圈養林麝養殖場內銅綠假單胞菌的分布及其耐藥性分析

郗立新，文彩芳，趙 珊，陳珍容，卓利苗，楊光友，顏其貴，2，*，鄭從軍，王洪永，夏中林

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130； 2.四川農業大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130； 3.四川省寶興縣林業局，四川 雅安 625700； 4.四川夾金山逢春養殖科技有限公司，四川 德陽 618100； 5.四川省峨眉山市林業管理局，四川 峨眉山 614200)

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圈養林麝養殖場內銅綠假單胞菌的分布及其耐藥性分析

郗立新1，文彩芳1，趙 珊1，陳珍容1，卓利苗1，楊光友1，顏其貴1，2，*，鄭從軍3，王洪永4，夏中林5

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130； 2.四川農業大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130； 3.四川省寶興縣林業局，四川 雅安 625700； 4.四川夾金山逢春養殖科技有限公司，四川 德陽 618100； 5.四川省峨眉山市林業管理局，四川 峨眉山 614200)

從陜西鎮坪、四川寶興兩個林麝養殖中心共采集124份樣品進行銅綠假單胞菌的分離鑒定，并采用微量肉湯稀釋法檢測其耐藥情況。結果顯示，共分離出60株銅綠假單胞菌，其中鎮坪34株，寶興26株。兩個養殖場銅綠假單胞菌檢出率由高到低依次為傷口膿汁>死亡林麝組織器官>傷皮>鼻拭子>土壤>糞便>尿液>空氣，且鎮坪比寶興的總檢出率高。所分離的60株銅綠假單胞菌耐藥表型趨于一致，都對阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星敏感，對亞胺培南中等敏感，對多西環素、四環素、磺胺異惡唑嚴重耐藥。

林麝；銅綠假單胞菌；分離鑒定；藥敏

林麝因產麝香而成為珍貴的藥用資源動物。近年來，由于麝香需求量增加，野生林麝的捕殺量迅速增多，國家一級保護動物——林麝的野生資源遭到嚴重破壞[1]。開展規范化人工養麝是保護野生資源、解決麝香資源短缺的有效途徑，但目前我國在林麝的人工養殖技術、疾病防治等方面的研究還較少[2-3]。在實際生產中，化膿性疾病是林麝的主要疾病之一，對人工養殖影響很大[4]。據統計，患化膿性疾病的林麝占病麝的50%以上，在因病死亡的林麝中，與化膿有關的占死亡總數50%以上[5]。林麝化膿性疾病病原多樣、病因復雜，但主要以銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)、金黃色葡萄球菌、化膿棒狀桿菌等感染為主[6]。

本研究通過對圈養林麝飼舍環境以及林麝體表、鼻腔分泌物、尿液和糞便等采樣檢測，分析銅綠假單胞菌在飼舍內的分布與引發化膿性疾病間的關系，為防控銅綠假單胞菌感染提供依據，同時采用微量肉湯稀釋法調查銅綠假單胞菌的耐藥情況，為臨床上優化用藥提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

參照文獻[7]的方法，于空氣、土壤、糞便、飲水、污水、臥臺、鼻腔黏液棉拭子、尿液、傷皮、膿汁、血液、死亡病麝部分臟器共采集124份樣品，其中，64份采集于四川寶興逢春林麝養殖場，60份采集于陜西鎮坪逢春林麝養殖場。病麝臟器樣品來源于前述養殖場2014年10月—2015年4月間非正常死亡的林麝，其余樣品均分別在前述養殖場內于同一時間完成采集。

1.2 主要試劑及抗生素藥品

微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；MH肉湯培養基、NAC培養基、NA營養瓊脂、無菌脫纖綿羊血購自青島日水生物技術有限公司；DNA分子標記、2×TaqPCR master mix購自TaKaRa公司；頭孢曲松(CRO)、多西環素(DOX)、阿米卡星(AMK)、亞胺培南(IPM)、慶大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZI)、環丙沙星(CIP)、四環素(TET)、氨曲南(AZM)、磺胺異惡唑(SUL)均購自中國獸醫藥品監察所；大腸埃希菌ATCC25922與銅綠假單胞菌ATCC27853用作質控菌株，由四川農業大學動物醫學院藥學系實驗室惠贈。

1.3 樣品處理及接菌計數

[8-9]的方法進行樣品預處理接菌、樣品細菌總數計數及樣品中銅綠假單胞菌計數。

1.4 菌落形態特征及染色鏡鑒觀察

將銅綠假單胞菌純化后分別接種于NA營養瓊脂培養基、NAC培養基及血瓊脂培養基，對菌落形態進行描述，并進行革蘭氏染色鏡鑒。

1.5 分子生物學鑒定

采用細菌16S rRNA通用引物[10]，對菌株進行PCR鑒定。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶純化回收后送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.6 理化特性觀察

結合菌株來源情況以及菌落形態特征，分別隨機從鎮坪、寶興樣品中各選取10株，共20株分離菌株，純化培養后，按常規方法進行生化鑒定。

1.7 藥敏試驗

參照美國臨床和實驗室標準協會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)標準，采用微量肉湯稀釋法對所有分離菌株進行耐藥表型測定，并進行多重耐藥分析。

2 結果與分析

2.1 林麝飼舍環境細菌分布

共采集124份樣品，除飲水、臥臺、血液樣品外，其余樣品類型均分離出銅綠假單胞菌，共計60株，其中，從鎮坪樣品中分離出34株，依次編為PA-ZP01至PA-ZP34，從寶興樣品中分離出26株，依次編為PA-BX01至PA-BX26。具體統計數據詳見表1。

表1 林麝飼舍環境內銅綠假單胞菌檢出情況
Table 1P.aeruginosadistribution in forest musk deer breeding farm

樣品來源Samplesource取樣地區Samplesite樣品數量Samplequantity檢出數量Detectedquantity檢出率Detectionrate/%空氣Air鎮坪Zhenping6233.3寶興Baoxing6116.7土壤Soil鎮坪Zhenping6350.0寶興Baoxing6116.7糞便Feces鎮坪Zhenping6350.0寶興Baoxing6350.0鼻拭子Nasalswabs鎮坪Zhenping4250.0寶興Baoxing4250.0飲水Water鎮坪Zhenping300寶興Baoxing300尿液Urine鎮坪Zhenping3133.3寶興Baoxing3133.3臥臺Bedroomsets鎮坪Zhenping300寶興Baoxing300傷皮Skinwounds鎮坪Zhenping4375.0寶興Baoxing4250.0膿汁Pus鎮坪Zhenping44100寶興Baoxing4250.0血液Blood鎮坪Zhenping300寶興Baoxing300剖解臟器Organs鎮坪Zhenping181688.9寶興Baoxing221463.6合計Total鎮坪Zhenping603456.7寶興Baoxing642640.6

2.2 菌落形態觀察

陜西鎮坪分離菌株在NA營養瓊脂培養基上主要形成2種菌落形態：一種為圓形，表面有金屬光澤，產藍綠色色素且有生姜氣味；一種為橢圓形，表面有金屬光澤，產藍綠色色素且有生姜氣味。四川寶興分離菌株在NA營養瓊脂培養基上主要形成1種圓形、表面有金屬光澤、產藍綠色色素且有生姜氣味的菌落形態。60株分離菌在NAC培養基上均產生明顯的玫紅色，在血瓊脂培養基上均產生透明β-溶血環，革蘭氏染色鏡鑒結果均為革蘭氏陰性桿菌。

2.3 分離菌株的16S rRNA擴增及測序鑒定結果

瓊脂糖凝膠電泳檢測16S rRNA的擴增片段大小約1500bp，與預期目的片段大小一致。測序結果經BLAST分析比對顯示，所有分離菌株的16S rRNA基因部分序列與銅綠假單胞菌同源性高達99%以上，確定分離菌株均為銅綠假單胞菌。

2.4 分離菌株的理化鑒定

將單個菌落接種于微量生化管中進行鑒定，培養特性結果顯示，該菌發酵糖的能力不強，分解葡萄糖產酸不產氣，分解尿素，不形成吲哚，氧化酶試驗陽性，可利用枸椽酸鹽，不產生H2S，MR、VP試驗均為陰性。對照說明書檢索結果，所選取菌株均為銅綠假單胞菌。

2.5 藥敏試驗結果

不同地區林麝養殖場內分離的銅綠假單胞菌對10種抗菌藥物的耐藥率總體趨于一致，但是部分抗菌藥物耐藥率存在較大差異(表2)：鎮坪所有分離株對頭孢曲松、阿奇霉素、多西環素、四環素、磺胺異惡唑均表現出極高的耐藥性，對氨曲南、亞胺培南表現出中等耐藥性，對阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星表現出敏感性；寶興所有分離株對多西環素、四環素、磺胺異惡唑表現出極高的耐藥性，對頭孢曲松、阿奇霉素、亞胺培南、氨曲南表現出中等耐藥性，對阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星表現出敏感性。

表2 銅綠假單胞菌分離株對抗菌藥物的耐藥率
Table 2 Antimicrobial resistance rate ofP.aeruginosaisolates

取樣地區Samplesite樣品來源Samplesource分離菌株數No.ofisolates耐藥率Ratioofdrugresistance/%頭孢曲松CRO氨曲南AZM阿奇霉素AZI阿米卡星AMK慶大霉素GEN多西環素DOX四環素TET磺胺異惡唑SUL環丙沙星CIP亞胺培南IPM鎮坪空氣Air210050.010000100100100050.0Zhenping土壤Soil366.733.31000010066.7100033.3糞便Feces310001000066.710010000鼻拭子Nasalswabs2100010000100100100050.0尿液Urine110001000010010010000傷皮Skinwounds3100010000100100100033.3膿汁Pus475.025.01000010075.0100025.0剖解臟器Organs1687.531.275.06.2537.5100100100037.5合計Total3488.223.588.22.9417.697.194.1100032.4寶興空氣Air100100001001001000100 Baoxing土壤Soil11001001000010010010000糞便Feces3033.366.700100100100066.7鼻拭子Nasalswabs250.050.000010010010000尿液Urine101000001001001000100傷皮Skinwounds250.001000010010010000膿汁Pus210050.050.0001001001000100剖解臟器Organs1428.614.371.47.147.14100100100035.7合計Total2664.329.265.43.843.84100100100046.2

2.6 多重耐藥分析

對60株林麝養殖場內分離得到的銅綠假單胞菌對10種抗菌藥物的多重耐藥性進行分析，從圖1可以看出，60株菌對所有抗菌藥物均呈3耐及3耐以上的多重耐藥性，多重耐藥菌株中以5耐(鎮坪41.18%、寶興46.15%)為主。

圖1 分離到的銅綠假單胞菌對不同抗菌藥物的多重耐藥性Fig.1 Multi-resistance of 60isolates of P.aeruginosa to different antimicrobial agents

3 討論

3.1 林麝飼舍環境中銅綠假單胞菌的分布檢測與分離鑒定

目前，關于圈養林麝養殖場內銅綠假單胞菌的分布研究未見報道。張鄧華等[7]通過對重慶動物園動物環境中常見病原菌的調查發現，動物飼舍環境的細菌污染指數除與飼舍內的通風、溫度、濕度、光照等因素有關外，與飼舍中所飼養的動物種類、動物的生活習性及動物的密度和日常飼養管理也有密切的關系。本研究鎮坪與寶興樣品中銅綠假單胞菌檢出率存在明顯差異，從試驗結果可以看出：(1)飼舍內通風不良，且鎮坪比寶興情況更嚴重，使得空氣成為感染源，容易引發傷口感染或呼吸道感染；(2)銅綠假單胞菌可通過糞便、尿液排出，并可能污染土壤使其成為感染源；(3)除死亡病麝臟器外，兩個地區養殖場中傷口化膿液與傷口皮膚的銅綠假單胞菌檢出率最高，可能是銅綠假單胞菌與其他細菌的混合感染造成傷口化膿；(4)雖然飲水、臥臺和血液樣品中均未檢出銅綠假單胞菌，但是飲水、臥臺樣品中仍檢出其他細菌，因其與林麝有直接接觸，所以平時要加強消毒滅菌，減少患病風險。

伍清林等[11]對南京紅山森林動物園部分動物的生存環境進行檢測發現，土壤中的細菌菌落總數、銅綠假單胞菌數相對較多，土壤是動物感染環境中銅綠假單胞菌的主要來源。但本研究顯示，鎮坪與寶興兩個養殖場最大的感染源是傷口膿汁、傷皮，其次為鼻拭子、土壤、糞便、尿液和空氣。建議兩個養殖場的飼養管理人員加強飼舍通風，注意防寒保暖，減少外界因素對林麝的刺激，定期對飼舍進行全面消毒，每天按時打掃圈舍并及時更換飲水，做好疾病監測，發現病麝及時隔離，防止交叉感染。

3.2 銅綠假單胞菌的耐藥性分析

多數報道認為，銅綠假單胞菌對慶大霉素、多粘菌素、羧芐西林等藥物敏感，對治療銅綠假單胞菌感染引起的化膿性炎癥有效[12-13]；也有報道認為，頭孢他啶是治療銅綠假單胞菌感染的首選藥物[14]。然而銅綠假單胞菌有復雜的耐藥機制，加之抗生素的不合理使用，總體來說耐藥率不斷上升[15]，這使其相關疾病的治療變得越來越棘手。

本試驗中兩個地區養殖場分離的銅綠假單胞菌耐藥情況趨于一致，這與兩個養殖場所處的地理環境和抗菌藥物的使用情況密切相關。有報道認為，環境脅迫是細菌變異進化的重要誘因[16]，兩個養殖場均位于海拔1500m左右的山區，氣候類型都屬于亞熱帶山地濕潤氣候，環境條件基本一致。也有報道認為，抗菌藥物的選擇壓力與細菌耐藥相關[17]，考慮到企業可能針對常見疾病的治療對各個養殖場的獸醫人員進行過相同的指導培訓，所以兩個養殖場在抗菌藥物的選擇和使用上也較為一致，這就造成了相同或者相近的抗菌藥物選擇壓力。60株分離菌對磺胺類、大環內酯類、四環素類抗菌藥物耐藥率高達65%以上，這可能是抗菌藥物的不合理使用與銅綠假單胞菌自身耐藥機制共同作用導致。鎮坪分離菌對頭孢曲松耐藥率較高，比較發現，該養殖場在治療林麝化膿性炎癥時均首選頭孢曲松，這可能是主要誘因。兩個養殖場的多重耐藥情況均十分嚴重，可能是獸醫人員長期使用同種藥物治療化膿性疾病所致，建議在使用抗生素藥物之前，進行簡易藥敏試驗并遵循試驗結果合理用藥。根據本試驗結果，喹諾酮類藥物是治療兩個養殖場銅綠假單胞菌感染的較為理想的藥物，可與氨基糖苷類抗菌藥物聯合用藥，以達到最佳的治療效果。

綜上所述，化膿性病灶是兩個林麝養殖場飼養環節中最大的銅綠假單胞菌污染源，喹諾酮類藥物是治療鎮坪、寶興林麝養殖場銅綠假單胞菌感染的最佳用藥。此研究結果可為跨地區林麝化膿性炎癥的防控與治療提供理論依據，同時也可為林麝的日常飼養管理提供科學參考。

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(責任編輯 高 峻)

Distribution-survey of Pseudomonas aeruginosa of captive forest musk deer and analysis of drug resistance

XI Li-xin1，WEN Cai-fang1，ZHAO Shan1，CHEN Zhen-rong1，ZHUO Li-miao1，YANG Guang-you1，YAN Qi-gui1，2，*，ZHENG Cong-jun3，WANG Hong-yong4，XIA Zhong-lin5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.AnimalEpidemicDiseaseandHumanHealthKeyLaboratoryofSichuanProvince，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 3.SichuanBaoxingCountyForestryBureau，Ya’an625700，China; 4.SichuanFeng-chunBreedingTechnoloygCo.，Ltd,Deyang618100，China; 5.E’meishanForestryAdministrationBureauofSichuanProvince，E’meishan614200，China)

A total of 124samples were collected from Zhenping Country，Shaanxi Province and Baoxing Country，Sichuan Province，and were used to isolate and identifyPseudomonasaeruginosa，as well as to test their drug resistance by traditional bacteriological identification methods.It was shown that 60P.aeruginosastrains were isolated，of which 34were isolated from Zhenping，and 26were isolated from Baoxing.The detection rate decreased as wound pus>dead deer tissues and organs>skin wounds>nasal swabs>soil>feces>urine>air.The detection ratio of Zhenping samples was higher than that of Baoxing.All 60isolatedP.aeruginosastrains exhibited similar resistance phenotypes.All strains were sensitive to amikacin，gentamicin，ciprofloxacin，and were moderately sensitive to imipenem，but were resistance to doxycycline，tetracycline，sulphamethoxazole.

forest musk deer;Pseudomonasaeruginosa; isolation and identification; susceptibility

??(

)：

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.07

2016-04-13

四川省科技支撐計劃項目(2014SZ0132)

郗立新(1991—)，男，陜西鳳翔人，碩士研究生，研究方向為獸醫微生物與免疫學。E-mail: 13547480554@163.com

*通信作者，顏其貴，E-mail: yanqigui@126.com

S855.1+2

A

1004-1524(2016)11-1847-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1847-1852

http://www.zjnyxb.cn

郗立新，文彩芳，趙珊，等.圈養林麝養殖場內銅綠假單胞菌的分布及其耐藥性分析[J].浙江農業學報，2016，28(11)： 1847-1852.