四川紅原縣牦牛隱孢子蟲感染情況分子流行病學調查

郝力力，李 銳，段 玲，賀 亮

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041； 2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州310021； 3.國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203)

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四川紅原縣牦牛隱孢子蟲感染情況分子流行病學調查

郝力力1，李 銳2，段 玲1，賀 亮3，*

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041； 2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州310021； 3.國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203)

為調查紅原地區牦牛隱孢子蟲感染情況，采用巢式PCR對采自紅原縣的216頭份牦牛糞便進行了檢測(其中包括腹瀉糞便樣本18份)。該地區牦牛隱孢子蟲總感染率為14.8%，其中Cryptosporidiumbovis感染率為3.7%，C.ryanae感染率為5.1%，C.andersoni感染率為6.0%，而腹瀉樣本并未檢出隱孢子蟲。以上結果表明，牦牛是隱孢子蟲的天然宿主，但該實驗中未見隱孢子蟲和牦牛腹瀉間存在明顯相關性，隱孢子蟲和牦牛腹瀉之間的關系需要后續研究來進一步闡明。

牦牛；隱孢子蟲；腹瀉

隱孢子蟲是一種能引起人和動物腹瀉的重要機會性原蟲，由其引起的隱孢子蟲病是一種人獸共患病。它具有廣泛的宿主類型，可以寄生于哺乳類、鳥類、爬行類及兩棲類等240多種動物(包括人)，并且可通過水源、食物、空氣等多種途徑傳播[1]。隱孢子蟲主要感染幼兒、幼畜以及免疫缺陷的人畜，免疫系統發育正常的人和動物也能感染，隱孢子蟲病已被列為人類最常見的6種腹瀉疾病之一[2]，具有重要的公共衛生意義。

我國是世界擁有牦牛數量最多的國家，約有1400多萬頭，占世界牦牛總數的95%以上。四川省是牦牛大省，近年來發現紅原地區牦牛春夏之際經常發生季節性腹瀉，并常伴有血便，不僅大大降低了牦牛的生產性能，嚴重時還會導致病畜死亡，給牧民造成較大的經濟損失。因此，本課題擬對紅原地區牦牛進行隱孢子蟲分子流行病學調查，以確定該地區流行的隱孢子蟲種類，為紅原地區牦牛隱孢子蟲病的防控和畜牧業的健康發展奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設備和試劑

糞便DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Stool Kit)，臺式高速離心機(eppendorf 5402型)，Bio-Rad伯樂梯度PCR儀(PTC240型)，水平電泳儀(BG-subMIDI型，北京百晶公司)，2×EasyTaqPCR SuperMix(北京全式金公司)和2.5%重鉻酸鉀溶液(自制)。

1.1.2 糞便樣本的采集

采集新鮮牦牛糞便30～40g，立即放于80mL離心管中，加體積1.5倍的無菌蒸餾水配制的2.5%重鉻酸鉀溶液4℃保存。樣本總量為216頭份，其中腹瀉糞便樣本18份。

1.2 方法

1.2.1 改良抗酸染色

將糞樣混合均勻，從中取5～10g置小燒杯中，加少量無菌蒸餾水浸泡30min，然后搗碎糞便成泥狀，再加適量水充分攪勻，銅篩過濾。濾液置離心管中以1006g離心10min，棄去上清液。取濃集糞樣涂片，按照Lindsay等[1]報道的方法進行染色，于1000倍鏡下觀察拍照。

1.2.2 飽和蔗糖溶液漂浮法富集隱孢子蟲卵囊

取糞樣10g加20倍量的無菌蒸餾水攪拌均勻，先后用80目和130目金屬篩過濾，濾液置于離心管中以1006g離心10min，棄上清，再加入50mL飽和蔗糖溶液，用玻璃棒攪拌均勻，再以1006g離心10min，用自制的鐵絲網吊環蘸取表層液，然后在裝有約100mL自來水的燒杯中涮洗，將表層富集的卵囊全部收至燒杯中制成卵囊混懸液，再將卵囊混懸液倒入離心管中以1006g離心10min，棄上清，沉淀用于DNA的提取。

1.2.3 糞便總DNA和富集后卵囊DNA的提取

取混勻后的糞便2g，采用QIAamp DNA Stool Kit大樣本量提取方法提取糞便總DNA;富集后的卵囊按照 QIAamp DNA Stool Mini Kit 說明書進行操作，取200mg沉淀進行提取，提取后電泳檢測提取質量。

1.2.4 PCR檢測

先采用彭昊等[2]建立的牛隱孢子蟲的快速檢測方法，以2g糞便中提取的總DNA為模板進行PCR鑒定，靶基因為ITS-1，片段大小為263bp。PCR陽性的樣本采用飽和蔗糖溶液漂浮法富集卵囊后進行抗酸染色，觀察是否有卵囊，染色陽性則提取富集后含有卵囊的沉淀物總DNA，采用Xiao等[3]方法，根據隱孢子蟲18S rRNA序列合成2對引物進行巢式PCR，目的片段長度大小為570bp左右。PCR反應結束后取2μL反應液進行電泳，出現目的條帶的樣本TA克隆后雙向測序。

1.2.5 進化樹分析

核苷酸序列應用Clustal X 1.81進行比對，分子進化樹用MEGA 7構建。

2 結果與分析

2.1 ITS-1PCR檢測結果

采用彭昊等[2]建立的PCR方法進行檢測，216頭糞便樣本共檢出32頭陽性，如圖1所示，在250～500bp間出現目的條帶，目的條帶為263bp?？偢腥韭蕿?4.8%，18份腹瀉樣本均未檢出。

2.2 改良抗酸染色結果

經過飽和蔗糖溶液漂浮的卵囊直接在顯微鏡下觀察均呈現淡玫瑰紅色(圖2-A，B)，卵囊外圍環繞有淡綠色的光圈，卵囊形狀為卵圓形。改良抗酸染色后的隱孢子蟲卵囊為卵圓形，卵囊呈深玫瑰紅色(圖2-C，D)，殘體背景為鮮艷藍綠色，卵囊對比分明，32頭ITS-1PCR陽性樣本染色后觀測均為陽性。

M，DL 2000marker；1—6，糞便樣本；7，陽性對照；8，陰性對照M，DL 2000marker; 1-6，Fecal sample; 7，Positive control; 8，Negative control

圖2 飽和蔗糖法分離出的卵囊和改良抗酸法染色后的卵囊Fig.2 Cryptosporidium oocyst under the Shether’s sugar flotation technique and the modified acid-fast stain method

2.3 18s rRNA PCR檢測結果

采用Xiao等[3]建立的方法對染色陽性樣本進行檢測，均擴增出目的條帶，目的條帶為570bp左右，如圖3所示，最右側為陰性對照。條帶回收后進行TA克隆，對應的每個回收產物挑選3個菌落雙向測序。

2.4 進化樹分析

將32個18s rRNA PCR陽性樣本測序后，最終得到3個克隆，采用NCBI blast在線比對后，分別和牛隱孢子蟲(C.bovis)、瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)和安氏隱孢子蟲(C.andersoni)的同源性較高，均為100%。32個陽性樣本中分別對應牛隱孢子蟲陽性樣本8個，瑞氏隱孢子蟲陽性樣本11個，安氏隱孢子蟲陽性樣本13個，對應216份糞便樣本的感染率分別為3.7%、5.1%和6.0%。將3個分離株(C.ryanaeHongyuan;C.bovisHongyuan ;C.andersoniHongyuan) 的測定序列和 GenBank 參考序列(C.parvumAJ493076；C.ryanaeJN40088；C.andersoniJN400881；C.bovisKM873713；C.ubiquitumKT027447；C.suisKJ790244)進行種系發育關系分析，構建進化樹，如圖4所示，3個分離株均和對應的隱孢子蟲種位于同一分支。實驗中也嘗試了對PCR產物進行直接測序，出現雙峰現象，如圖5-A所示。

M，DL 2000marker；1—3，糞便樣本；4，陽性對照；5，陰性對照M，DL 2000marker; 1-3，Fecal sample; 4，Positive control; 5，Negative control

圖4 三個分離株在基于18S rRNA 基因構建的隱孢子蟲進化樹上的分布Fig.4 Distribution of 3Cryptosporidium spp.isolates in the phylogenetic tree of Cryptosporidium based on 18S rRNA gene

圖5 PCR產物直接測序時出現的雙峰現象(A)及正常的單峰(B)Fig.5 Sequencing results of PCR products with two peaks(A) and single peak(B)

3 討論

隱孢子蟲的檢測多以18s rRNA基因為目的基因，通過巢氏PCR擴增目的片段[4-5]。和常規PCR相比，巢式PCR敏感性是常規PCR方法的40倍以上[6]，在本實驗中，以ITS-1為靶基因，先對糞便樣本進行初步檢測，由于產物序列較短，只有263bp，PCR擴增效率較高，適合對糞便樣本進行隱孢子蟲的快速初篩。初篩后采取飽和蔗糖漂浮法富集蟲體，提取DNA，再對18s rRNA 進行PCR鑒定，條帶較亮(圖3)。曾嘗試直接提取糞便總DNA后進行18s rRNA PCR擴增，有些目的條帶十分微弱。這一現象說明采用飽和蔗糖法富集蟲卵后，一方面提取的沉淀總DNA中蟲卵DNA含量較多，另一方面除去了大部分雜質，提取的總DNA中PCR反應抑制物相對減少，這樣無疑提高了PCR反應效率，也同時提高了檢出率。除此之外，本實驗中部分樣本PCR產物直接測序時結果為雜合雙峰(圖5)，無法讀出序列，但是PCR產物電泳條帶特異，無雜帶，這一現象提示可能存在混合感染，也就是說，PCR產物可能是至少2個種的隱孢子蟲18s rRNA基因擴增產物的混合物。針對此現象，曾嘗試多次TA克隆后進行測序，但只能得到同一個克隆。

隱孢子蟲已被列為人類最常見的6種腹瀉疾病病原之一，紅原地區春夏之際牦牛經常腹瀉，嚴重時甚至產生血便。何美琳等[7]采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對來源于川西北阿壩州8縣的1070份牦牛血清中牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrheavirus，BVDV)、牛冠狀病毒(bovinecoronavirus，BCV)和牛輪狀病毒(bovinerotavirus，BRV)進行抗體檢測。結果顯示，BVDV、BCV和BRV抗體平均陽性率分別為44.3%、84.1%和94.4%，表明牦牛普遍感染導致腹瀉的病毒。通過檢索PubMed發現，報道牦牛感染隱孢子蟲的文章只有5篇[8-12]，這5篇報道中隱孢子蟲感染率分別為24.2%、30.0%、5.26%、4.0%和28.5%，總共檢出了C.andersoni，C.ryanaecattletype，C.ryanaebuffalotype，C.suis-like，C.ubiquitum，C.xiaoi和一個新基因型，并且存在混合感染的情況，但檢測的糞便樣本中都沒有腹瀉樣本。

而在本研究中，隱孢子蟲總感染率為14.6%，216頭糞便樣本中有18份為腹瀉樣本，但是均未檢出隱孢子蟲，原因可能是由于在高原地區采集樣本的時間限制，無法在短時期內收集到較多的腹瀉樣本，而較少的樣本量則無法說明腹瀉牦牛隱孢子蟲的實際感染狀況。

綜上所述，本研究一方面初步明確了紅原地區牦牛是隱孢子蟲的天然宿主，檢出了瑞氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲3個蟲種；另一方面由于采集到的腹瀉糞便樣本數量較少并且未檢出隱孢子蟲，因此并不能說明隱孢子蟲和牦牛腹瀉間存在明顯相關性，留待收集較多的腹瀉樣本后再做進一步研究。

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(責任編輯 盧福莊)

Prevalence and molecular identification of Cryptosporidium spp.in yaks in Hongyuan County of Sichuan Province

HAO Li-li1，LI Rui2，DUAN Ling1，HE Liang3，*

(1.CollegeofLifeScience&Technology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China; 2.InstituteofQualityandStandardforAgro-products，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 3.NationalShanghaiCenterforNewDrugSafetyEvaluationandResearch，Shanghai201203，China)

In order to investigate prevalence ofCryptosporidiumspp.in yaks in Hongyuan County，in this study，Cryptosporidiumisolates from 216fecal samples were identified by nest-PCR method (including 18diarrhea fecal samples).Total infection rate ofCryptosporidiumwas 14.8%.It showed that prevalence ofCryptosporidiumbovis，C.ryanaeandC.andersoniwas 3.7%，5.1% and 6.0%，respectively.However，noCryptosporidiumspp.was detected in 18diarrhea fecal samples.Above results showed that yaks were natural hosts ofCryptosporidiumspp..But in this study，no obvious correlation existed betweenCryptosporidiumspp.and diarrhea，and the relationship betweenCryptosporidiumspp.and diarrhea in yaks should be further explored.

yaks;Cryptosporidiumspp.; diarrhea

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.06

2016-03-04

西南民族大學中央高?；究蒲袠I務費青年教師基金項目(2016NZYQN34)；國家科技支撐項目(2014BAD13B03)

郝力力(1980—)，男，山西長治人，博士，副研究員，研究方向為分子寄生蟲學。E-mail： leelee_hao@126.com

*通信作者，賀亮，E-mail： microvet@163.com

S855.9+9

A

1004-1524(2016)11-1842-05

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1842-1846

http://www.zjnyxb.cn

郝力力，李銳，段玲，等.四川紅原縣牦牛隱孢子蟲感染情況分子流行病學調查[J].浙江農業學報，2016，28(11): 1842-1846.