防醫學重點實驗室，浙江 杭州 310058)

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禽肉彎曲菌污染分析及冷藏條件下失活動力學特征

劉 璽，潘 航，Narayan Paudyal，方維煥，李肖梁*

(浙江大學 動物科學學院 動物預防醫學研究所/浙江省動物預防醫學重點實驗室，浙江 杭州 310058)

為了解空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)和結腸彎曲菌(Campylobactercoli)在浙江省肉雞產業鏈中的污染狀況，及其冷藏過程中的失活特征。研究采用多重PCR方法對肉雞養殖、屠宰和銷售環節中分別采集的肛拭子、屠宰場環境和雞肉等樣品進行檢測，平板計數法對人工污染雞肉進行活菌數檢測，用于失活特征分析。結果顯示，采集的樣品中，C.jejuni和C.coli的檢出率分別為45.3%(182/402)和4.9%(20/402)；其中，養殖環節中的檢出率分別為81.2%(65/80)和0，屠宰環節中的檢出率分別為30.5%(48/157)和5.1%(8/157)，銷售環節中的檢出率分別為41.8%(69/165)和7.3%(12/165)。在6℃冷藏條件下，雞肉中的C.jejuni和C.coli失活曲線具有相似的特征，在30d貯藏期內，lg cfu分別下降了1.98和2.19；其中，0～14d細菌數量下降速度較快，14～30d細菌數量下降較為平緩。Log-logistic模型相比于Weibull模型對2種細菌的失活曲線有較好的擬合性。上述研究表明，肉雞養殖、屠宰和銷售環節中均存在著一定程度的空腸彎曲菌和結腸彎曲菌污染，其中，銷售環節中檢出率高于屠宰環節；在6℃冷藏條件下，Log-logistic方程作為2種菌的一級預測生長模型具有較好的擬合性。

肉雞；空腸彎曲菌；結腸彎曲菌；失活動力學；模型

彎曲菌是1886年被Theodor Esherich在患嬰兒吐瀉病而去世的嬰兒結腸中發現的，然而直到1973年Dekyser和Butzler才從急性出血性胃腸炎患者的血液和糞便中分離出來[1]。全球范圍內腸道感染的最常見原因是空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)和結腸彎曲菌(C.coli)。家畜和野生鳥類是彎曲菌常見宿主，人類常因為食入被污染的食物和飲水而感染。流行病學研究結果表明，由彎曲菌感染引起的人類疾病中50%～70%是由被污染的家禽產品造成的[2]，尤其是雞源產品更是彎曲菌感染傳播的重要途徑[3]。彎曲菌病不僅臨床發病率高，小劑量彎曲菌即可感染人類，導致嚴重的后遺癥，這些都表明了彎曲菌作為一個公共衛生風險的重要性[4]。

預測食品微生物學(Predictive food microbiology，PFM)是近年來快速發展的食品微生物學領域，涉及數學、工程學、微生物學等學科[5]，可以預測在特定條件下指定食物中微生物的行為變化。預測食品微生物學可以為QMRA(Quantitative microbial risk assessment)和HACCP(Hazard Analysis Critical Control Point)提供科學依據。傳統的微生物學方法通常僅根據人工培養基的試驗數據建立模型，沒有考慮食品本身與微生物的相互影響，而食物樣品染菌結合數學模型建立的預測微生物學方法可以克服這些缺點[6]。

研究采用多重PCR方法對肉雞養殖、屠宰和銷售環節中采集的肛拭子、屠宰場環境棉拭子樣品和雞肉等樣品進行檢測，旨在探明空腸彎曲菌和結腸彎曲菌在肉雞產業鏈中的污染狀況。通過C.jejuni和C.coli分別模擬污染雞肉樣品，分析6℃冷藏條件下細菌的失活特征，建立其一級預測生長模型。結果將為彎曲菌在浙江省生態分布特征及其冷藏條件下的生長預測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

采集的樣品信息見表1。402份樣品中，來自養殖場樣品80份，屠宰場環境棉拭子樣品157份，杭州主城區內超市冷鮮雞肉樣品42份和杭州城區農貿市場冷鮮禽肉棉拭子樣品123份。養雞場樣品包括隨機采集的養殖環境中雞糞便樣品和不同雞的肛拭子樣品，屠宰場樣品涉及家禽屠宰鏈的各個生產點，主要采樣點包括待宰間、瀝血間、打毛間、內臟間、消毒間、包裝間和貯藏冷庫。每個采樣點分別采集環境(地面、工作臺、貨筐和水樣等)和肉雞樣品(脫毛后雞胴體、噴淋前后雞胴體、消毒預冷后雞胴體、稱量包裝雞胴體和貯藏冷庫里雞胴體表面等)。

表1 樣品來源及數量
Table 1 Source of samples and numbers

采樣地點Samplinglocation樣品數量Numberofsamples樣品類別Typeofsamples湖州Huzhou,Zhejiang40泄殖腔棉拭子Cloacalswabs湖州Huzhou,Zhejiang40糞便Faeces義烏Yiwu,Zhejiang46屠宰鏈各環節棉拭子Swabsfromdifferentsamplingpointofslaughterchain湖州Huzhou,Zhejiang111屠宰鏈各環節棉拭子Swabsfromdifferentsamplingpointofslaughterchain超市SupermarketsinHangzhou42冷鮮雞肉Coldfreshchickenmeat農貿市場WetmarketsinHang-zhou123冷鮮禽棉拭子Swabofcoldfreshpoultry

1.1.2 主要試劑和儀器

布氏肉湯、營養瓊脂等購于中國檢驗檢疫科學研究院北京陸橋技術有限責任公司；常規試劑購于國藥集團化學試劑有限公司；微氧產氣袋和厭氧罐購于日本MGC公司；2×Easy Mix，Marker DL-2000購于北京全式金生物技術有限公司。

1.2 彎曲菌污染分析

1.2.1 樣品的采集和增菌

按照微生物采樣標準進行采樣，采集的樣品放入冰盒內立即送到實驗室。棉拭子樣品和糞便樣品加入適量PBS后振蕩均勻，取1mL稀釋液加入9mL含抗生素的布氏肉湯中。放入厭氧罐，加入微需氧產氣袋后立即密封，42℃培養約48h。

1.2.2 基因組DNA提取

取微需氧條件下42℃培養約48h的菌液2mL，13500g離心2min，棄上清。加入等體積的雙蒸水和2×TZ充分混勻，-20℃冰箱放置30min，沸水煮10min，冰浴10min，3500g離心5min，收集上清液為模板，置于-20℃冰箱備用。

1.2.3 引物設計

按照文獻[7]建立的多重PCR方法，針對Campylobacter16S rRNA基因、C.jejunimapA基因和C.coliceuE基因設計3對引物。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.4 反應體系和條件

多重PCR的反應總體積為20μL，反應體系為：2×Mix 10μL，16S-F 1μL，16S-R 1μL，mapA-F 1μL，mapA-R 1μL，ceuE-F 1μL，ceuE-R 1μL，template 2μL，ddH2O 2μL。循環參數：94℃預變性10min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸10min。擴增產物用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

表2 引物名稱、序列和擴增產物大小
Table 2 Names，sequences and product sizes of primers used

引物名稱Nameofprimers引物序列(5’→3’)Sequences(5’→3’)擴增產物大小Productsizes/bp16S-FATCTAATGGCTTAACCATTA-AAC85716S-RGGACGGTAACTAGTTTAG-TATTmapA-FCTATTTTATTTTTGAGTGCT-TGTG589mapA-RGCTTTATTTGCCATTTGTTT-TATTAceuE-FAATTGAAAAATTGCTCCAAC-TATG462ceuE-RTGATTTTATTATTTGTAG-CAGCG

1.2.5 分離

用接種環取陽性樣品的增菌液密集劃線至Skirrow瓊脂平板上，微需氧條件下42℃培養約48h待可疑性菌落長出，根據菌落形態特征挑取3～5個可疑單菌落劃線接種至新的選擇性培養基，微需氧條件下42℃培養約48h待可疑性菌落長出，然后挑取可疑單菌落劃線接種至哥倫比亞血瓊脂平板，可繼續傳代直至得到單一的純培養菌落。

1.3 失活動力學模型建立及評價

1.3.1 供試雞肉準備

超市購買冷鮮雞胸脯肉，將雞肉絞碎后稱量分裝于50mL離心管中，每份5g。將樣品送至浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所進行Co6014kGy輻照滅菌。

1.3.2 菌液準備

將凍存的C.jejuni和C.coli劃線至Skirrow平板，待菌落長出后挑取單菌落于布氏肉湯中微需氧條件下42℃培養36h，3500g離心10min，重懸沉淀調整菌液濃度約為108cfu·mL-1，備用。

1.3.3 接種培養

每份雞肉樣品中加入1mL含108cfu·mL-1的C.jejuni/C.coli。接種后放入搖床室溫下振蕩30min，讓細菌黏附在雞肉上。隨機取出3份樣品平板計數，記錄為0d起始活菌數量(N0)。剩余樣品放入冷藏柜中，每間隔48h取樣一次，每次取出3份接種樣品進行平板計數，直至第30天。

1.3.4 活菌數量測定

取出樣品后，向50mL離心管中加入20mL的質量分數為0.1%的蛋白胨水，充分振蕩均勻。將稀釋液10倍稀釋后取4個合適的稀釋度點板于哥倫比亞血平板，42℃微需氧培養48h，菌落計數并記錄活菌數量(Nt)。

1.3.5 數據分析

將所有計數結果用Excel表格匯總，計算出3個重復樣品計數結果的平均值。根據公式lg R=lg(Nt/N0)計算殘活率(R)的對數值，以殘活率對數值對冷藏時間做失活曲線。根據數據分析C.jejuni/C.coli在冷藏過程中隨時間變化活菌數量的變化情況，擬合Log-logistic和Weibull失活動力模型。

1.3.6 失活動力學模型的評價

(1)均方誤差(MSE)

MSE越小，說明模型擬合效果較好[8]。

(2)相關系數(R)

R的絕對值越高，說明2個變量之間的相關度越高。

(3)精確因子(Af)

精確因子是由Ross[9]提出，來評價預測模型的性能。

Af=10。

Af值越大，說明模型越不精確。若Af=1，則說明模型和數據擬合度最好。

2 結果與分析

2.1 不同采樣環節中彎曲菌的檢出率

2015年4月至2015年11月期間，共采集樣品402份，多重PCR檢測和結果匯總表分別見圖1和表3。結果顯示，樣品中單一空腸彎曲菌污染，可見大小分別為857和589bp的條帶(圖1，lane1，2，9，11)，單一結腸彎曲菌污染可見大小分別為857和462bp的條帶(圖1，lane12)，2種菌混合污染樣品可見857、589和462bp的條帶(圖1，lane14)，陰性樣品未見任何條帶(圖1，lane3，5，6，7，8，10，13)。C.jejuni和C.coli的檢出率分別為45.3%(182/402)和4.9%(20/402)；其中，養殖環節中的檢出率分別為81.2%(65/80)和0；屠宰環節中的檢出率分別為30.5%(48/157)和5.1%(8/157)；銷售環節中的檢出率分別為41.8%(69/165)和7.3%(12/165)。

2.2 不同分銷模式下冷鮮雞彎曲菌的檢出率

超市和農貿市場銷售是目前屠宰肉雞的2種主要分銷模式，不同分銷模式下雞肉彎曲菌的檢出率見表4。結果顯示，超市冷鮮分割雞肉中彎曲菌的污染率比農貿市場冷鮮雞肉彎曲菌污染率低(11.9% vs 61.8%)，不同農貿市場彎曲菌污染率存在一定的差異，污染嚴重的檢出率達到79.6%。

M，2000bp 分子標記；1、2、4、9、11、15、16為空腸彎曲菌；12，結腸彎曲菌；14，空腸彎曲菌和結腸彎曲菌；3、5、6、7、8、10、13未檢測到彎曲菌M，Maker DL 2000; 1，2，4，9，11，15，16represent C.jejuni; 12，C.coli; 14，C.jejuni and C.coli; No Campylobacter was detected in 3，5，6，7，8，10，13samples

表3 樣品來源及檢測結果
Table 3 Sample source and prevalence

采樣地點Samplinglocation樣品數Samplenumbers來源Source空腸彎曲菌Campylobacterjeju-ni檢出數Positivenumber檢出率Positiverate/%結腸彎曲菌Campylobactercoli檢出數Positivenumber檢出率Positiverate/%合計Total檢出數Positivenumber檢出率Positiverate/%湖州Huzhou40肛拭子Cloacalswabs3485.0003485.0湖州Huzhou40糞便Faeces3177.5003177.5義烏Yiwu46屠宰場Slaughterhouse36.50036.5湖州Huzhou111屠宰場Slaughterhouse4541.488.15349.5杭州Hangzhou165市場Market6941.8127.38149.1總計Total40218245.3204.920250.2

表4 不同分銷模式下冷鮮雞彎曲菌的檢出率
Table 4 Prevalence ofCampylobacterin meat samples from different market

采樣地點Samplinglocation樣品數Samplenumbers空腸彎曲菌Campylobacterjejuni檢出數Positivenumber檢出率Positiverate/%結腸彎曲菌Campylobactercoli檢出數Positivenumber檢出率Positiverate/%合計Total檢出數Positivenumber檢出率Positiverate/%超市Supermarket42511.900511.9農貿市場1Wetmarket1221045.014.51150.0農貿市場2Wetmarket2471430.0817.02246.8農貿市場3Wetmarket3544074.035.64379.6總計Total1656941.8127.38149.1

2.3C.jejuni和C.coli的失活動力學特征

C.jejuni和C.coli失活曲線具有相似的特征(圖2)。在30d貯藏期內，C.jejuni，C.coli的lg cfu分別下降了1.98和2.19。0～14d細菌數量下降速度較快，平均失活率分別為0.096和0.151lg cfu·d-1。14～30d細菌數量下降較為平緩，平均失活率分別為0.040和0.038lg cfu·d-1。(圖3)

2.4C.jejuni和C.coli的失活動力學模型建立及評價

2.4.1 Log-logistic模型

Log-logistic方程是1993年由Cole等[10]提出的描述微生物失活動力學特征的方程。其公式為：

圖2 雞肉中空腸彎曲菌(A)和結腸彎曲菌(B)在6℃冷藏過程中的失活特征Fig.2 Inactivation characteristics of Campylobacter jejuni (A) and Campylobacter coli (B) in chicken meat stored at 6℃

圖3 Log-logistic模型擬合空腸彎曲菌(A)和結腸彎曲菌(B)失活曲線Fig.3 Inactivation curve of Campylobacter jejuni(A) and Campylobacter coli(B) derived from Log-logistic model

式中：A表示lg(Nt/N0)下漸進線值與上漸進線值之差；σ表示最大失活速率；τ表示達到最大失活速率時間的lgt值。因要對時間取對數，所以時間值不能為0，故取t=10-6來接近時間0點。Log-logistic模型的各參數見表5。

2.4.2 Weibull模型

Weibull方程[11]屬于分布函數，該模型假設菌群中細菌之間的熱抗性有差別且失活致死分布的積累符合Weibull分布。如果失活次數服從Weibull分布，則其分布形式的方程為：

表5 Log-logistic模型的各參數
Table 5 Parameters of Log-logistic model

菌株StrainAστC.jejuni2.297-1.2510.882C.coli3.003-2.8961.112

其中：b為尺度參數，n為形狀參數。當n<1時，呈凹面向上的曲線；當n>1時，呈凹面向下的曲線。Weibull模型的各參數見表6，Weibull模型擬合空腸彎曲菌(A)和結腸彎曲菌(B)失活曲線見圖4。

2.4.3 失活動力模型評價參數表

Log-logistic模型和Weibull模型的3個評價參數見表7。2個模型的MSE、R和Af值之間差異性不顯著(P>0.05)，綜合而言Log-logistic模型對6℃下C.jejuni、C.coli失活曲線有較好的擬合性。

表6Weibull模型的各參數
Table 6 Parameters of Weibull model

菌株StrainbnC.jejuni0.49600.3939C.coli0.22910.7101

圖4 Weibull模型擬合空腸彎曲菌(A)和結腸彎曲菌(B)失活曲線Fig.4 Inactivation curve of Campylobacter jejuni (A) and Campylobacter coli (B) derived from Weibull model

表7 空腸彎曲菌和結腸彎曲菌在冷藏過程中失活動力學模型的可靠性評價

Table 7 Comparative evaluation of two models for inactivation kinetics ofCampylobacterjejuniandCampylobactercoliat low-temperature storage

菌株StrainLog-logisticmodelMSERAfWeibullmodelMSERAfC.jejuni0.0450.9341.1150.0450.9291.118C.coli0.0460.9711.1660.0610.9581.158平均值Mean0.0460.9521.1400.0530.9441.138

3 討論

從控制禽類疾病傳播、促進養禽業健康發展的長遠考慮，加強家禽流通市場的管理，對活禽進行“集中屠宰、冷鏈供應、冰鮮上市”將是必然趨勢。北京、上海、浙江及廣東等多個省份已出臺了關閉活禽交易市場的文件[12]，這意味著冷鮮雞將成為我省雞肉的主要供應方式。然而，我國冷鮮雞肉產業才剛起步，有關冷鮮雞肉的研究也才剛開始，冷鮮雞肉的安全性和可追溯性等問題亟待解決。

研究表明，人類因彎曲菌感染引起的疾病中多數是由被污染的家禽產品造成的，雞源產品更是彎曲菌感染傳播的重要途徑[13]。目前，國家規定的對食品中空腸彎曲菌的標準檢測方法為常規生化檢測。但是由于彎曲菌培養分離條件苛刻、純菌落分離困難、檢測周期長、生化鑒定結果重復性差等，造成彎曲菌的檢出率一直較低，難以反映彎曲菌在食品中的實際污染狀況[14]。何蕊等[7]研究顯示，彎曲菌的多重PCR檢測方法特異、敏感，與傳統的生化檢測方法符合性高，同時省時省力。因此，本研究采用多重PCR方法對采集的臨床樣品進行檢測。

彎曲菌生長需要微需氧條件(5%O2、10%CO2和85%N2)，國內目前大多采用燭缸法來培養該菌[15]。本研究使用厭氧罐和微需氧產氣包進行培養，試驗表明，彎曲菌可在此厭氧罐中較好地增殖。同時，在布氏肉湯中加入了FBP溶液(丙酮酸鈉、焦亞硫酸鈉和硫酸亞鐵)亦有利于彎曲菌的增殖(數據未列出)。

開展冷鮮雞全產業鏈微生物污染危害及關鍵控制點分析，是保障冷鮮雞品質和安全的有效手段。本研究圍繞養禽業的養殖—屠宰—銷售環節中的不同樣品，開展了彎曲菌污染分析，結果顯示，不同環節中彎曲菌均存在著不同程度的污染，空腸彎曲菌檢出率顯著高于結腸彎曲菌，與Chen等[16]文獻報道一致(767份肉雞糞便樣品中檢測出208份空腸彎曲菌，53份結腸彎曲菌)。從3個環節彎曲菌的檢出率分析，養殖環節(81.2%)>市場環節(49.1%)>屠宰環節(35.7%)(表3)。家禽屠宰場環境復雜，每天承擔著大量的不同來源家禽的屠宰任務，但其彎曲菌的檢出率不是最高，這與消毒減菌措施落實有關，通過加工過程中的噴淋、消毒等措施，來源于養殖場的家禽彎曲菌的檢出率大幅度降低。考慮到成本和消費習慣等因素，目前，在冷鮮雞銷售過程中尚未實行單獨包裝，每個銷售點又經銷不同來源的冷鮮雞，可能存在的交叉污染致使銷售環節中冷鮮雞彎曲菌的檢出率較高。因此，快速、正確地判別微生物污染的來源對保障冷鮮雞的安全尤為重要。不同分銷模式下冷鮮雞彎曲菌的檢出率存在著較大的差異，超市冷鮮雞肉中彎曲菌的污染率比農貿市場冷鮮雞肉彎曲菌污染率低(11.9% vs 61.8%)，這可能與超市以銷售冷鮮分割雞肉為主有關。

微生物生長預測模型對于監測產品中微生物生長動態變化提供了依據，對于食品貨架期、質量安全控制和風險評估有很大的應用價值，但由于微生物生長受到溫度、水分、pH等因素影響，建立微生物生長預測模型難度很大。考慮到家用冰箱冷藏室的溫度一般為2～10℃，本研究選擇了常用冷藏溫度6℃來進行試驗，結果顯示在30d的貯藏期內，Log-logistic模型對C.jejuni和C.coli殘活規律有較好的擬合性。我們通過數據擬合求出Log-logistic模型的各個參數，得到了一級Log-logistic模型并進行了可靠性評價，該模型可較為準確地擬合彎曲菌在冷藏雞肉產品中的失活動力學特征。試驗表明被彎曲菌污染的雞肉樣品貯存在低溫下彎曲菌不會繼續生長，冷藏可以用來作為抑制彎曲菌增殖的措施，但是一大部分彎曲菌經過長達30d的冷藏保存后依然存活。

綜上所述，肉雞養殖、屠宰和銷售環節中均存在一定程度的空腸彎曲菌和結腸彎曲菌污染，其中，銷售環節中檢出率高于屠宰環節；因此，開展冷鮮雞微生物溯源的研究對保障冷鮮雞的安全尤為重要。在6℃冷藏條件下，Log-logistic方程作為2種菌的一級預測生長模型具有較好的擬合性。結果為彎曲菌在浙江省生態分布特征及其冷藏條件下的生長預測提供參考。

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(責任編輯 盧福莊)

Investigation of Campylobacter contamination in poultry meat and its inactivation kinetics characteristics during cold storage

LIU Xi，PAN Hang，Narayan Paudyal，FANG Wei-huan，LI Xiao-liang*

(InstituteofPreventiveVeterinaryMedicine，CollegeofAnimalSciences，ZhejiangUniversity/ZhejiangProvincialKeyLabroratoryofPreventiveVeterinaryMedicine，Hangzhou310058，China)

CampylobacterjejuniandCampylobactercolicontamination were investigated in the poultry industry chain in Zhejiang province and their characteristics of inactivation in the process of cold storage were described.Multiplex PCR was used for detecting the prevalence ofC.jejuniandC.coliin poultry farms，slaughtering facilities and markets of Zhejiang province.Samples were collected as environmental swabs from farms and slaughtering facilities，meat from supermarket as well as wet markets.Simultaneously，two different models of best fit for mechanical characteristics of inactivation kinetics ofC.jejuniandC.coliduring the process of refrigeration of chicken meat were also evaluated by plate count method.The prevalence ofC.jejuniwas found to be 45.3% (n=182/402) and that ofC.coliwas 4.9% (n=20/402).The positive rate ofC.jejuniandC.coliin poultry farms，slaughtering facilities and markets were 81.2%(65/80)and 0，30.5% (48/157) and 5.1% (8/157)，41.8% (69/165) and 7.3% (12/165)，respectively.Inactivation curves ofC.jejuniandC.colishared similar kinetics.During storage at 6℃ for 30days，the lg cfu had decreased by 1.98forC.jejuniand by 2.19forC.coli.The decline in the number of bacteria for the first fourteen days was recorded to be at a faster rate as compared to the next 16days.Comparison of Log-logistic model and Weibull model for inactivation kinetics revealed that the Log-logistic model gave a better inactivation curve for fitting ofC.jejuniandC.coli.

poultry;Campylobacterjejuni;Campylobactercoli; inactivation kinetics; model

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.05

2016-04-09

浙江省科技廳重大科技專項重大農業項目(2014C02001)

劉璽(1990—)，女，碩士研究生，從事食品微生物學研究。E-mail: lliuxxi@126.com

*通信作者，李肖梁，E-mail: xlli@ zju.edu.cn

S855.1+2

A

1004-1524(2016)11-1834-08

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1834-1841

http://www.zjnyxb.cn

劉璽，潘航，Narayan Paudyal，等.禽肉彎曲菌污染分析及冷藏條件下失活動力學特征[J].浙江農業學報，2016，28(11)： 1834-1841.