‘魯星’桃中10個MADS-box基因克隆和表達分析

李慧峰，賈厚振，董慶龍，冉 昆，王宏偉

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‘魯星’桃中10個MADS-box基因克隆和表達分析

李慧峰1，賈厚振1，董慶龍2，冉 昆1，王宏偉1

（1山東省果樹研究所，山東泰安271000；2西北農林科技大學園藝學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100）

【目的】克隆‘魯星’桃（var.‘Luxing’）中參與調控營養(yǎng)和生殖生長的MADS-box（）基因，研究其在不同組織器官中的表達特性，為解析該基因在花發(fā)育和果實發(fā)育及成熟過程中的功能奠定基礎。【方法】利用同源比對和RT-PCR技術，克隆獲得‘魯星’桃中10個全長cDNA序列，并進行生物信息學相關分析；采用RT-PCR技術檢測在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣等組織以及花發(fā)育7個階段和果實發(fā)育5個階段的表達特性。【結果】測序結果顯示，獲得10個s（、、、、、、、、和；GenBank登錄號分別為KU559577、KU559578、KU559585、KU559586、KU559587、KU559588、KU559594、KU559595、KU559596和KU559597），其開放閱讀框（open reading frame，ORF）分別為522、279、1 065、828、723、600、636、534、750和480 bp。進化分析表明，屬于AP3亞組，是AGL17亞組，屬于MIKC*組，、和同被分為Mα組，、、和同屬于Mγ組。亞細胞定位預測結果顯示，10個PpMADS蛋白均定位于細胞核中。啟動子分析顯示，s啟動子區(qū)域含有多個順式作用元件，包括光響應元件、防御及逆境響應元件、干旱誘導的MYB結合位點、熱激響應元件、低溫響應元件、真菌效應子響應元件、傷害響應元件、厭氧響應元件、GA響應元件、Auxin響應元件、MeJA響應元件、ABA響應元件、SA響應元件和乙烯響應元件。半定量RT-PCR和qRT-PCR結果顯示，在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣、花發(fā)育和果實發(fā)育中表達；在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中表達；在萼片、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中（苗期除外）表達；Mα組和Mγ組所有成員在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中均有表達，部分成員在果實發(fā)育中表達。【結論】10個在‘魯星’桃的營養(yǎng)生長以及花和果實發(fā)育過程中可能具有重要的調控作用。

‘魯星’桃；MADS-box；轉錄因子；基因克隆；表達分析

0 引言

【研究意義】桃（L.）作為中國重要的落葉果樹樹種之一，栽培歷史悠久，因其果實營養(yǎng)豐富、風味鮮美，深受人們的喜愛。分子生物學和生物信息學技術的發(fā)展以及桃基因組草圖的公布，為研究和揭示桃生長和發(fā)育的分子機理奠定了基礎。研究‘魯星’桃（var.‘Luxing’）中，對探索其在花及果實發(fā)育過程中的作用具有重要參考意義。【前人研究進展】在植物中，MADS-box轉錄因子是一個大家族轉錄調控子，是植物界中研究最為廣泛的基因家族之一，在植物的花和果實發(fā)育及成熟等多個過程中具有重要的調控作用；其名稱源于4個物種的，即釀酒酵母的、擬南芥的、金魚草的及人類的首字母，在其N末端含有一段約為60個氨基酸組成的高度保守結構域，稱之為MADS-box結構域，負責識別和綁定靶基因中調控區(qū)域的CArG盒[CC(A/T)6GG][1-3]。根據結構域的不同，植物基因家族可分為2個亞家族：Type I和Type II。Type I可繼續(xù)分為Mα、Mβ、Mγ和Mδ組；Type II又稱為MIKC類型，因其含有4個保守結構域：MADS（M）盒、Intervening（I）區(qū)域、Keratin（K）盒和C-terminal（C）末端[4]。此外，根據上述保守域特征，MIKC類型可進一步分為MIKCC和MIKC*，二者之間的差別是MIKC*缺少I區(qū)域和K盒[5]。MIKCC依據進化關系又可進一步分為AP1、SVP、AP3、SOC1、AG、SEP、AGL12、AGL17和FLC等亞組，同時MIKCC也是植物中研究最為廣泛和深入的類型[3,6]。近年來隨著研究的不斷深入，花形成的分子調控機理已經從最初的ABC模型發(fā)展為ABCDE模型。根據ABCDE模型的闡述，A類（（））和E類（（、、和））基因調控萼片的形成；A類、B類（（）和）和E類基因調控花瓣的形成；B類、C類（（））和E類基因調控雄蕊的形成；C類和E類基因調控心皮的形成；D類（（））和E類基因調控胚珠的形成[4, 6-8]。此外，還參與調控果實的發(fā)育[9-10]、成熟和開裂[11-13]，調控光合作用和營養(yǎng)代謝[14]以及參與激素信號轉導等途徑[3,15]。【本研究切入點】根據前人研究結果[16-17]，已經鑒定得到79個桃。本研究以‘魯星’桃為試材，去除GenBank數據庫中已登錄的基因，克隆不同亞組的桃（）。【擬解決的關鍵問題】克隆，詳細分析的MADS-box保守結構域、進化關系、染色體分布、基因結構和保守元件，并研究其在不同組織以及花和果實發(fā)育過程中的表達情況，為桃的深入研究提供參考。

1 材料與方法

試驗于2014—2015年在山東省果樹生物技術育種重點實驗室和山東農業(yè)大學園藝學院作物生物學國家重點實驗室進行。

1.1 植物材料

供試材料為2014年山東省果樹研究所天平湖試驗示范基地（山東泰安）3年生‘魯星’桃（var.‘Luxing’，證書編號：魯農審2014047號，親本：Yukon King/曙光），一年生的枝條（莖）（4月5日）、新葉（4月5日）、7個不同發(fā)育階段的整花（花蕾期：1階段，4月2日取樣；露瓣期：2階段，4月2日取樣；初開期：3階段（小），4月2日取樣；初開期：4—5階段（中—大），4月9日取樣；盛花期：6階段，4月9日取樣；衰敗期：7階段，4月15日取樣）[18-19]、雄蕊（4月5日）、萼片（4月5日）、子房（4月5日）、花瓣（4月5日）和5個不同發(fā)育階段的果實（花后30、50、60、70和80 d）（以4月5日開始計算）。上述植物材料均從3棵及以上樹上采集發(fā)育階段和狀態(tài)較一致的樣品。于液氮中速凍，-80℃保存，以便提取RNA進行表達分析。

1.2 基因克隆與序列分析

采用改良熱硼酸法提取混和樣品（包括1.1中的混合組織材料：莖、葉、7階段整花和80 d果實）RNA，用反轉錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaRaKa公司）合成cDNA。根據前人研究結果[20-21]，鑒定得到79個，通過序列比對去除GenBank數據庫中存在的15條，選擇克隆分屬不同亞組的10個。設計特異性引物（表1）進行PCR擴增，PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃ 45 s，56—62℃ 45 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。回收PCR產物并連接到-T載體上，構建重組質粒轉化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

在桃基因組數據庫（https://www.rosaceae.org/gb/ gbrowse/prunus_persica/）中，通過序列比對查找的啟動子序列，由于桃基因組數據庫測序質量較好，可直接進行啟動序列分析。在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）進行啟動子序列分析；DNAMAN 6.0.3.99軟件分析基因的開放閱讀框（ORF）和編碼氨基酸序列；在線軟件WebLogo 3（http://weblogo. threeplusone. com/）分析PpMADS蛋白的MADS-box結構域；MEGA6.0軟件構建PpMADS和其他物種MADS-box的系統(tǒng)進化樹；LocTree3（https://rostlab. org/services/ loctree3/）和SoftBerry ProtComp 9.0（http://linux1. softberry.com/berry. phtml）進行亞細胞定位預測[22-23]。

1.3的表達分析

使用RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN公司）提取組織RNA，用反轉錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaRaKa公司）合成cDNA。采用作為半定量PCR（RT-PCR）內參基因[21]。RT-PCR擴增體系為25 μL：1 μL cDNA；2.5 μL 10×緩沖液；2.5 mmol dNTP 2 μL；上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL；DNA聚合酶（購自全式金公司）0.25 μL；剩余用ddH2O補齊。循環(huán)參數為：94℃5 min；94℃25 s；58℃25 s；72℃30 s；目的基因為36個循環(huán)，內參基因為28個循環(huán)。每一個基因的RT-PCR反應均重復3次。

表1 基因克隆引物序列

采用作為實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的內參基因[21]。參照谷彥冰等[21]的方法，采用三步法進行qRT-PCR分析。所用儀器為BIO-RAD IQ5（USA），所有qRT-PCR反應都設3次重復。PCR反應體系為：SYBR Green Master I 10 μL，上、下游引物（5 μmol·L-1）各1 μL，模板1 μL，加去離子水至20 μL。PCR反應程序為：95℃預變性3 min；95℃10 s，58℃ 30 s，72℃15 s，40個循環(huán)；最后退火至55℃，每隔7 s上升0.5℃，至95℃，共81個循環(huán)。試驗結果用2–ΔΔCT法對數據進行定量分析。引物設計均避開MADS-box保守域，所用引物具體序列詳見表2。

表2 RT-PCR和qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1克隆

經測序克隆得到分屬不同亞組的10個，基因命名、ORF、蛋白大小、分子量、等電點、所屬類型和GenBank登錄號詳見表3。對10個PpMADS蛋白氨基酸序列進行同源性比對分析，結果顯示均含有MADS-box結構域（圖1）。

2.2 PpMADS進化分析

利用MEGA6.0軟件對本研究克隆的10個PpMADS蛋白、GenBank數據庫中有記載的15個PpMADS蛋白[17]、擬南芥MADS-box蛋白（AGL）[22]和水稻MADS-box蛋白（OsMADS）[23]進行MADS-box結構域聚類分析（圖2）。結果表明，Type II MADS-box蛋白被分為MIKCC和MIKC*兩組，其中MIKCC可繼續(xù)分為9個亞組；Type I MADS-box蛋白被分為Mα、Mβ、Mγ和Mδ四組。PpMADS11屬于AP3亞組；PpMADS12屬于AGL17亞組；PpMADS19屬于MIKC*組；PpMADS20、PpMADS21和PpMADS22屬于Mα組；PpMADS28、PpMADS29、PpMADS30和 PpMADS31同屬于Mγ組（圖2）。

2.3 PpMADS亞細胞定位預測

通過在線預測軟件SoftBerry ProtComp 9.0對PpMADS蛋白進行亞細胞定位預測。結果顯示（表4），PpMADS11、PpMADS12、PpMADS19、PpMADS20、PpMADS21、PpMADS22、PpMADS28、PpMADS、PpMADS30和PpMADS31定位在細胞核的相應預測數值均為最高（共10分：數值越高表示可信度越大）。進一步利用在線預測軟件LOCTREE3對PpMADS蛋白進行亞細胞定位，結果顯示PpMADS蛋白均定位在細胞核。由此判斷，PpMADS蛋白可能定位于細胞核中。

表3 PpMADS基因信息

圖1 PpMADS蛋白氨基酸序列同源性比對和MADS-box結構域序列標簽分析

表4 PpMADS亞細胞定位預測

2.4啟動子序列分析

通過桃基因組數據庫（https://www.rosaceae.org/ gb/gbrowse/prunus_persica/）下載基因組定位信息，獲得10個的啟動子序列（1 500 bp）。對啟動子序列上順式作用元件進行分析，發(fā)現(xiàn)10個啟動子上含有多個光響應元件、防御及逆境響應元件、干旱誘導的MYB結合位點、熱激響應元件、低溫響應元件、真菌效應子響應元件、傷害響應元件、厭氧響應元件、GA響應元件、Auxin響應元件、MeJA響應元件、ABA響應元件、SA響應元件和乙烯響應元件。其中，啟動子含有2個真菌效應子響應元件和2個厭氧響應元件；啟動子含有7個厭氧響應元件和4個MeJA響應元件；啟動子含有2個熱激響應元件、2個SA響應元件和2個防御及逆境響應元件；啟動子含有4個厭氧響應元件；啟動子含有3個干旱誘導的MYB結合位點；啟動子含有4個干旱誘導的MYB結合位點；啟動子含有4個GA響應元件和4個防御及逆境響應元件；和啟動子分別含有5個厭氧響應元件；啟動子含有2個SA響應元件和2個GA響應元件（圖3）。

2.5的表達分析

利用半定量RT-PCR技術對10個進行不同組織、花發(fā)育和果實發(fā)育階段的表達分析。結果表明，、Mα組和Mγ組成員在莖、葉、萼片、子房、雄蕊和花瓣中均有表達；在莖、葉、萼片、子房、雄蕊和花瓣中均表達；而在萼片、雄蕊和花瓣中表達（圖4）。在花不同發(fā)育階段中，、Mα組和Mγ組成員持續(xù)高表達；在蕾期（1階段）、露瓣期（2階段）和初開期（3階段）表達量逐漸上升，在初開期（4—5階段）和盛開期（6階段）表達量逐漸下降，在衰敗期（7階段）表達更加微弱；的表達模式與相似，不同的是在蕾期（1階段）無表達（圖5）。在果實不同發(fā)育階段中，、、、、和均無表達；則持續(xù)在不同果實發(fā)育階段表達；、和在30 d和50 d過程中表達逐漸上調，60 d表達下調，而后表達持續(xù)上升（圖6）。為了驗證上述基因表達的準確性，選擇分屬不同亞組的5個在不同組織、花不同發(fā)育階段和果實不同發(fā)育階段進行qRT-PCR表達分析，結果與半定量RT-PCR結果一致（圖7）。

圖3 PpMADSs啟動子序列順式作用元件分析

圖4 PpMADS在桃不同組織中的半定量表達分析

1：花蕾期；2：露瓣期；3—5：初開期；6：盛開期；7：衰敗期。下同

圖6 PpMADS在果實不同發(fā)育階段中的半定量表達分析

3 討論

作為轉錄因子大家族，廣泛參與到植物多種生理和生殖過程的調控。2013年，Verde等[24]公布了桃基因組草圖，使得在基因組范圍內鑒定和分析桃MADS-box家族成為可能。2015年，WELLS等[16]鑒定了桃基因組中存在79個。

已有研究表明，受到非生物脅迫后，表現(xiàn)出不同的表達模式[23,25-27]。水稻多個在鹽、干旱、冷和ABA處理后出現(xiàn)不同響應[23,25]；二穗短柄草幼苗在面對鹽、干旱和冷脅迫處理后，的相對表達呈現(xiàn)不同程度地上調和下降[26]；大白菜幼苗在面對赤霉素、水楊酸、脫落酸、冷和熱脅迫處理后，多個的相對表達也呈現(xiàn)不同程度地上調和下降[27]。本文中，順式作用元件分析表明10個的啟動子含有多個與激素和逆境脅迫相關的作用元件，因此，暗示著這10個的轉錄可能受到激素和逆境脅迫的誘導。

研究表明，B類包括和在花瓣和雄蕊中起到特異性的調控作用[4,6-8]。擬南芥或者突變都會導致第二輪的花瓣轉換為萼片，而第三輪雄蕊轉換為心皮結構[28]。此外，在多個物種的突變體中也發(fā)現(xiàn)這種相似表型，例如，雙子葉植物金魚草、矮牽牛花、非洲菊、罌粟、歐洲耬斗菜、番茄、本氏煙以及單子葉植物玉米和水稻[29]。這些結果表明，和的調控功能非常保守。盡管在花瓣和雄蕊中起到特異性調控作用，但其在花組織中的表達卻是多種多樣的。例如，水稻同源基因在花瓣和雄蕊中有表達[30]；擬南芥在花瓣、雄蕊和子房中有表達[31]；玉米同源基因在萼片、花瓣、雄蕊和子房中均有表達[32]；非洲菊同源基因在萼片、花瓣、雄蕊和子房以及非花器官中均有表達[31]；蒺藜苜蓿同源基因只在非花器官葉中表達[33]；蘋果AP3亞組成員在非花器官莖、葉中有表達，花中無表達，而且在果實發(fā)育過程中持續(xù)表達[6]。本研究克隆得到的同源基因，在非花器官莖、葉和雄蕊以及花瓣中均表達，并且在花發(fā)育的過程中，表達模式是先升高后降低；在果實發(fā)育過程中，持續(xù)高表達。在擬南芥[22]、二穗短柄草[26]和黃瓜[34]中，AGL17亞組成員在根中特異表達；而在蘋果[6]、水稻[23]和葡萄[35]中，AGL17亞組成員還在其他組織中表達。本研究中，比較不同的是，在莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊和子房以及花發(fā)育的各個階段中均有表達，在果實發(fā)育過程中則沒有表達。前人研究表明，擬南芥包含6個MIKC*類型的，分別是：（）、、、、和。除了，其他成員均在花粉發(fā)育過程中特異表達，并且它們之間的功能高度冗余，其單突變體并沒有缺陷表型，而雙突變體則表現(xiàn)為：花粉發(fā)育能力下降，延遲萌發(fā)，花粉管生長畸形[36]。水稻包含3個MIKC*類型成員，分別是、和，而且與擬南芥MIKC*類型的具有相似功能，不同的是其單突變體就能表現(xiàn)為花粉成熟和萌發(fā)受到嚴重破壞[37]。在本文中，檢測到在萼片、雄蕊和花瓣中有表達，在花發(fā)育的過程中，表達模式是先升高后降低。以上結果表明，AP3亞組、AGL17亞組和MIKC*類型成員在各個物種中調控花發(fā)育的相關功能高度保守，但在各個物種的進化過程中又賦予其新的功能。

圖7 PpMADS在不同組織（A）、花不同發(fā)育階段（B）和果實不同發(fā)育階段（C）的實時熒光定量表達分析

相對于MIKC類型來說，Type I的相關研究較少。最近研究表明，擬南芥Type I成員在雌配子體的決定以及胚和胚乳的發(fā)育過程中具有重要作用[38-39]。本研究中，Mα組和Mγ組成員在莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊和子房以及花發(fā)育的各個階段中均有表達，在果實發(fā)育過程中則是先上升后下降再上升；相似的結果也出現(xiàn)在梅花Mα組和Mγ組成員中[40]；擬南芥[22]、水稻[23]、黃瓜[34]和大豆[41]Mα組和Mγ組成員在葉、花和果實也均有表達；而蘋果[6]、二穗短柄草[26]和大白菜[27]Mα組和Mγ組成員在多種組織中特異性表達。以上結果表明，不同物種Mα組和Mγ組成員在植物營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育過程中扮演相似或者獨特的功能。

此外，WELLS等[16]通過RNA-seq數據分析了桃（‘Lovell’）中根、成熟葉、幼葉和果實等組織的表達模式。對于同一基因在不同桃品種相同組織的表達模式，有些類似，有些則差別較大。例如，、、和的RNA-seq表達模式與本研究中RT-PCR的表達模式相似，而、、、、和的表達模式則不同。這可能是由于品種特性、組織取樣的時間和空間、栽培條件以及外界環(huán)境等多種因素造成的。因此，桃不同品種間的表達模式及其相關生物學功能有待進一步探究。

4 結論

克隆獲得了‘魯星’桃10個，均含有MADS-box結構域，分屬5個亞組，可能都定位于細胞核中，含有多個順式作用元件；在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣、花發(fā)育和果實發(fā)育中均表達；在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中表達；在萼片、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中（蕾期除外）表達；Mα組和Mγ組所有成員在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中均有表達，部分成員在果實發(fā)育中表達，暗示其在營養(yǎng)生長以及花和果實發(fā)育過程中可能具有重要的調控作用。

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（責任編輯 趙伶俐）

Cloning and Expression Analysis of TenGenes in Peach (var.‘Luxing’)

LI Hui-feng1, JIA Hou-zhen1, DONG Qing-long2, RAN Kun1, WANG Hong-wei1

(1Shandong Institute of Pomology, Tai’an 271000, Shandong;2College of Horticulture, Northwest A & F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi)

【Objective】The aim of this study is to characterize the novel peach (var.‘Luxing’)genes (s) involved in regulation of vegetative and reproductive growth. The transcriptional levels ofin different tissues were determined to provide a basis for studying the related function ofs in flower development, fruit development and ripening.【Method】The full-length cDNA sequences ofs form ‘Luxing’ peach were isolatedby homologous alignment and RT-PCR confirmation, the obtained cDNA sequences and the deduced amino acid sequences were analyzed with bioinformatics methods; the expression levels ofs were detected in stem, leaf, sepal, ovary, stamen, petal, 7 stages of flower development and 5 stages of fruit development using RT-PCR.【Result】The sequencing results showed that ten cDNAs (designated as,,,,,,,,and; GenBank accession No. KU559577, KU559578, KU559585, KU559586, KU559587, KU559588, KU559594, KU559595, KU559596 and KU559597) contained open reading frame (ORF) of 522, 279, 1 065, 828, 723, 600, 636, 534, 750 and 480 bp, respectively. The results of phylogenetic analysis revealed that,, andbelong to AP3, AGL17 and MIKC* subgroups, respectively; and,andbelong to Mα group;,,andbelong to Mγ group. The results of subcellular localization prediction showed that all PpMADS proteins were located in the nucleus. The results of promoter analysis indicated that there were multiple putative-acting elements involved in light responsiveness,defense and stress responsiveness, MYB binding site was involved in drought-inducibility, heat stress responsiveness,low-temperature responsiveness, fungal elicitor responsive element, wound-responsive element, anaerobic induction element, gibberellin-responsive element, auxin-responsive element, MeJA-responsiveness, abscisic acid responsiveness, salicylic acid responsiveness and ethylene-responsive element. Semi RT-PCR and qRT-PCR results showed thatwas expressed in stem, leaf, sepal, ovary, stamen, petal and during flower and fruit development.was expressed in stem, leaf, sepal, ovary, stamen, petal and during flower development.was expressed in sepal, stamen, petal and during flower development ( except bud stage). All members in Mα and Mγ groups were expressed in stem, leaf, sepal, ovary, stamen, petal and during flower development, some members were expressed during fruit development.【Conclusion】These results indicated that tengenes have crucial regulatory roles in ‘Luxing’ peach vegetative growth, flower and fruit development processes.

‘Luxing’ peach; MADS-box; transcription factor; gene cloning; expression analysis

2016-04-26；接受日期：2016-07-15

山東省良種工程項目（2014）

李慧峰，E-mail：fenglh79@163.com。通信作者冉昆，Tel：0538-8207123；E-mail：rkrl001@126.com