高脂飲食聯合鏈脲佐菌素對小鼠糖脂代謝及炎癥的影響

趙英政， 郭萍， 石超凡， 易憲文， 徐光翠

(新鄉醫學院公共衛生學院，河南新鄉453003)

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高脂飲食聯合鏈脲佐菌素對小鼠糖脂代謝及炎癥的影響

趙英政， 郭萍， 石超凡， 易憲文， 徐光翠*

(新鄉醫學院公共衛生學院，河南新鄉453003)

觀察高脂飲食聯合鏈脲佐菌素(STZ)對小鼠糖脂代謝及胰島功能損傷的影響。將體質量為18～20 g的SPF級雄性C57BL/6J小鼠40只，隨機分為對照組和模型組，每組20只。對照組小鼠飼喂對照飼料，模型組小鼠飼喂高脂飼料。1周后，禁食16 h，測量小鼠體質量與空腹血糖；尾靜脈采血，分離血清；每周1次，連續4周。4周后，對照組小鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液，模型組小鼠腹腔注射STZ，劑量為40 mg·kg-1，每天1次，連續3 d。繼續飼養2周后，測量隨機血糖，以小鼠血糖≥16.7 mmol·L-1者即判定為2型糖尿病。對照組及2型糖尿病小鼠經腹腔注射葡萄糖以進行糖耐量試驗。與對照組同一時間的體質量和血糖進行比較，模型組小鼠體質量、血糖均升高，除第1周血糖外，差別均有統計學意義(P<0.05)。采用重復測量方差分析，發現喂養時間對體質量(F=200.831)和血糖(F=7.025)均有影響，差異有統計學意義(P<0.05)；不同喂養時間對低密度脂蛋白(F=30.793)、甘油三酯(F=34.027)和高密度脂蛋白(F=30.793)均有影響，差異有統計學意義(P<0.05)。不同飼料喂養與不同喂養時間對體質量和甘油三酯存在交互作用(P<0.05)。比較糖耐量曲線發現，成模小鼠較對照組小鼠糖耐量降低。采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中TNF-α含量，成模小鼠的TNF-α含量高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。高脂飲食可導致C57BL/6J小鼠糖脂代謝紊亂，給予STZ后引起了小鼠糖耐量降低及炎癥損傷，高脂飲食聯合STZ可提高小鼠2型糖尿病模型的成模率。

高脂飲食；2型糖尿病；糖耐量曲線

隨著我國社會經濟水平的提高，人們的生活方式及飲食結構發生了極大的變化。高糖、高膽固醇飲食已成為動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病等慢性疾病的潛在致病因素(Flynnetal.，2006; Lobstein，2006)。據報道我國2型糖尿病發病率逐年增加，目前糖尿病患病率高達9.7%，前期糖尿病患病率約15.5%，患病人群以2型糖尿病為主，比例達90%以上(燕娟等，2009)。高脂飲食可誘發氧化應激和炎癥反應，而炎癥與2 型糖尿病發生密切相關。

迄今為止，已建立了多種高膽固醇或高脂誘導的胰島素抵抗的動物模型，但物種選擇、高脂配方、喂養時間等因素仍需進一步探索。C57BL/6J小鼠被認為是“標準”的近交系動物，為許多突變基因提供遺傳背景，同時對高脂誘導的肥胖敏感(van der Heijdenetal.，2015)。本研究通過給予C57BL/6J小鼠高脂飲食，監測高脂飲食過程中小鼠體質量、糖脂代謝指標和炎癥狀態，旨在明確高脂飲食及注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)對C57BL/6J小鼠糖脂代謝及系統炎癥的影響，為2型糖尿病的預防、疾病發生、發展過程中的影響因素及機制的探究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和器材 STZ(Sigma)；甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、總膽固醇(TCHO)等生化檢測試劑盒(北京，北化康泰)；TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒(武漢，博士德)；60%的高脂純化飼料及10%的對照純化飼料(江蘇，特洛菲)；電子血糖儀(美國，強生)；低溫離心機(德國，eppendorf)；酶標儀(美國，Thermo)。

1.1.2 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6J小鼠40只，體質量18～20 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證號:SCXK(京)2012-0001，使用許可證號:SYXK(豫)2014-0005]，于IVC動物房飼養，明暗周期12 h/12 h；相對濕度60%～70%。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 適應7 d后，將40只C57BL/6J小鼠隨機分為對照組和模型組，每組20只。對照組小鼠飼喂10%的對照純化飼料，模型組小鼠飼喂60%的高脂純化飼料。自由攝食、飲水，每天定時更換飼料，觀察小鼠狀態。1周后，禁食16 h，測量小鼠體質量；經尾靜脈采血后，分離血清并置于-20 ℃冰箱保存，每周1次，連續4周。4周后，對照組腹腔注射檸檬酸緩沖液，模型組腹腔注射STZ，劑量為40 mg·kg-1，每天1次，連續3 d。繼續飼養2周后，測量隨機血糖，以血糖值≥16.7 mmol·L-1者為2型糖尿病小鼠。對照組及模型組成模小鼠分別通過腹腔注射葡萄糖以進行糖耐量試驗，葡萄糖濃度為10%，注射容積為0.2 mL·10 g-1，分別測定和記錄30 min、60 min、90 min、120 min、240 min時的血糖值。最后，經股動脈采血后，處死小鼠，分離血清。

1.2.2 指標測定 采用電子血糖儀測血糖。嚴格按照試劑盒的說明書檢測血清中甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等含量；嚴格按照ELISA試劑盒方法檢測血清中的TNF-α、IL-1β。

2 結果

2.1 高脂飼料喂養對C57BL/6J小鼠體質量及血糖值的影響

與同一時間對照組比較，除第1周空腹血糖及第6周體質量外，模型組體質量、空腹血糖均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。對前4周數據采用重復測量方差分析，發現喂養時間對體質量(F=200.831)和空腹血糖(F=7.025)的影響有統計學意義(P<0.05)，即高脂飼料及喂養時間導致了小鼠體質量、空腹血糖的增加。不同喂養時間與不同飼料對體質量的影響存在交互作用(F=7.951,P<0.05)。未發現不同飼料喂養與不同喂養時間對空腹血糖存在交互作用(F=1.449)。在第6周STZ注射后模型組體質量降低，但與注射前的體質量差異無統計學意義(t=0.386)，空腹血糖升高(t=8.177，P<0.05)(表1)。

2.2 高脂飼料喂養對C57BL/6J小鼠血脂的影響

與同一時間對照組比較，除第1周低密度脂蛋白外，模型組血脂各項指標差異均無統計學意義。小鼠連續攝入高脂飼料4周，對前4周數據采用重復測量方差分析，發現喂養時間對低密度脂蛋白(F=30.793)、甘油三酯(F=34.027)和高密度脂蛋白(F=30.793)的影響均有統計學意義(P<0.05)，

時間體質量/g對照組模型組空腹血糖/(mmol·L-1)對照組模型組第1周20.39±1.1323.53±1.72*4.17±0.964.55±1.18第2周20.03±0.8924.34±2.18*3.90±0.526.76±3.75*第3周21.84±1.6925.49±2.44*4.16±1.245.67±2.15*第4周24.18±1.8929.80±3.08*5.06±0.967.81±2.06*第5周25.95±1.9030.46±3.51*4.75±1.0612.86±3.65*第6周28.23±3.5128.62±2.845.46±0.7214.90±4.10*

注:*與同一時間對照組比較，P<0.05; 喂養時間對體質量(F=200.831，P<0.05)和空腹血糖(F=7.025，P<0.05)的影響有統計學意義, 不同喂養時間與不同飼料對體質量的影響存在交互作用(F=7.951,P<0.05); 在第6周STZ注射后模型組空腹血糖值升高(t=8.177，P<0.05)。

Notes:*compared with the control group at the same time,P<0.05; Feeding time had an effect on body weights (F=200.831,P<0.05) and fasting blood glucose (F=7.025,P<0.05); There was an interaction between different feeding time and different diets on body weights (F=7.951,P<0.05); Fasting blood glucose increased after STZ injection at 6th week (t=8.177,P<0.05).

即高脂飼料及喂養時間導致了小鼠低密度脂蛋白、甘油三酯和和高密度脂蛋白的增加。不同飼料喂養與不同喂養時間對甘油三酯的影響存在交互作用(F=7.828，P<0.05)。未發現不同飼料喂養與不同喂養時間對低密度脂蛋白和高密度脂蛋白存在交互作用。未發現注射STZ前后血脂各項指標的差異具有統計學意義(表2)。

2.3 葡萄糖耐量試驗

注射STZ 2周后，對20只C57BL/6J小鼠進行隨機血糖的測定，以血糖值≥16.7 mmol·L-1者為2型糖尿病小鼠。有15只成模，成模率為75%。且隨著體質量的增加，糖尿病小鼠成模率提高(表3)。注射STZ 2周后，對照組與模型組小鼠分別經腹腔注射葡萄糖的240 min的糖耐量曲線比較見圖1。

2.4 2組動物血清中炎性因子水平的比較

在注射STZ 2周后模型組小鼠血清中TNF-α含量大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而IL-1β差異無統計學意義(圖2)。

表2 高脂飼料喂養對C57BL/6J小鼠血脂的影響

表3 模型組C57BL/6J小鼠不同體質量對2型糖尿病模型成模率的影響

圖1 2組小鼠糖耐量曲線比較

3 討論

以對胰島素敏感性和反應性降低為特征的胰島素抵抗是2型糖尿病發病的重要環節和基本特征。許多研究表明，高熱量飼料喂養和STZ注射是形成2型糖尿病模型的2個重要條件(杜娟等，2001；周敏，柴可夫，2001)。單純喂養高熱量飼料，僅能增加動物體質量及脂肪組織質量，但糖耐量正常；而一次大劑量注射STZ，則易導致動物死亡。本研究在對大鼠等動物造模的經驗基礎上，采用高脂飼料飼喂C57BL/6J小鼠誘導胰島素抵抗，然后分次小劑量注射STZ，造成胰島輕度損傷，胰島β細胞對糖反應性下降，從而出現空腹血糖升高及脂質代謝紊亂等一系列糖尿病的表現。

圖2 2組小鼠血清中炎性因子水平的比較

Fig. 2 Comparison of serum inflammatory factors levels in two mice groups

*與對照組比較,P<0.05。

*compared with the control group,P<0.05.

研究結果顯示攝入高脂飼料的小鼠體質量、空腹血糖均明顯大于對照組(P<0.05)，這是由于攝入的過多熱能而引起體質量升高、脂肪堆積，以及高脂飲食可誘發氧化應激和炎癥反應，從而產生胰島素抵抗，靶組織對胰島素的敏感性和(或)反應性降低(Dandonaetal.，2005;鄭素玲等，2010)。對于體質量和空腹血糖，不同喂養時間的差異有統計學意義，表明高脂飼料及喂養時間導致了小鼠體質量、空腹血糖的增加。不同喂養時間與不同飼料對體質量的影響存在交互作用。飲食與環境等因子通過調節機體的免疫狀態，引起促炎細胞因子水平升高，使機體處于慢性炎癥狀態，本研究結果也顯示模型組小鼠炎性因子TNF-α升高。

糖耐量試驗結果顯示，小鼠空腹一次性腹腔注射葡萄糖，小鼠的血糖在短時間內迅速升高，于30～60 min達到最高濃度，對照組180 min后降至空腹水平；而模型組小鼠由于胰島素抵抗及胰島功能受損，外周血糖不能及時降至正常水平，但在240 min后血糖水平仍然可以恢復至空腹水平，表明小鼠胰島細胞未完全受損，為2型糖尿病模型而非1型糖尿病模型。在第6周STZ注射后模型組體質量未見增加，而血糖升高，也表明了STZ注射后引發了小鼠糖尿病的癥狀和表現。并且隨著小鼠體質量的增加，2型糖尿病的成模率提高。

本研究通過高脂飲食誘導易發肥胖的C57BL/6J小鼠系統炎癥及胰島素抵抗，再分次注射小劑量STZ，成功復制了小鼠2型糖尿病模型，其過程模擬了人類2型糖尿病的發病過程(楊架林等，2003；趙維剛，朱惠娟，2010)。

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趙維剛, 朱惠娟. 2010. 肥胖致胰島素抵抗和高血糖的機制、治療及測評[J]. 中國醫學科學院學報, 32(1): 7-12.

鄭素玲, 陳超, 武煒, 等. 2010. 鏈脲佐菌素誘導小鼠Ⅱ型糖尿病模型的研究[J]. 動物醫學進展, 31(7): 60-63.

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Effect of High-fat Diet and Streptozotocin on the Glucose Lipid Metabolism and the Inflammatory in Mice

ZHAO Yingzheng, GUO Ping, SHI Chaofan, YI Xianwen, XU Guangcui*

(Department of Public Health, Xinxiang Medical University, Xinxiang, Henan Province 453003, China)

To investigate the effect of high-fat diet combined with streptozotocin (STZ) on the injury glycolipid metabolism and inflammatory in mice. A total of 40 male C57BL/6J mice (18-20 g) were randomly divided into control group and model group (20 per group). The control group was fed as normal, and the model group was fed with high-fat diet. After one week, mice were fasted for 16 h, and the weight and fasting blood glucose were measured, the blood sample was collected from the tail vein for four weeks, once a week. The control group was injected with citric acid buffer and the model group was daily injected with STZ (40 mg·kg-1) for three days. After feeding with high fat diet for two weeks, random blood glucose was measured. The mice were defined as type 2 diabetes mellitus model if the blood glucose was more than 16.7 mmol·L-1. The model mice of both groups were treated with glucose by intraperitoneal injection for glucose tolerance test. Comparing with the control group, significant difference was observed in the weight and blood glucose of the model group after one week (P<0.05). The effect of feeding time had significant effects on blood glucose (F=7.025) and weight (F=200.831) (P<0.05) as determined by repeated measures variance analysis. The feeding time also had significant effects on low density lipoprotein (F=30.793), triglyceride (F=34.027) and the high density lipoprotein (F=30.793) (P<0.05). The feeding time and high-fat diet had interaction on the body weight and triglycerides (P<0.05). The glucose tolerance of mice in model group decreased using the glucose tolerance curve. The serum TNF-α increased in model group (P< 0.05). High-fat diet combined with STZ can lead to the disorder of glucose and lipid metabolism, reduce the glucose tolerance and inflammation in C57BL/6J mice. High-fat diet combined with STZ can improve the incidence of type 2 diabetes in mice.

high-fat diet; type 2 diabetes; glucose tolerance curve

10.11984/j.issn.1000-7083.20150206

2015-06-10 接受日期：2015-10-29 基金項目：國家自然科學基金面上項目(81370916)； 新鄉醫學院培育基金項目(2014QN111)

趙英政(1979—), 男, 講師, 從事環境毒理學研究, E-mail:yingzhengzhao@126.com

*通信作者Corresponding author, 副教授, E-mail:xugc166@163.com

R994.6

A

1000-7083(2016)01-0109-04