隔藥餅灸對子宮內膜異位癥大鼠p38MAPK信號通路的干預作用

覃肯,王萍,肖小文,羅薇絮,周志剛

?

隔藥餅灸對子宮內膜異位癥大鼠p38MAPK信號通路的干預作用

覃肯1,王萍1,肖小文1,羅薇絮2,周志剛1

(1.江西中醫藥大學,南昌 330004;2.岳陽天添藥用膠囊有限公司,岳陽 414017)

目的 觀察隔藥餅灸對子宮內膜異位癥大鼠p38MAPK信號通路的干預作用。方法 將34只大鼠隨機分為A組(空白對照組)8只和造模組26只,造模組大鼠參照子宮內膜異位癥造模方法進行造模,然后隨機在造模組中選擇2只大鼠處死后檢驗造模結果。將造模成功后的大鼠隨機分成B組(隔藥餅灸組)、C組(西藥組)和D組,每組8只。B組采用隔藥餅灸關元穴治療,C組采用灌服達那唑溶液治療,D組造模后不予以任何治療。20 d后處死各組大鼠并取出實驗標本。通過熒光定量PCR檢測各組樣本IFN-g與IL-4的表達;通過Western-blot檢測各組樣本磷酸化p38MAPK的表達。結果 與A組比較,B組、C組和D組大鼠的IL-4mRNA和磷酸化p38MAPK表達顯著上升(均＜0.05),IFN-gmRNA表達顯著下降(均＜0.05)。與D組比較,B組和C組大鼠的IL-4mRNA和磷酸化p38MAPK表達顯著降低(均＜0.05),IFN-gmRNA表達顯著上升(均＜0.05)。與B組比較,C組磷酸化p38MAPK、IL-4mRNA和IFN-gmRNA表達無顯著性差異(均＞0.05)。結論 隔藥餅灸能抑制p38MAPK信號通路,抑制IL-4的表達,促進IFN-g生成,誘導Th細胞向Th1分化,恢復Th細胞動態平衡。

針灸療法;子宮內膜異位癥;隔物灸;藥餅灸療法;p38MAPK信號通路;Th細胞分化;穴,關元;大鼠

子宮內膜異位癥(endometriosis, EMs)是一種病因尚不明確的復雜性疾病,其臨床癥狀(如痛經、不孕、性交痛等)嚴重地影響了現代女性的生活質量。有研究[1]表明,約68%的EMs患者表示自己的工作效率受到了影響,約63.3%的患者感覺日常活動受到干擾,患者平均每星期為此而損失的工作時間達8.34 h。EMs的發病機制目前尚不明確,發病學說眾多,但均難以詮釋清楚EMs的發病機制,廣泛接受的病因學說為經血逆流學說。EMs的主要治療手段是以手術為主,輔以抑制卵巢功能的藥物,但長期服用抑制卵巢功能的藥物會產生較多不良反應,若采用保守性手術的辦法其復發率可達27%～40%,復發后再手術的難度較大,且手術并發癥發生率高達30%[2]。以上這些問題均導致EMs成為當代婦科急需攻克的一個疑難疾病。

現代研究表明,Th1/Th2的失衡是導致EMs發生的主要因素之一,當EMs發生時,患者體內Th2細胞及其分泌產物相對正常值顯著升高,此時機體整體處于免疫抑制狀態,這給異位的子宮內膜細胞侵襲與生長提供了有利的環境[3]。越來越多的證據也表明EMs中子宮內膜組織的種植具有類似于炎癥的特征[4]。絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPK)是細胞內一個重要的信號傳導通路,其參與了炎癥、細胞分化和細胞凋亡等多種生理過程的調節。而在細胞免疫過程中p38MAPK通過調節Th細胞的細胞因子(如IL-4、TNF-a等)來達到調節Th細胞漂移的作用。本研究以磷酸化p38MAPK 和Th1/Th2細胞特征性細胞因子INF-g/IL-4作為觀察指標,探討隔藥餅灸對EMs大鼠p38MARK信號通路的干預作用,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

34只雌性未孕9周齡清潔級SD大鼠,體重為(200±20)g,置于室溫[(25±2)℃]中,12 h晝夜循環光照環境下飼養,自由攝食、飲水。動物購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[動物許可證號SCXK(湘)2013- 0004]。

1.2 藥品與試劑

藥餅(采用上海中醫藥大學針灸經絡研究所制備的藥餅,將附子、肉桂、丹參、紅花、木香等藥物切細研末,以黃酒調和做成厚約0.4 cm、直徑約2 cm大小的藥餅,中間用針刺數孔);特制細艾條(南陽漢醫艾絨有限責任公司,直徑約為5 mm);達那唑膠囊(民生藥業生產,國藥準字H33022461);Trizol(Aidlab公司提供,批號Lot:252250AX);RNase Inhibitor(TransGen公司提供,批號LOT#I21222);山羊抗兔IgG二抗(中國聚研生物科技有限公司);Western-blot一抗稀釋液(碧云天生物技術研究所)。

1.3 儀器

實時熒光定量PCR儀(美國Illumina公司ABI7900型);顯微鏡(尼康E100型生物顯微鏡);電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司);紫外分析儀(北京君意東方電泳設備有限公司);Western-blot轉膜儀(美國Bio-Rad公司);MiniTrans-blot轉移系統(美國Bio-Rad公司)。

1.4 造模與分組

先將34只大鼠隨機分為A組(正常對照組)8只和造模組26只。

造模組術前給予己烯雌酚0.02 mg/kg灌胃5 d,使造模時大鼠統一處于動情期。參照改良后的EMs造模方法[5]造模,即在無菌條件下,3%戌巴比妥納(50 mg/kg體重)麻醉大鼠后,于大鼠尿道上端約1 cm處,縱向切開皮膚及腹壁,暴露子宮,結扎子宮動脈,并于結扎處上端切除1段長度為1～2 cm的子宮片段,且迅速將其置于洛氏營養液中,而后將斷開的子宮兩端用7-0無菌眼科線行端端縫合操作。在營養液中將子宮內膜與子宮基層分離成面積約5 mm×5 mm大小的正方形片段,然后將其固定并縫合在左側腹壁上。0.9%生理鹽水沖洗移植處,灑入適量的頭孢氨芐膠囊粉末,最后逐層關閉大鼠腹部,并進行消毒。術畢將動物籠單放,讓其自然蘇醒。7 d后隨機挑選2只已造模的大鼠,斷頭處死后開腹顯示病灶處均異位內膜體積增大,為直徑5～8 mm的半透明囊腫,內有液體積聚,異位內膜有血管形成,提示造模成功。然后將造模大鼠隨機分為B組、C組和D組,每組8只。

1.5 實驗方法

A組常規飼養20 d,不作任何實驗處理。

B組采用隔附子餅灸治療。取關元穴[6],定位為大鼠臍下約25 mm,約在后肢根部與前正中線交點處。固定大鼠后,在穴位上放置附子餅,點燃艾炷后置于藥餅上,共灸2壯。每日1次,7 d為1個療程,療程之間間隔3 d,共治療2個療程。

C組大鼠灌服達那唑溶液0.3 mL(含生藥12 mg,以0.9%生理鹽水溶解)。每日1次,7 d為1個療程,療程之間間隔3 d,共治療2個療程。

D組大鼠造模后固定于手術板上15 min,其間不作任何處理。每日1次,7 d為1個療程,療程之間間隔3 d,共治療2個療程。

1.6 觀察指標

1.6.1 RT-PCR檢測IL-4 mRNA、IFN-gmRNA表達

末次給藥24 h后斷頭處死所有大鼠,在造模縫合處尋找異位內膜,仔細剪取異位內膜組織,放入液氮并轉入-80℃冰箱。

采用Trizol一步法提取細胞總RNA。用DNA/RNA測定儀檢測RNA濃度和純度。取2mg總RNA,加入Oligo(dt)15引物及逆轉錄酶在25mg體積下,37℃、60 min完成逆轉錄反應后,進行聚合酶鏈反應。IL-4mRNA和IFN-gmRNA引物序列由上海生物工程公司根據GenBank序列設計合成。IL-4引物序列為,上游5’-GTATCCACGGATGTAACGACAGCC-3’,下游5’-AGCT TCTCTAGTGAGTTCAGACCGC-3’;IFN-g引物序列為,上游5’-GTATCCACGGATGTAACGACAGCC-3’,下游5’-GAGT TCATTGACAGCTTTGTGCTGG-3’;b-actin引物序列為,上游5’-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3’,下游5’- GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT-3’。PCR反應條件為 94℃ 5 min,94℃ 30 s,45℃、72℃ 1 min,共35個循環,72℃ 10 min。不同引物最佳退火溫度略有不同,b-actin 55℃,IL-4 56 ℃,IFN-g54 ℃。IL-4、IFN-g和b-actin擴增產物分別為294 bp、405 bp和630 bp。經2%瓊脂糖凝膠電泳,利用MUVB-20凝膠分析系統(Ultralum)對擴增產物條帶進行掃描,以IL-4/b-actin、IFN-g/b-actin的吸光度(A值)作為IL-4 mRNA和IFN-gmRNA表達的相對含量。

1.6.2 Western-blot檢測p38MAPK的表達

取適量RIPA裂解液勻漿組織,測蛋白濃度后,各樣品取50mg總蛋白上樣電泳,根據蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳。取出凝膠根據Marker切下目的條帶,用蒸餾水沖洗,剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙,PVDF膜用甲醇浸泡數秒后和濾紙一同浸泡于電轉緩沖液中。轉膜條件為p38、p-p38 200 mA, 80 min。用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜,室溫搖床封閉2 h。

一抗,用1:1000稀釋封閉液稀釋相應的一抗,使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4℃孵育過夜。二抗,TBST充分洗滌PVDF膜5～6次,5 min/次。用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗,以1:50000稀釋,使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中,室溫搖床孵育2 h。顯色曝光,TBST充分洗滌PVDF膜5～6次,5 min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液,孵育數分鐘。待熒光帶明顯后,用濾紙吸去多余的底物液,覆上保鮮膜,X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。

1.7 統計學方法

采用SPSS19.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示,采用單因素方差分析進行各組間數據比較。以＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR檢測結果

表1 各組IL-4mRNA與IFN-gmRNA表達比較 (±s)

表1 各組IL-4mRNA與IFN-gmRNA表達比較 (±s)

組別nIL-4mRNA表達量IFN-gmRNA表達量 A組80.555±0.2461.684±0.415 B組8 1.603±0.2631) 0.685±0.3161) C組8 1.225±0.3281)2) 1.063±0.2331)2) D組8 0.920±0.2461)2) 1.219±0.3201)2)

注:與A組比較1)＜0.05,與B組比較2)＜0.05

與A組比較,B組、C組和D組大鼠的IL-4mRNA表達顯著上升(均＜0.05);與D組比較,B組和C組大鼠的IL-4mRNA表達顯著下降(均＜0.05);與C組比較,D組大鼠的IL-4mRNA表達下降,但兩組比較差異無統計學意義(＞0.05)。與A組比較,B組、C組和D組大鼠的IFN-gmRNA表達顯著下降(均＜0.05);與D組比較,B組和C組大鼠的IFN-gmRNA表達顯著上升(均＜0.05);與C組比較,D組大鼠的IFN-gmRNA表達上升,但兩組比較差異無統計學意義(＞0.05)。詳見表1、圖1和圖2。

圖1 各組IL-4電泳圖

圖2 各組IFN-g電泳圖

2.2 Western-blot檢測結果

與A組比較,B組、C組和D組大鼠磷酸化p38MAPK表達明顯增高(均＜0.05);與D組比較,B組和C組大鼠磷酸化p38MAPK表達顯著降低(均＜0.05);與B組比較,C組磷酸化p38MAPK的表達降低,但兩組比較差異無統計學意義(＞0.05)。詳見表2、圖3。

表2 各組磷酸化p38MAPK的表達情況比較 (±s)

表2 各組磷酸化p38MAPK的表達情況比較 (±s)

組別np-p38/p38MAPK A組80.120±0.027 B組80.612±0.1231) C組80.429±0.1041)2) D組80.292±0.0841)2)

注:與A組比較1)＜0.05,與B組比較2)＜0.05

圖3 各組p-p38MAPK電泳圖

3 討論

子宮內膜異位癥是臨床常見的良性婦科疾病,但具有浸潤、轉移及復發等惡性腫瘤特征[7],其發病機制尚不清楚。有研究[8]表明,在位內膜細胞出現黏附-侵襲-血管形成是EMs的基本病理變化。

p38MAPK是EMs發病機制中一條關鍵信號通路[9-12]。炎癥因子等因素可以激活p38MAPK信號通路,進而作用于核轉錄因子,調控基因表達,介導炎癥反應,參與異位子宮內膜的生成[8]。p38MAPK通路能誘導Th細胞發生Th1/Th2漂移,使得異位的子宮內膜細胞發生免疫逃逸現象,從而促進其種植與生長[13-16]。研究發現激活p38MAPK通路可促進GATA-3的磷酸化,進而可促使Th2細胞產生大量的IL-4等細胞因子[17]。有研究[4]發現,p38MAPK抑制劑可以阻斷其表達與活性,能顯著降低機體的炎癥反應。

目前大多學者認為EMs患者機體的免疫抑制狀態給異位的子宮內膜細胞侵襲與生長提供了有利的環境[3]。在EMs的免疫機制研究中已知T輔助細胞與子宮內膜的異位種植關系最為密切[18]。非特異性免疫不能清除脫落至盆腔后在位的內膜細胞。相反,它可以通過抗原遞呈細胞激活以T細胞介導的細胞免疫。T輔助淋巴細胞(helper T cell, Th)是免疫應答中的關鍵細胞,因抗原特性、激素等因素的不同,可向Th1或者Th分化。前者主要分泌IL-2、IFN-g、IL-12等,介導細胞免疫應答,增強殺傷細胞的細胞毒性作用;后者以分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子為主,介導體液免疫應答,促進B細胞增殖、成熟,促進抗體的產生[19]。Th1與Th2在正常機體中維持著動態平衡,當平衡狀態被打破,即“Th1/Th2漂移”,便會導致機體產生自身免疫性疾病、炎癥反應、腫瘤等[20]。研究表明,Th1和Th2在EMs婦女外周血和腹腔液中不平衡表達,其中Th1細胞群功能明顯下降,Th2細胞因子水平普遍升高,由Th1向Th2型漂移,機體處于免疫抑制狀態,這可能是EMs發生的始動原因[19]。IL-4是一種具有多種生物功能的細胞因子,其主要作用為促使原始的T細胞向Th2分化,其還可以抑制巨噬細胞功能,降低細胞毒性和抑制Th1型細胞的產生,高濃度的IL-4能阻止靜止的T細胞分化為Th1細胞。而IFN-g是Th1的主要因子之一,對許多細胞的生長有著較強的抑制作用,其可直接促進T和B淋巴細胞的活化,從而加強細胞免疫,或者間接誘導TNF和IL-2的分泌增加來提高機體的免疫水平[21]。

中醫學中雖無EMs此病名的記載出現,但有關“痛經”“癥瘕”“月經不調”“不孕”等病的描述卻能符合EMs的絕大部分癥狀[22]。溫通藥物對EMs的治療有著良好的效果[23]。隔藥餅灸屬于間接灸的一種,由附子、肉桂、丹參、紅花、木香等藥物配方制成藥餅,能將艾灸、藥物以及相應穴位的治療作用結合起來。關元為小腸募穴,系足三陰、陽明、任脈、沖脈之會,任沖二脈皆起于胞宮,任脈為“陰脈之海”,沖脈為“血海”,該穴又位于臍下3寸,鄰近胞宮,故亦為治療EMs之要穴。艾炷與皮膚隔之以藥餅,火力溫和,艾灸和藥物雙重作用同時對腧穴進行刺激,產生艾灸生物效應,影響組織細胞代謝。

本實驗結果顯示,D組大鼠的IL-4mRNA表達顯著上升,磷酸化p38MAPK表達明顯增高,但D組大鼠的IFN-gmRNA表達顯著下降,提示炎癥因子等因素激活p38MAPK信號通路,促進IL-4等細胞因子表達,介導炎癥反應,而Th細胞動態平衡被打破,Th細胞向Th2分化,IFN-g生成減少,大鼠機體處于免疫抑制狀態。經過治療之后,B組和C組大鼠的p38MAPK表達和IL-4mRNA表達均較D組顯著下降,IFN-gmRNA表達顯著上升,提示在關元穴上施隔藥餅灸和達那唑均可以抑制p38MAPK信號通路,減少IL-4生成,IFN-g生成上升,Th細胞向Th1分化,Th細胞動態平衡有恢復趨勢,但兩者之間無顯著性差異,提示隔藥餅灸治療和達那唑有相同效果。

綜上所述,隔藥餅灸能抑制p38MAPK信號通路,抑制IL-4的表達,促進IFN-g生成,誘導Th細胞向Th1分化,恢復Th細胞動態平衡。

[1] 田甜,季菲,何艷,等.子宮內膜異位癥患者術前生活質量和工作效率的調查分析[J].中醫婦產科臨床雜志,2014,15(3):233-236.

[2] 李梅生,譚布珍,張萍.子宮內膜異位癥現代治療[M].北京:人民軍醫出版社,2003:75-92.

[3] Wan YY, Flavell RA. How diverse-CD4 effector T cells and their functions[J]., 2009,1(1):20-36.

[4] 周衛東,陳瓊華,陳清西.p38 MAPK及其抑制劑在子宮內膜異位癥中的作用[J].藥學學報,2010,45(5):548-554.

[5] 張曦,王鑫,王紅靜,等.大鼠子宮內膜異位癥模型建立方法的探索[J].華西醫學,2007,22(4):831-833.

[6] 紀峰,林鶯,張木蘭,等.成年雌性大鼠“關元”穴定位初探[J].時珍國醫國藥,2014,25(3):669-670.

[7] 郎景和.重視疑難性子宮內膜異位癥的臨床與基礎研究[J].中國實用婦科與產科雜志,2009,25(9):641-642.

[8] 莊夢斐,楊英,曹陽,等.子宮內膜異位癥病理機制相關信號通路的研究進展[J].生殖與避孕,2016,36(3):214-223.

[9] 李艷,聞姬,陳軍,等.子宮內膜異位癥有關信號通路的研究進展[J].生殖與避孕,2016,36(2):128-134.

[10] Yan L, Cao X, Zeng S,.Associations of proteins relevant to MAPK signaling pathway (p38MAPK-1,HIF-1 and HO-1) with coronary lesion characteristics and prognosis of peri-menopausal women[J]., 2016,15(1):187.

[11] Deng L, Zhang L, Zhao H,.The role of p38MAPK activation in spinal dorsal horn in remifentanil-induced postoperative hyperalgesia in rats[J]., 2016,38(10):929-936.

[12] Zhu L, Yuan C, Huang L,.The activation of p38MAPK and JNK pathways in bovine herpesvirus 1 infected MDBK cells[J]., 2016,47(1):91.

[13] 馬耀梅,王英紅.絲裂原活化蛋白激酶信號通路與子宮內膜異位癥[J].國際生殖健康/計劃生育雜志,2010,29(2):112-115.

[14] Xu TJ, Liu Y, Li P,.Insulin in combination with selenium inhibits HG/Pal-induced cardiomyocyte apoptosis by Cbl-b regulating p38MAPK/CBP/Ku70 pathway[J].2016,20(15):3297-3303.

[15] Chakraborty S, Ghosh S, Banerjee B,.Mephebrindole, a synthetic indole analog coordinates the crosstalk between p38MAPK and eIF2α/ATF4/CHOP signalling pathways for induction of apoptosis in human breast carcinoma cells[J]., 2016,21(10):1106-

1124.

[16] Wu H, Cheng XW, Hu L,. Cathepsin S Activity Controls Injury-Related Vascular Repair in Mice via the TLR2-Mediated p38MAPK and PI3K-Akt/p-HDAC6 Signaling Pathway[J]., 2016,36(8):1549-1557.

[17] Maneechotesuwan K, Xin Y, Ito K,. Regulation of Th2 cytokine genes by p38MAPK-mediated phosphorylation of GATA-3[J]., 2007,178(4):2491-2498.

[18] Taylor JJ, Mohrs M, Pearce EJ. Regulatory T Cell Responses Develop in Parallel to Th Th Effector Population 1[J]., 2006,176 (10):5839-5847.

[19] 劉丹,劉培淑.子宮內膜異位癥相關性不孕的免疫異常[J].醫學綜述,2011,17(14):2124-2127.

[20] 劉丹彤,張小勇,馬小娜,等.本事琥珀散對子宮內膜異位癥大鼠 Th1/Th2漂移的影響[J].江西中醫學院學報,2012,24(1):64-67.

[21] 崔軼凡,李旭京,李培碩,等.Th1/Th2細胞在EMT患者外周血中的表達及其意義[J].中國婦幼保健,2010,25(15):2052-2053.

[22] 林素芬.子宮內膜異位癥近20年中醫臨床文獻研究[D].廣州:廣州中醫藥大學,2013.

[23] 劉亞欣,曹銀香,王榮英,等.溫通藥灸治療子宮內膜異位癥致痛經 76例療效觀察[J].新中醫,2003,35(5):55.

Intervention Effect of Herbal Cake Moxibustion on p38MAPK Signaling Pathway in Endometriosis Rats

1,1,-1,-2,-1.

1.,330004,; 2...,414017,

Objective To investigate the Intervention effect of herbal cake moxibustion on p38MAPK signaling pathways in endometriosis rats. Methods Thirty-four rats were randomized into group A (blank control) of 8 rats and a model group of 26 rats. A model of endometriosis was made in the model group. Two rats selected randomly from the model group were sacrificed to examine the result of model making. Rats with successful model making were randomized into group B (herbal cake moxibustion), group C (oral gavage of danazol solution) and group D, 8 rats each. Group A received herbal cake moxibustion on point Guanyuan; group B, an oral gavage of danazol solution; group C, no treatment. After 20 days, every group of rats was sacrificed and the experimental specimens were taken. The expressions of IFN-gand IL-4 in the specimen were determined by fluorescence quantitative PCR in every group. The expression of phosphorylated p38MAPK was determined by Western blot in every group. Results The expressions of IL-4 mRNA and phosphorylated p38MAPK increased significantly and IFN-gmRNA expression decreased significantly in groups B, C and D of rats compared with group A (all＜0.05). The expressions of IL-4 mRNA and phosphorylated p38MAPK decreased significantly and IFN-gmRNA expression increased significantly in groups B and C of rats compared with group D (all＜0.05). There were no significant differences in the expressions of phosphorylated p38MAPK, IL-4 mRNA and IFN-gmRNA between groups B and C (all＞0.05). Conclusions Herbal cake moxibustion can inhibit p38MAPK signaling pathways and IL-4 expression, promote IFN-gproduction, induce the differentiation of Th cells into Th1 cells and restore the dynamic balance of Th cells.

Acupuncture-moxibustion therapy; Endometriosis; Indirect moxibustion; Medicinal cake-partitioned moxibustion; p38MAPK signaling pathways; Th cell differentiation; Point, Guanyuan; Rats

1005-0957(2016)11-1348-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.11.1348

2016-04-01

江西省教育廳科技項目資助(GJJ11550)

覃肯(1988 - ),男,2013級碩士生

周志剛(1971 - ),男,副教授