藏羚羊基因組微衛(wèi)星分析與初步驗證

都玉蓉， 譚春敏， 徐永濤， 周智紅， 馬建濱, 2*， 郭松長

(1. 青海師范大學生命與地理科學學院，西寧810008； 2.青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，西寧810008； 3. 青海省三江源民族中學，西寧810001；4. 中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室，西寧810007)

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藏羚羊基因組微衛(wèi)星分析與初步驗證

都玉蓉1， 2， 譚春敏3， 徐永濤1， 周智紅1， 馬建濱1, 2*， 郭松長4*

(1. 青海師范大學生命與地理科學學院，西寧810008； 2.青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，西寧810008； 3. 青海省三江源民族中學，西寧810001；4. 中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室，西寧810007)

為明確藏羚羊Pantholopshodgsoni核DNA中微衛(wèi)星分布情況和特征，利用MISA工具對藏羚羊基因組進行微衛(wèi)星掃描。在全長2 696.89 Mb的藏羚羊基因組中，搜索到723 135個微衛(wèi)星座位，其中完全型微衛(wèi)星有675 809個。6種重復類型中，單核苷酸重復最多，有471 142個，占69.72%；其次是二核苷酸、三核苷酸，分別為88 832個和86 658個，占13.14%和12.82%；六核苷酸最少，僅215個，約占0.03%。以藏羚羊基因組DNA為模板對微衛(wèi)星座位進行驗證，在100個微衛(wèi)星座位中篩選到8個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星座位，多態(tài)比例約為8%。本研究將為研究藏羚羊微衛(wèi)星標記、群體遺傳多樣性、藏羚羊保護生物學提供基礎。

藏羚羊；基因組；微衛(wèi)星；多態(tài)性

微衛(wèi)星又稱為簡單重復序列(simple sequences repeats)，是以1～6個核苷酸為基本重復單位的串聯(lián)重復序列，其長度在100 bp以內(nèi)，它們廣泛存在于各類真核生物的基因組中，原核生物基因組中也含有少量的微衛(wèi)星(羅文永等，2003)。微衛(wèi)星因分布廣泛、變異度高和易于檢測等特征而被應用于分子生態(tài)、群體遺傳學等研究領域(張于光等，2003)。

目前，開發(fā)微衛(wèi)星標記的方法主要分為以下3類：(1)從公共數(shù)據(jù)庫或相關文獻中查找微衛(wèi)星座位；(2)近緣物種間引物交叉擴增；(3)從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星座位(程曉鳳等，2011)。近年來，隨著基因組測序技術的發(fā)展，越來越多的物種進行了大規(guī)模測序并對物種的基因組進行了微衛(wèi)星分布特征分析(馬秋月等，2013)，從而為在全基因組層面上分析基因組中微衛(wèi)星的分布、豐度等特性提供了可能。研究微衛(wèi)星在物種基因組中的豐度及其特征還有助于了解物種基因組的結構和進化(張學勇，李大勇，2000)。

藏羚羊Pantholopshodgsoni是國家Ⅰ級保護動物，對藏羚羊特異性標記資源以及遺傳多樣性的研究已有報道。賀培建(2004)、Ruan等(2005)、周惠等(2006)以及Du等(2010)利用mtDNA D-loop的遺傳變異對藏羚羊的遺傳多樣性、遺傳分化和種群動態(tài)等進行了分析。陳笑(2005)和Zhou等(2007)采用跨物種引物分別對藏羚羊的40個、25個微衛(wèi)星座位進行分析，篩選出10對和9對可穩(wěn)定擴增、多態(tài)性較高的引物。由于藏羚羊全基因組序列已測序完成(Geetal.，2013)，并于2013年在線公布，此數(shù)據(jù)庫成為開發(fā)微衛(wèi)星標記的有利資源，但藏羚羊特異性的標記資源及基因組序列信息還比較匱乏，藏羚羊基因組水平上微衛(wèi)星特征分析研究還未見報道。因此，本研究主要通過查找藏羚羊基因組開發(fā)出的微衛(wèi)星標記，對藏羚羊基因組所含不同類型的微衛(wèi)星特征和組成情況進行分析，并初步驗證微衛(wèi)星標記；為藏羚羊遺傳多樣性研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 藏羚羊微衛(wèi)星查找和引物設計

微衛(wèi)星檢出設置為：單核苷酸≥10次，二核苷酸≥8次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸≥5次。下載藏羚羊基因組數(shù)據(jù)，利用MISA工具(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)從藏羚羊全基因組數(shù)據(jù)庫中篩選微衛(wèi)星座位。微衛(wèi)星引物設計由Primer 3聯(lián)合Perl腳本完成。

1.2 藏羚羊基因組微衛(wèi)星的分布及出現(xiàn)頻率

根據(jù)Weber(1990)的劃分標準，不同核苷酸重復的微衛(wèi)星排列方式可以劃分為3種類型：完全型、不完全型和復合型。本研究僅對藏羚羊基因組中1～6堿基重復的完全型微衛(wèi)星進行統(tǒng)計分析。根據(jù)微衛(wèi)星重復的序列特征，統(tǒng)計分析不同核苷酸重復類型所占比例，找出不同類型微衛(wèi)星中的優(yōu)勢重復單元；并對1～6核苷酸重復類型中不同的微衛(wèi)星的長度變異情況進行分析。

1.3 藏羚羊基因組微衛(wèi)星標記初步驗證

1.3.1 基因組DNA的提取 藏羚羊基因組DNA采用苯酚-氯仿-異戊醇方法提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，4 ℃、-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微衛(wèi)星引物驗證 去掉單核苷酸重復類型和不能設計引物的微衛(wèi)星座位，得到46 286個微衛(wèi)星座位及其引物序列，隨機挑選并合成100對引物(可發(fā)郵件向作者索取)進行后續(xù)篩選與初步分析。

經(jīng)溫度梯度PCR篩選出有擴增產(chǎn)物的引物對后，混合4個藏羚羊的基因組DNA做模板進行PCR擴增，以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測產(chǎn)物是否具有多態(tài)。如該引物檢測到該座位具有多態(tài)，則以2013年采集于可可西里國家級自然保護區(qū)的24個藏羚羊個體的基因組DNA進行擴增和多態(tài)檢測。微衛(wèi)星多態(tài)檢測委托上海生工生物工程有限公司采用ABI 3730測序儀進行。

擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，X ℃(各引物對相應的退火溫度見表3)退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增體系為20 μL，含ddH2O 14.4 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，dNTPs 1.6 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 1.0 μL(50 ng·μL-1)，Taq酶1 U。

2 結果與分析

2.1 藏羚羊基因組微衛(wèi)星豐度分析

在全長約為2 696.89 Mb的藏羚羊基因組中共有723 135個微衛(wèi)星，平均每隔3 729個堿基就有1個。其中，完全型微衛(wèi)星675 809個，占93.46%。在675 809個完全型微衛(wèi)星中，單核苷酸471 142個，占69.72%；二核苷酸88 832個，占13.14%；三核苷酸86 658個，占12.82%；四核苷酸13 561個，占2.01%；五核苷酸15 401個，占2.28%；六核苷酸215個，占0.03%(圖1)。

圖1 微衛(wèi)星座位類型(核苷酸堿基數(shù)目)分布

2.2 藏羚羊基因組微衛(wèi)星中優(yōu)勢重復單元堿基的組成

根據(jù)堿基互補配對原則，每個微衛(wèi)星和其理論上對等的序列都合并為一類。因此，單核苷酸重復有2種重復單元；二核苷酸重復有4種重復單元；三核苷酸重復有10種重復單元；四核苷酸重復有33種重復單元；五核苷酸重復有102種重復單元；六核苷酸重復有350種重復單元。

單核苷酸中A/T是主要的重復單元，共450 879個(95.70%)，而G/C重復單元只有20 263個。

二核苷酸重復類型中，AC/GT重復單元最常見，共61 045個(68.72%)；其次是AT/TA重復單元，共21 935個(24.69%)；再次是AG/CT，共5 788個(6.52%)；GC/CG數(shù)量最少，僅出現(xiàn)64次。

三核苷酸重復以AGC/GTC和ACG/CTG為主，分別有31 379個(36.21%)和31 145個(35.94%)；其他重復單元類型及頻次分別為：AAC/GTT，8 974個(10.36%)；AAT/ATT，6 726個(7.76%)；ACC/GTG，3 278個(3.78%)；AGG/CTC，1 712個(1.98%)；AAG/CTT，1 132個(1.31%)；

ACT/ATG，991個(1.14%)；ATC/GTA，927個(1.07%)；CCG/CGG，394個(0.45%)。

四核苷酸中A/T豐富的重復單元(AAAT/ATTT，AATT/ATTA，AAAG/CTTT，AAAC/GTTT，AACT/ATTG，AAGT/ATTC，AATC/GTTA，AATG/CTTA，ACAT/GTAT，AGAT/ATCT)共有10 836個，占79.91%；其中AAAT/ATTT 30.94%，AAAC/GTTT 22.54%，AAAG/CTTT 7.26%，AACT/ATTG及AATC/GTTA最少，分別占0.48%和0.45%。而G/C豐富的重復單元(CCGG/CGGC，CCCG/CGGG，CCCT/AGGG，CCCA/TGGG，CCAG/CGGT，CCTG/CGGA，CCGA/TGGC，CCGT/AGGC，CACG/CGTG，CTCG/CGAG)共551個，占4.06%；其中CCCT/AGGG 1.69%，CACG/CGTG 0.87%，CCGG/CGGC沒有出現(xiàn)。

五核苷酸中A/T重復單元(AAAAN)n1 027個、(AAANN)n14 113個，占98.31%(N代表除A以外的任何堿基，下同)；而G/C重復單元所占比例少。

六核苷酸中A/T豐富的重復單元(AAAAAN)n71個、(AAAANN)n28個，也構成了很大一部分六核苷酸重復(46.05%)。

表1 不同堿基重復微衛(wèi)星在藏羚羊基因組中的分布

2.3 藏羚羊基因組微衛(wèi)星長度分布分析

對不同重復微衛(wèi)星類型中的重復長度進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)重復次數(shù)>20的微衛(wèi)星相對較少，在單核苷酸中只有8 596個，占1.82%；二核苷酸中4 315個，占4.86%；三核苷酸中215個，占0.25%；四核苷酸中41個，占0.30%；五核苷酸中87個，占0.56%；六核苷酸中3個，占1.40%(表2)。以微衛(wèi)星核心重復序列的長度為橫坐標，分布頻率為縱坐標作圖，可知每種重復微衛(wèi)星類型都隨著重復次數(shù)的遞增，頻率呈遞減趨勢，即：微衛(wèi)星長度越長，其豐度越低(圖2)。

2.4 藏羚羊基因組微衛(wèi)星標記初步驗證

100對引物中，有70對引物可獲得清晰的條帶，占引物總數(shù)的70%。混合4個藏羚羊的基因組DNA為模板并進行擴增，發(fā)現(xiàn)8個微衛(wèi)星座位具有多態(tài)。各座位對應的引物如表3所示。

2.5 微衛(wèi)星座位多態(tài)檢測

24個藏羚羊樣本在座位P6、P63、P67、P73、P75、P78、P90、P96上的等位基因數(shù)(NA)分別為7、11、9、9、14、14、12和9個。除座位P73和P67觀測雜合度(Ho)較低外，其余6個微衛(wèi)星座位的Ho均大于0.7，具有較高的雜合度；而各座位的期望雜合度(He)均較高；且多態(tài)信息含量(PIC)也均大于0.5(表4)。以上表明所篩選的8個微衛(wèi)星座位具有較高的遺傳變異。

3 討論

分析結果顯示藏羚羊基因組中的優(yōu)勢重復序列類型是單核苷酸重復序列，其次是二核苷酸和三核苷酸重復序列，之后是五核苷酸、四核苷酸重復序列，六核苷酸重復序列最少，這與牛Bostaurus、山羊Caprahircu、綿羊Ovisaries(王月月等，2015)和牦牛Bosmutus、水牛Bubalusbubalis(戚文華等，2015)各重復類型微衛(wèi)星在分布數(shù)的順序上完全一致，與豬Susscrofa、犬Canislupusfamiliaris和馬Equuscaballus(王月月等，2015)以及大熊貓Ailuropodamelanoleuca、北極熊Ursusmaritimus(李午佼等，2014)的微衛(wèi)星分布順序略有不同。采用MISA工具并采用相同微衛(wèi)星檢出設置，對上述10個物種的基因組微衛(wèi)星驗證分析得到了類似的結果，即藏羚羊1～6堿基重復微衛(wèi)星分布順序與牛、牦牛、水牛、山羊、綿羊等牛科物種完全一致，且其分布頻率也與這5個物種更接近；而藏羚羊1～6堿基重復微衛(wèi)星的分布順序和頻率與其他5個物種均存在較大差異(表5)。在分類上，藏羚羊與牛、牦牛、水牛、山羊和綿羊均屬于牛科。因此，上述結果表明物種間微衛(wèi)星分布存在一定的保守性，親緣關系越近，其分布規(guī)律越相似。

表4 藏羚羊種群多態(tài)信息

表5 11個物種微衛(wèi)星類型分布與頻率

注： 括號內(nèi)數(shù)字為該型微衛(wèi)星占物種微衛(wèi)星總數(shù)的百分比。

Note： The number in the bracket is the percentage of the repeat unit in all repeat types.

在單核苷酸重復類型中A/T(450 879)占多數(shù)，而C/G(20 263)的分布相對較少。在目前已知全基因組的物種中，如人Homosapiens、果蠅Drosophilamelanogaster、秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans、酵母Saccharomycescerevisiae和擬南芥Arabidopsisthaliana的基因組單堿基微衛(wèi)星中也發(fā)現(xiàn)了相同的現(xiàn)象(Tóthetal.，2000)。

在二核苷酸重復類型中，比例較高的是AC/GT(68.72%)，其次是AT/TA(24.69%)、AG/CT(6.52%)，GC/CG最少。人和果蠅中，二堿基的重復由高到低依次是AC、AT和AG，擬南芥中最多的是AT，其次是AG，而在酵母中AT占有絕對優(yōu)勢(Tóthetal.，2000)。對于CG 含量稀少的現(xiàn)象，Schorderet和Gartlar(1992)進行了解釋：根本原因是由于基因組DNA中的CpG的甲基化，使得胞嘧啶C很容易經(jīng)過脫氨基作用轉變成胸腺嘧啶T。同時基因組DNA 中CpG的甲基化會成為突變的熱點，而且少量的GC又是維持DNA 熱力學穩(wěn)定性所必需的，這可能是導致GC含量偏少的原因。

在三核苷酸重復類型中，微衛(wèi)星重復的10種類型可全部被發(fā)現(xiàn)。AGC/GTC數(shù)量最多(31 379)，其次是ACG/CTG(31 145)，AAC/GTT(8 974)，AAT/ATT(6 726)，CCG/CGG最少(394)。而河豚Takifugurubripes基因組微衛(wèi)星中以AAT最多，其次是AGG和ATC，GCC最少(崔建洲等，2006)；人類基因組微衛(wèi)星的重復拷貝類別中AAT和AAC最多，接下來是AAG和AGG，ACG最少(Subramanianetal.，2003)；果蠅中AGC最多，擬南芥和秀麗隱桿線蟲含有較多的AAG重復，而酵母中含有更多的AAT、AAG、ATG 和AGC 重復(Kattietal.，2001)。

研究結果顯示，不同重復類型核苷酸中，隨著微衛(wèi)星核心單元重復次數(shù)增加，其出現(xiàn)頻率呈遞減的趨勢，且核心單元重復次數(shù)>20的微衛(wèi)星僅占1.96%，與牦牛、水牛基因組微衛(wèi)星各核心重復單元的拷貝數(shù)分布區(qū)間高度一致(戚文華等，2015)。

本研究從46 286個藏羚羊微衛(wèi)星中隨機挑選出100對引物進行合成并進行溫度梯度擴增，電泳結果顯示約70%的引物可以得到有效擴增。進一步對上述可穩(wěn)定擴增的微衛(wèi)星座位進行篩選、測序，發(fā)現(xiàn)有8個微衛(wèi)星座位具有多態(tài)，占總座位數(shù)的8%。據(jù)報道，通過構建微衛(wèi)星文庫，研究人員在中國鱟Tachypleustridentatus、鹵蟲Artemia中分別獲得了7.5%(寧曄鳳等，2015)和9.52%(劉海珍等，2016)的多態(tài)引物，這表明通過基因組數(shù)據(jù)與通過微衛(wèi)星文庫構建法篩選多態(tài)引物具有類似的效率。因此，隨著測序技術的發(fā)展，利用日益豐富的物種基因組數(shù)據(jù)開發(fā)目標物種的多態(tài)微衛(wèi)星座位具有簡便、高效、可靠的特點。

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Genome-wide Characterization and Identification of Microsatellites inPantholopshodgsoni

DUYurong1, 2，TANChunmin3，XUYongtao1，ZHOUZhihong1，MAJianbin1, 2*，GUOSongchang4*

(1. School of Life and Geography Science， Qinghai Normal University， Xining 810008， China; 2. Key Laboratory of Medicinal Plant and Animal Resources in Qinghai-Tibetan Plateau, Qinghai Province, Xining 810008, China; 3. Sanjiangyuan Nationalities High School of Qinghai Province， Xining 810001， China; 4. Key Laboratory of Evolution and Adaptation of Plateau Biota， Northwest Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences， Xining 810007， China)

To investigate the distribution and feature of simple sequence repeats or microsatellites (1～6 bp repeats)， we screened the entire genome of Tibetan antelope (Pantholopshodgsoni)(2 696.89 Mb) by using MISA. A total of 723 135 microsatellite loci including 675 809 perfect microsatellites were detected and characterized within the whole genome. Among these microsatellites， the most abundant repeat type was mononucleotide (69.72%)， followed by di- (13.14%)， tri- (12.82%)， penta- (2.28%)， tetra- (2.01%)， hexa- (0.03%) nucleotide repeat types， and the motifs AC/GT (9.09%) and ACG/CTG (4.64%) appeared in high frequency. An approximate evaluation was conducted by randomly amplifying 100 microsatellite loci， and 8 loci (8%) were proved to be polymorphic. This study provide abundant microsatellite markers for analysis of genetic variation， construction of genetic map， as well as the conservation biology investigation inP.hodgsoni.

Pantholopshodgsoni; genome; microsatellite; polymorphism

2016-08-03 接受日期：2016-10-08

青海省應用基礎研究計劃項目(2013-Z-751; 2013-Z-750)

都玉蓉(1968—)， 女， 教授， 研究方向：動物分子生態(tài)學, E-mail：xndyr@163.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：mjb_117@163.com; guo@nwipb.cas.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160213

Q959.8

A

1000-7083(2016)06-0845-07