核桃青皮中萘醌類色素的提取及穩定性研究

程 茹,嚴 成,何 微,唐周剛,唐蜀智

(1.西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010;2.鹽亭縣金土地農業發展有限公司,四川綿陽 621010)

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核桃青皮中萘醌類色素的提取及穩定性研究

程 茹,嚴 成,何 微,唐周剛,唐蜀智

(1.西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010;2.鹽亭縣金土地農業發展有限公司,四川綿陽 621010)

為提高核桃青皮中萘醌類色素的提取率,在酶添加量、超聲溫度、超聲時間、液料比4個單因素實驗的基礎上,采用響應面法優化酶輔助超聲波提取萘醌類色素的工藝條件,并研究了光照、溫度、氧化還原劑、金屬離子對色素穩定性的影響。結果表明:在酶添加量1.0%,超聲時間90 min,超聲溫度70 ℃,液料比72∶1(mL/g)的條件下核桃青皮萘醌類色素提取率最高,可達8.22%,與模型預測值相對誤差為0.13%。穩定性實驗結果表明,核桃青皮萘醌類色素0～7 d內具有良好的耐光、抗氧化還原和儲藏性,80 ℃內熱穩定性良好,Mg2+、Ca2+、Na+、K+對色素無明顯作用,Al3+、Zn2+、Fe3+對該色素具有一定的增色作用,其中Fe3+作用最明顯。超聲波結合酶法提取工藝簡單、高效、可行,提取的萘醌類色素具有較好的穩定性。

核桃青皮,萘醌類色素,超聲波提取,穩定性

近年來,我國核桃種植面積和產量均居世界第一,占全球總量的40%～45%左右[1-2],且面積以每年10%的速度增長[3]。青皮作為副產物,產量一般都高于核桃,萘醌類色素是青皮色素的主要成分,具有抗霉、抗菌、抗腫瘤活性[4-6],是一類潛在的天然染料[7],且其衍生物也可用于醫藥和化妝品[8-9]。

萘醌類色素常用提取方法有溶劑提取法、堿提酸沉法、水蒸氣蒸餾法,超聲波法等。含量測定方法有HPLC法和比色法。與其他提取方法相比,超聲波提取技術具有能耗低、不破壞有效成分、率效高等優點[10-11]。比色法較HPLC更加快速、簡便。辛國松[12]等采用比色法測定核桃青皮中的羥基萘醌含量,發現其含量隨著儲藏年限的延長而降低,第一年為0.0141%,第三年降至0.007%。侯棟[13]等建立的HPLC法測定新鮮核桃青皮中5-羥基-1,4-萘醌的含量為1.66 mg/g。徐敏慧[14]等用微波輔助法提取核桃青皮中的5-羥基-1,4-萘醌,用正交實驗法優化得最高含量為1.71 mg/g。以上研究所得核桃青皮萘醌含量間存在不同差異,且均偏低,主要原因除了原料差異外,作者均未能采用優于正交實驗法的響應曲面法對提取工藝進行充分優化,且提取方法單一,未能與酶法結合,故導致所得含量偏低,同時也未對萘醌色素的穩定性做進一步研究。而國外對核桃青皮中萘醌類色素的提取及穩定性的相關研究鮮有報道。目前,核桃青皮因未得到合理開發利用而被大量丟棄,造成巨大的資源浪費和環境污染[15-16]。因此,對核桃青皮中萘醌類色素性質進行研究將對綜合利用核桃青皮資源具有較大的社會效益、生態效益和和經濟效益。

本文擬通過纖維素酶輔助超聲波提取核桃青皮中的萘醌類色素,通過前期文獻調研以及結合系列定性實驗證明本實驗采用的核桃青皮含萘醌類色素,并根據其在堿液中發生顏色改變這一特性,采用比色法測定其提取率,響應面法進一步優化提取工藝,并對其穩定性進行研究,旨在為核桃青皮資源的綜合利用提供理論依據和簡單易行的萘醌色素提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“棉核1號”核桃青皮 鹽亭縣金土地農林發展有限公司;核桃醌標準品(質量分數為97%)、纖維素酶(30U/mg)美國sigma公司;無水乙醇、氫氧化鉀、雙氧水、亞硫酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鐵、氯化鈉、氯化劑、氯化鎂、硫酸鋁、硫酸鋅等 均為國產分析純。

UV-3150型紫外/可見分光光度計 日本島津;KH3200E型超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制及吸收波長的確定 參照文獻[12,17]并做相應修改。精確稱取經105 ℃干燥至恒重的核桃醌標準品5.0 mg,60%乙醇定容至10 mL,搖勻,得標準品儲備液。

準確移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標準品儲備液于25 mL比色管中,移取1 mL 5% KOH顯色,加60%乙醇溶液定容至刻度;移取5% KOH置于25 mL比色管中,加60%乙醇至刻度,作為空白對照,在200～800 nm波長范圍進行光譜掃描,選擇檢測波長為530 nm,讀取不同濃度標準品在檢測波長處的吸光值;最后繪制吸光值(A)與核桃醌質量濃度(ρ)的標準曲線,得回歸方程Y=5X+0.0466(R2=0.9991)。

1.2.2 核桃青皮萘醌類色素的提取 參照高曉霞等[17-19]的方法,稱取1.0 g核桃青皮粉,按一定液料比加入60%乙醇和一定量的纖維素酶,在一定溫度和時間下酶解,滅酶,離心抽濾,濾液定容至60 mL,取2 mL樣品液至25 mL比色管中,與對照品溶液同法顯色,530 nm處測吸光值。萘醌類色素質量濃度根據回歸曲線方程計算,萘醌類色素提取率根據以下公式計算[20]:

式中:ρ是測定用液中萘醌類色素的質量濃度(g/L);V0是樣品提取液定容總體積(L);V1是量取提取液樣品測定定容的體積(L);V2為測定用樣液體積(L);m青皮粉的質量(g)。

1.2.3 單因素實驗 分別以酶添加量(0、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6%)、超聲提取時間(60、90、120、150、180min)、超聲提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、液料比(40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1(mL/g))進行單因素實驗,在固定單因素條件為酶添加量為1.2%、超聲時間為120min、超聲溫度為 60 ℃的條件下分別考察各因素對萘醌類色素提取率的影響。

1.2.4 提取工藝響應面實驗優化 以核桃青皮中萘醌類色素提取率為指標,在單因素實驗基礎上,建立4因素3水平Box-Behnken中心組合實驗,因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表

1.2.5 核桃青皮中萘醌類色素穩定性實驗

1.2.5.1 溫度對核桃青皮中萘醌類色素穩定性的影響 將青皮色素提取液分別在室溫、40、60、80、100 ℃條件先密封保溫,每隔1 h,測定吸光值。

1.2.5.2 光照對核桃青皮中萘醌類色素穩定性的影響 將青皮色素提取液分別在自然光、紫外光、三基色光、避光條件下密封觀察7 d,每天定時測定吸光值。

1.2.5.3 氧化劑和還原劑對核桃青皮中萘醌類色素穩定性的影響 分別配制質量分數為0.5、1、2、3、4、5、6%亞硫酸鈉的色素提取液和體積分數為0.5、1、2、3、4、5、6%的雙氧水的色素提取液,以不加亞硫酸鈉和雙氧水的色素提取液做參比,分別在避光、自然光條件下觀察7 d,每天定時測定吸光值。

1.2.5.4 金屬離子對核桃青皮中萘醌類色素穩定性的影響 分別配制含有摩爾濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe3+的色素提取液,以相應濃度的各種離子的水溶液做空白,以不加金屬離子的樣品提取液做對照,觀察7 d,每天定時測定吸光值[17,21]。

1.2.6 數據分析 每個樣品設3個平行,應用統計軟件SPSS 13.0、Origin8.5、Design-Expert 8.0.6.1進行數據處理和分析,最小二乘法進行統計分析,模型為:Y=β0+βiXi+βiiXii+βijXiXj,其中β0,βi,βii,βij為回歸系數;Xi,Xj為自變量;Y為響應變量。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇

將標準品溶液用紫外-可見分光光度計在200～800 nm波長范圍內進行掃描,得可見光區最大吸收波長為530 nm(圖1),故選530 nm為測定核桃青皮中萘醌類色素吸光值的檢測波長。

圖1 核桃醌標準品儲備液最大吸收波長掃描圖Fig.1 Absorption spectrum of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 纖維素酶添加量對核桃青皮萘醌類色素提取率的影響 由圖2可知,在固定時間60 min,溫度60 ℃,液料比60∶1的條件下,酶添加量在1.2%以內,核桃青皮中萘醌類色素提取率隨著酶添加量的增加而大幅度增加,當酶添加量超過1.2%后,核桃青皮中萘醌類色素提取率隨著酶添加量的增加而趨于平緩,說明酶解程度已趨于完全,故選酶添加量1.2%。同時,由圖可知,酶添加量為0、1.2%時,核桃青皮中萘醌類色素提取率分別為3.21%、4.54%,即纖維素酶的添加至少將核桃青皮中萘醌類色素提取率提高了1.32個百分點,說明纖維素酶在60%乙醇溶劑中可保持有效活性,可用于提高核桃青皮中萘醌類色素的提取率。

圖2 纖維素酶添加量對核桃青皮萘醌類色素提取率的影響Fig.2 Effect of cellulase dosage on extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.2.2 超聲時間對核桃青皮萘醌類色素提取率的影響 在固定酶添加量1.2%,溫度60 ℃,液料比60∶1的條件下,由圖3可知,120 min的提取時間內,隨著酶解時間的延長,核桃青皮中萘醌類色素提取率呈快速上升趨勢。120 min以后,隨提取時間的延長,核桃青皮中萘醌類色素提取率增加緩慢,主要是因為酶的作用充分。綜合考慮經濟效益,故選120 min酶解時間為宜。

灰色系統理論的基本思想是：客觀系統是有整體功能的，無論其現象多么復雜，數據多么亂，必然蘊涵某種內在規律。可見，灰色系統理論是一種從數據中挖掘數據規律的理論體系。式(1)揭示了輸電線路的覆冰規律，通過對式(1)未知參數的預測，可以預測未來輸電線路覆冰增長規律。

圖3 超聲時間對核桃青皮萘醌類色素提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.2.3 超聲溫度對核桃青皮萘醌類色素提取率的影響 在固定酶添加量1.2%,時間120 min,液料比60∶1的條件下,由圖4可知,隨著溫度的升高,核桃青皮中萘醌類色素提取率呈先上升后下降的趨勢,30～40 ℃,核桃青皮中萘醌類色素提取率變化不明顯,可能是因為溫度過低,酶的活性較低,40 ℃以后核桃青皮中萘醌類色素提取率快速上升,60 ℃時達到峰值為7.93%。繼續升高溫度,萘醌類色素提取率開始下降,說明當溫度升高到一程度時,酶蛋白開始變性,使酶的活性降低,從而降低了萘醌類色素的提取率[22]。因此擬確定最佳酶解溫度應約為60 ℃。

圖4 超聲溫度對核桃青皮萘醌類色素提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.2.4 液料比對核桃青皮萘醌類色素提取率的影響 由圖5可知,在固定酶添加量1.2%,時間120 min,溫度60 ℃的條件下,當液料比在70∶1以內時,隨著液料比的增加核桃青皮中萘醌類色素提取率增加較快,主要是因為隨著溶劑中溶質濃度差的增大[23],萘醌類色素的溶解量也在增大,當液料比達70∶1以后,核桃青皮中萘醌類色素提取率快速下降,主要是因為溶液濃度增大,稀釋了酶底物的濃度,故選70∶1為最佳液料比。

圖5 液料比對核桃青皮萘醌類色素提取率的影響Fig.5 Effect of liquid/solid ratio on extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.3 響應面實驗結果及數據分析

2.3.1 響應面實驗方案設計及結果 具體結果見表2。

表2 響應面實驗設計與結果

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析對各因素進行回歸擬合得回歸方程為:Y=7.65+0.004A+0.038B+0.57C+0.14D+0.28AB+0.00725AC+0.012AD-0.17BC-0.085BD-0.13CD-0.085A2-0.19B2-0.12C2-0.19D2。

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件分析得最佳工藝條件為:酶添加量1.01%,超聲時間90 min,超聲溫度70 ℃,液料比72.08∶1(mL/g),此條件下,核桃青皮萘醌類色素提取率為8.23%。修正實驗條件為:酶添加量為1.0%,超聲時間為90 min,超聲溫度為70 ℃,液料比為72∶1(mL/g),驗證實驗得核桃青皮中萘醌類色素提取率為8.22%,與理論預測值相比,其相對誤差為0.13%,說明該模型能較好的預測實際提取率。

表3 回歸模型及差分析

圖6 兩因素的交互作用對核桃青皮中萘醌類色素提取率的響應面圖Fig.6 Response surface plots of variable parameters on the extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

注:**p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。2.4 穩定性實驗結果

2.4.1 溫度對核桃青皮中萘醌類色素穩定性的影響 由圖7可知,在室溫、40、60、80、100 ℃保溫5 h的過濾后的樣品液,在80 ℃范圍內的吸光度隨著保溫時間的延長,吸光值均在0～0.02范圍內波動,變化不大,而在100 ℃條件下,隨著保溫時間的延長,吸光值逐漸升高,在保溫4 h時穩定到0.46,比0 h時增大了0.08,可能是因為溫度過高,色素被氧化導致吸光值升高。故該色素在80 ℃范圍內熱穩定性良好。

圖9 不同光照條件下不同劑量的氧化劑和還原劑對萘醌類色素穩定性的影響Fig.9 Effect of different addition amount of oxidation and reducation under the different illuminations on the stability of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

圖7 溫度對核桃青皮萘醌類色素穩定性的影響Fig.7 Effect of temperature on the stability of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.4.2 光照對核桃青皮中萘醌類色素穩定性的影響 由圖8可知,不同光照下樣品液隨著放置時間的延長,吸光值均略有下降,整體在0～0.05范圍內波動,說明不同光源對色素穩定性影響較小,其中紫外光照射下吸光值下降相對較快,是因為紫外光中臭氧的強氧化作用對萘醌類色素的穩定性產生了一定的破壞[27],故應盡量避免紫外光照射。

圖8 光照對核桃青皮萘醌類色素穩定性的影響Fig.8 Effect of illuminations on the stability of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.4.3 氧化劑和還原劑對核桃青皮中萘醌類色素穩定性的影響 由圖9可知,對照組在不同光源下0～7 d內吸光值基本無波動,此結果與2.4.1和2.4.2中結果一致。與對照組相比,樣品組加入不同量的雙氧水和亞硫酸鈉后,吸光值在0～7 d內基本穩定,在0～0.05范圍內波動,總體和對照組值接近,說明常溫密封狀態下色素提取液在不同光照、時間、氧化劑和還原劑作用下比較穩定,在氧化劑或者還原劑及光照協同作用下不易被氧化或者還原。

2.4.4 金屬離子對核桃青皮中萘醌類色素穩定性的影響 由圖10可知,Fe3+、Zn2+、Al3+對吸光值具有促進作用,其中Fe3+作用最明顯,且隨著離子濃度的增加而增加,總體吸光值絕對值均在0～0.03范圍內逐漸增加,Mg2+、Ca2+、Na+、K+對吸光值無明顯作用,可能因為Al3+、Zn2+和Fe3+與色素中含α-OH或鄰二酚OH結構的物質結合成有色絡合物而起到增色的作用。

圖10 金屬離子對核桃青皮萘醌類色素的影響Fig.10 Effect of metal ions on the stability of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husk

3 結論

采用響應面法對核桃青皮萘醌類色素的提取條件進行優化,建立了萘醌類色素提取率的回歸模型,得出酶法輔助超聲提取核桃青皮萘醌類色素的最佳組合為:酶添加量1.0%,超聲時間90 min,超聲溫度70 ℃,液料比72∶1,核桃青皮中萘醌類色素提取率達8.22%,與模型預測值8.23%接近,進一步驗證了該模型的可靠性,各因素對核桃青皮萘醌類色素提取率影響顯著性順序依次為超聲溫度>液料比>超聲時間>酶添加量;穩定性研究結果表明,核桃青皮萘醌類色素在0～7 d內具有較好的耐光、抗氧化還原、貯藏性,80 ℃范圍內熱穩定性良好,Mg2+、Ca2+、Na+、K+對色素無明顯作用,Al3+、Zn2+、Fe3+對該色素具有一定的增色作用,其中Fe3+作用最明顯。綜上,響應面法優化酶法輔助超聲波提取核桃青皮萘醌類色素的工藝簡單,可行,所提取的萘醌類色素具有良好的穩定性。

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Extraction and stabilities of naphthoquinones pigments from walnut green husks

CHENG Ru1,YAN Cheng1,*,HE Wei1,TANG Zhou-gang2,TANG Shu-zhi2

(1.College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China;2.Yanting Golden Land of Agriculture and Forestry Development Co.,Ltd,Mianyang 621010,China)

The enzymatic-assisted ultrasound-extraction of naphthoquinones pigments from walnut green husks was optimized using response surface methodology. The effects of several operating parameters,namely enzyme dosage,ultrasonic time,ultrasonic temperature,liquid/solid ratio,on the yield of naphthoquinones pigments from walnut green husks were studied. The effects of illuminations,temperature,oxidants,reducing agent,metal ions on the pigments stabilities were also studied. Results indicated that the highest yield of naphthoquinones pigments of 8.22% was achieved when the extraction was carried out with enzyme added amount of 1.0%,ultrasonic time for 90 min,ultrasonic temperature of 70 ℃,ratio of liquid-solid 72∶1(mL/g),which was 0.13% of relative error compared with the predicted value. Stabilities tests showed that naphthoquinones pigments from walnut green husks had better lightfastness,anti-oxidation-reduction,storage tolerance in the range of 0～7 days and thermotolerance in the range of 80 ℃. Metal ions Al3+、Zn2+、Fe3+had a certain hyperchromic effect for pigments,and Fe3+’shyperchromic effect was the most significant. There was no effect of Mg2+、Ca2+、Na+、K+on the pigments. The ultrasonic bonding enzymatic extraction technology was simple,viable,and the extracted pigments had better stability.

walnut green husk;naphthoquinones pigments;ultrasonic extraction;stability

2016-05-04

程茹(1990-),女,在讀碩士研究生,研究方向:食品化學工程,E-mail:cr20103257@163.com。

*通訊作者:嚴成(1963-),男,碩士,教授,研究方向:食品化學與功能性食品,E-mail:ycx824511@163.com。

四川省科技創新苗子工程資助項目(2016088)。

TS209

B

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000