瑪咖不同提取物對人體精子功能的影響

謝逸欣,陳文秋,曾 婷,李曉鳳,吳 暉

(1.廣州軍區疾病預防控制中心,廣東廣州 510507;2.中山醫科大學附屬第六醫院,廣東廣州 510655;3.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

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瑪咖不同提取物對人體精子功能的影響

謝逸欣,陳文秋,曾 婷,李曉鳳,吳 暉

(1.廣州軍區疾病預防控制中心,廣東廣州 510507;2.中山醫科大學附屬第六醫院,廣東廣州 510655;3.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

目的:研究不同提取工藝得到的不同瑪咖提取物對精子功能的影響。方法:選取20名不孕男性精液,通過非連續密度梯度法制備精子懸液,將堿溶酸沉法、大孔吸附樹脂吸附-解析法與水提法提取的瑪咖中不同成分作用于精子懸液,通過計算機輔助精子分析系統(CASA)分析其對精子功能的影響。結果:代表精子活力參數的PR(前向運動精子)、PR-A(快速直線運動精子)和PR-B(中等前向運動精子),在瑪咖水提物濃度為0.1 g/mL時,精子活力最佳,比對照組高33.3%(p<0.05);代表精子運動功能的參數在瑪咖水提物濃度為0.1 g/mL時運動功能最佳,其中STR(直線速度與平均路徑速度比值)、LIN(直線速度與曲線速度比值)、WOB(平均路徑速度與曲線速度比值)比對照組高15%(p<0.05)。結論:瑪咖水提物在適宜的濃度下對精子的刺激作用使其活力達到高峰,能最大限度保持精子的高活動性及保證精子質量。

瑪咖提取物,人體精子,瑪咖蛋白,瑪咖生物堿

新資源食品瑪咖(LepidiummeyeniiWalpers)是原產于秘魯海拔3500 m以上安第斯山區的草本植物,通常以黑色、紫色和黃色等進行區分且活性成分含量差異較大。目前在我國云南和新疆等地均有廣泛種植,具有較高食用和藥用價值[1]。瑪咖含有豐富的營養成分,近年來許多國家都開展了對瑪咖多項保健功效的深入研究[2]。如臨床研究已經證實瑪咖可以減輕性功能障礙癥狀(系SSRI引起的副作用),同時確定了劑量相關效應[3];在動物實驗中,已經證實在持續15 d服用瑪咖粉末之后,可有效提高雄性動物的生殖能力[4];瑪咖能有效清除人體中的自由基(比如ROS/RNS),在提高生殖功能方面也起到重要的作用,通過去除精子膜上由自由基形成的過氧化物,從而保護精子頂體膜且維持頂體反應[5]。

南美當地人把瑪咖當作食物和滋補佳品,傳統上可用于增強精力,提高生育力,改善性功能[6-7]。曹東[8]等研究麗江瑪咖不同提取物(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位)對小鼠性行為的影響,正丁醇、水提取物具有提高雄性小鼠性行為的作用,且與性激素調節無關,作用機制有待進一步研究。瑪咖水提物能改善有機磷殺蟲劑馬拉硫磷對小鼠造成的生精損害[9],黑瑪咖干粉可提高精子數量,減少有絲分裂,減數分裂和排精周期[10]。黑瑪咖水醇提取物的乙酸乙酯部分對精子的發生效果最好[11]。用瑪咖根醇提物喂養小鼠后發現雌雄小鼠的性功能有了明顯提高,雄鼠勃起能力提高[12]。

目前瑪咖功效物質的研究很大程度上仍停留在動物實驗表面結果方面,對于是何種有效成分在起作用及具體的作用機制還有待于進一步研究。瑪咖這些已被明確的功效,可能與當中所含的次生代謝產物有關(生物堿、芥子油苷等),也可能與其它營養成分有關。本實驗通過將不同方法提取的黑瑪咖提取物(瑪咖蛋白酶解物、瑪咖生物堿、瑪咖水提物)首次作用于男性精液,通過計算機輔助精子分析系統(CASA)分析,對比各種提取物對精子功能的影響,從而為瑪咖提取物能否提高精子質量、揭示作用機理提供前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

精液 選取20對不孕夫婦,其中20名男性(年齡25～35歲)禁欲7 d后手淫法取得精液標本,37 ℃水浴30 min,待其完全液化后,待用,入組標準為:根據《人類精液檢驗與處理實驗室手冊》(第5版),經過標準常規檢驗精液無異常;平素體健,無家族遺傳病史及性功能障礙史,外生殖器及輸精管無明顯異常,無其他全身各系統疾病,染色體檢查為正常核型;黑瑪咖干果 云南省瑪咖種植培育基地,37 ℃烘干至恒重,粉碎后過40目篩,待用;G-IVFTMPLUS 10136精子獲能液 廣州尊博醫療器械有限公司;40%上層分離液與80%上層分離液(由硅烷包被的二氧化硅、N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸、氯化鈣、乳酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀、丙酮酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸鎂、葡萄糖和人體白蛋白等組成)、受精培養液 美國PAI公司;氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇 西隴化工有限公司;胃蛋白酶Pepsin(7.0×105U/g)、堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4 L(1.5×105U/g)Novo酶制劑公司;HZ-806、HZ-835、AB-8大孔吸附樹脂 上海華震科技有限公司;烏頭堿 中國食品藥品檢定研究院;超純水 美國密理博公司。

DC-500A打粉機 浙江武義鼎藏日用金屬制品廠;GZX-9140 MBE電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;電子分析天平 美國梅特勒-托利多公司;E-52旋轉蒸發器 上海亞榮系列化儀器廠;DLSB-5L/25低溫冷卻液循環泵、SHZ-D(III)循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司;JW-1016冷凍離心機 安徽嘉文儀器有限公司;IVOS全自動精子分析儀 美國Hamilton Thorne Biosciences公司;TD3(800B)低速自動平衡離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;SUB Aqua水浴箱 上海法潤科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 瑪咖蛋白酶解物制備 參考對瑪咖蛋白提取工藝的相關文獻[13],準確稱量20 g瑪咖干粉,超純水溶解后用1 mol/L NaOH溶液調節pH為9.5,攪拌離心(15000 r/min,10 min)后取上清液,用1 mol/L HCl溶液調節pH為2.5,離心(15000 r/min,10 min)后棄上清液,超純水溶解沉淀,得瑪咖蛋白粗提物。用1 mol/L HCl將溶液調至pH為2,按蛋白含量的2%加入胃蛋白酶,37 ℃水浴,振蕩3 h,用1 mol/L NaOH調至pH為7,95 ℃水浴10 min,滅酶活。用1 mol/L NaOH調至pH為8,加入與胃蛋白酶等量的胰蛋白酶,37 ℃水浴,振蕩4 h。用1 mol/L HCl將溶液調至pH為7,95 ℃水浴10 min,滅酶活。樣液離心(10000 r/min,10 min),取上清。

1.2.2 瑪咖生物堿提取 參考對瑪咖生物堿提取工藝的相關文獻[14],將瑪咖干果粉加入60%乙醇溶液1000 mL,浸泡24 h,25 ℃下震蕩6 h,濃縮回收至10 mL,超純水定容至100 mL,即得瑪咖藥材質量濃度為1 g/mL的生物堿提取物溶液,取部分加入超純水稀釋至0.1 g/mL溶液,待用。

1.2.3 瑪咖水提物制備 參考C Clémenta[15]的方法,將瑪咖干果粉以料液比1∶3,加入超純水慢火煮30 min,取濾液,再按料液比1∶3加入超純水,重復以上做法三次,合并濾液。濾液慢火煮,濃縮至十分之一,加5倍無水乙醇,醇沉24 h,離心(3000 r/min,10 min),取上清液,上旋轉蒸發器(70 ℃)濃縮至浸膏,置恒溫干燥箱4 h,溫度40 ℃,取出后加生理鹽水稀釋至濃度分別為0.02、0.1、0.5、1.0 g/mL,待用。

1.2.4 精子懸液的制備 采用非連續密度梯度法,在試管內放入1 mL 80%的密度梯度液,然后再把1 mL 40%的密度梯度液放在上層。小心吸取1 mL液化的精液覆蓋在上層分離液的液面,離心(286 r/min,30 min),棄去上層廢液,重懸精子懸液于5 mL受精培養液中,離心(286 r/min,5 min),棄上清液。加入1.2.1、1.2.2、1.2.3中得到的不同濃度瑪咖提取液各1 mL,37 ℃,水浴30 min。

采用計算機輔助精子分析系統(CASA)分析,觀察指標:前向運動精子(PR),前向運動精子中的快速直線運動精子(PR-A),前向運動精子中的中等前向運動精子(PR-B),非前向運動精子(NP),不動精子(IM),直線速度(VSL),曲線速度(VCL),精子頭部橢圓度,前向性STR(VSL/VAP),直線性LIN(VSL/VCL),擺動性WOB(VAP/VCL),平均路徑速度(VAP)。

1.3 統計學分析

運用SPSS 22.0,對以上各個參數進行數據處理,按照p為0.05,n為20,與對照組對比結果。

2 結果與分析

2.1 不同提取物對精子功能的影響

表1 不同提取物對精子功能的影響

注:*代表與空白對照組比較差異顯著(p<0.05);表2～表4同。

表2 不同濃度瑪咖水提物對精子活力的影響(±s,n=20)

不同提取物作用于精子,觀察相應指標的結果差異,其中PR、PR-A、PR-B可直接反映精子運動能力,IM、NP、STR與LIN可間接反映精子的活力強弱,WOB、VSL、VCL與VAP在反映精子運動功能上具有間接作用,結果見表1。蛋白酶解物、生物堿以及水提物(1 g/mL)中,多項指標(PR、PR-A、PR-B、VSL、VCL、WOB、VAP)結果明顯低于空白對照組,而水提物(0.1 g/mL)處理組中同樣的指標,其結果則顯著高于空白對照組(p<0.05),表示該水提物(0.1 g/mL)在提高精子活力和精子質量有明顯作用。接下來將各種濃度的瑪咖水提物作用于男性精液,對比不同濃度水提物對人體精子功能的影響。

2.2 不同濃度瑪咖水提物對PR、PR-A、PR-B的影響

PR、PR-A、PR-B可直接反映精子運動能力,如表2所示,代表精子活力參數的PR(包括PR-A和PR-B),實驗組中的多個濃度與對照組相比均有明顯差異,并且在瑪咖水提物濃度為0.1 g/mL時各指標達到最大值,其中PR比空白對照組高36.7%(p<0.05),表示該濃度下精子的前向運動能力和快速直線運動能力均最強。當瑪咖水提物濃度增加時,相關參數的測定值明顯下降,精子活力明顯減弱。尤其代表前向運動能力精子總數以及前向運動中直線快速運動精子數量的PR與PR-A。水提物中有效成分的起效濃度為0.1 g/mL,低于0.1 g/mL并不能有效影響精子運動能力,濃度過高時(>0.1 g/mL)則對精子運動能力產生抑制作用,甚至使精子出現死亡。

2.3 不同濃度瑪咖水提物對IM、NP、前向性STR、直線性LIN的影響

IM、NP、STR與LIN可間接反映精子的活力強弱,IM表示不動精子的數量,數值越低,表示精子活力越強,精子質量越好;NP為非前向運動精子的數量,數值越高,間接反映精子運動能力增強;STR為VSL與VAP的比值,用于表明精子平均移動軌跡的曲折程度;LIN為VSL與VCL的比值,用于表明精子實際所走路線的曲折程度。STR、LIN反映精子運動的直線性與前向性,數值越高,表示精子運動的直線軌跡與前向軌跡越準確。不同濃度瑪咖提取物對以上四個參數的影響結果如表3。IM在瑪咖濃度為0.1 g/mL時,其數值顯著低于空白對照,均為最低,此時不動精子數量最少;在低于或高于0.1 g/mL時,不動精子的數量均明顯增多。NP在1 g/mL時數值最低的原因可能是由于該樣本中的不動精子數量最多,因此剩余部分運動中的精子,尤其是非前向運動精子相對數值則減少。STR、LIN屬于精子運動功能參數,水提物濃度0.1 g/mL時與空白對照組相比有明顯差異性(p<0.05),且達到峰值。當瑪咖水提物濃度高于0.1 g/mL,隨著濃度的增加,快速向前運動的精子數目減少、精子運動能力有下降趨勢,充分反映不同存活率精液中精子微細運動特性存在顯著性差異。由此表明,當瑪咖水提物濃度為0.1 g/mL時,其對人精子的活力功能與運動功能均能產生積極影響。

表3 不同濃度瑪咖水提物對精子運動功能的影響(±s,n=20)

表4 不同濃度瑪咖提取物對精子運動功能的影響(±s,n=20)

2.4 不同濃度瑪咖水提物對WOB、VSL、VCL、VAP的影響

WOB、VSL、VCL與VAP在反映精子運動功能上具有間接作用。WOB為VAP與VCL的比值,用于表明精子實際運動軌跡相對其空間平均路徑擺動的程度,反映精子本身的擺動性;VSL是指精子在受檢時間范圍內所走直線距離對時間的平均值;VCL精子沿其實際運動曲線,即在顯微鏡中見到的二維方式曲線,所走的路程對時間的平均值;VAP精子沿其空間平均移動軌跡運動時,所走路程對時間的平均值。VSL、VCL及VAP均反映精子的運動功能測定值越高,表示精子運動速度越快。不同濃度瑪咖提取物對WOB、VSL、VCL、VAP的影響結果見表4。當瑪咖水提物濃度為0.1 g/mL時,VSL、VCL、VAP的數值均達到最高水平,并且顯著高于對照組水平(p<0.05);當瑪咖水提物濃度超過0.1 g/mL時,大多數精子活力指標呈現衰退性變化,死亡精子數量也逐漸增加,相似的報道在王慕華的論文報道中也有體現[16]。推測原因在于,精子活力的能量來源為其線粒體內產生的ATP,當細胞內腺苷酸環化酶系統中的磷酸二酯酶活性被抑制,細胞內cAMP濃度則會增加,cAMP在精子代謝過程中促進產生的ATP也會隨之增加[17]。隨著瑪咖水提物濃度逐漸增加,精子細胞內cAMP濃度則會減少,cAMP在精子代謝過程中促進產生的ATP也會隨之減少,最終導致精子運動功能的減弱,甚至消失。

3 結論與討論

本章采用三種不同方法對瑪咖干果進行提取,提取物分別是:模擬瑪咖蛋白進入人體消化系統后經過胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解的得物,瑪咖的次生代謝產物——生物堿,以及瑪咖水提物(水溶性成分混合物),分別直接作用在人精子上,所采用的計算機輔助精子分析系統(CASA系統)進行測定,檢驗參數更加詳細[18-19],更直觀的得出瑪咖與其功效的直接對應關系,對比三種提取物對人體精子功能的影響,進一步揭示瑪咖提高生殖能力的活性成分的種類與性質,為下一步純化活性成分、探析化學結構及探明瑪咖提高男性生殖力的機理做好前期實驗基礎。

在通過對代表精子活力的參數(PR、PR-A、PR-B)和代表精子運動功能的參數(IM、VSL、VCL、VAP、STR、LIN、WOB)測定中,當瑪咖水提物濃度為0.1 g/mL時,三個代表精子活力的指標(PR、PR-A、PR-B),均達到最高值,表現出了顯著差異性(p<0.05)。其中代表前向運動能力精子總數以及前向運動中直線快速運動精子數量的PR與PR-A的提高,直接表示男性生殖力的提高。代表精子運動功能的參數中(IM、VSL、VCL、VAP、STR、LIN、WOB),同樣在瑪咖水提物濃度為0.1 g/mL時,表現出最強的運動性,當濃度持續增加時,精子運動功能出現減弱,甚至完全消失。在三種不同提取方法中所得產物中,蛋白酶解物與生物堿都是經過提取純化,產物中所含成分少,較單一,而水提物在提取過程中,去除大量多糖和脂溶性成分,其余的水溶性物質均溶解在水提物中,成分組成較為復雜,推測瑪咖提高生殖能力的原因,在于多種水溶性成分的共同作用,而非單一組分能發揮功效。同時,樣品濃度并非越高越好,只有在適宜的樣品濃度下對精子的刺激作用使其活力達到高峰,才能最大限度保持精子的高活動性及保證精子質量。

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Effects of different Maca extracts on human sperm funtion

XIE Yi-xin1,CHEN Wen-qiu2,ZENG Ting1,LI Xiao-feng3,WU Hui3,*

(1.Center for Disease Control and Prevention in Guangzhou Military Region,Guangzhou 510507,China;2.The Sixth Affiliated Hospital of Sun Yatsen University,Guangzhou 510655,China;3.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Objective:To compare the effect of Maca extract in different process on human sperm function. Method:Sperm suspension was prepared by the method of non-continuous density gradient in 20 infertile men,Maca ingredients were extracted by alkali soluble and acid sinking method,static and dynamic adsorption-desorption method,aqueous and hydroalcoholic extracting method.The effect of different Maca extract was analyzed on human sperm function by computer-aided sperm analysis system. Result:Values of PR,PR-A and PR-B in experimental group was 33% higher than control group(p<0.05). Sperm motility was the best when the Maca extract concertration was 0.1 g/mL,the value of STR,LIN and WOB in experimental group was 15% higher than control group(p<0.05).Conclusion:Experiment showed that sperm motility could reach the peak,sperm quality was beterwhen Maca extract was at a suitable concentration.

Maca extract;human sperm;maca protein;maka alkaloid

2016-02-17

謝逸欣(1983-),女,碩士,主治醫師,研究方向:食品安全及天然產物開發,E-mail:easonxie2003@126.com。

*通訊作者:吳暉(1967-),男,教授,研究方向:食品安全及天然產物開發,E-mail:fehwu@scut.edu.cn。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000